本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及抗als抑制剂类除草剂反枝苋的检测方法及试剂盒。
背景技术：
乙酰乳酸合成酶(acetolactatesynthase，简称als，ec2.2.1.6)，存在于植物、真菌、细菌以及藻类等生物体内。它是合成支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)的关键酶。而支链氨基酸是合成蛋白质必不可少的原料。als抑制剂类除草剂是以als酶为靶标的除草剂。杂草受药后，als酶的活性被抑制，支链氨基酸合成被阻，dna合成被破坏，最终导致植株死亡。als抑制剂类除草剂因除草活性高、对非靶标生物安全等优点而得到了广泛的应用。自1982年美国杜邦公司注册登记首例als抑制剂类除草剂氯磺隆以来，全球现已开发als抑制剂类除草剂50余种。在我国，广泛用于大豆田杂草防除的als抑制剂类除草剂主要有：咪唑乙烟酸(imazethapyr)、氯嘧磺隆(chlorimuron-ethyl)、噻吩磺隆(thifensulfuron-methyl)、甲氧咪草烟(imazamox)、灭草喹(imazaquin)、灭草烟(imazapyr)、氯酯磺草胺(cloransulam-methyl)、唑嘧磺草胺(flumetsulam)等。
由于als抑制剂类除草剂作用位点单一，长期连续使用会引发抗药性。近几年来，黑龙江省部分地区的农民反映咪唑乙烟酸等als抑制剂类除草剂对反枝苋防治效果不明显，田间剂量已无法有效将其杀死，并且发现有些大豆田的反枝苋对噻吩磺隆等als抑制剂类除草剂也产生了交互抗性。由于对抗药性杂草认知不足，农民盲目加大药剂使用量，既增加用药成本，又加大药害风险，并且会导致更多抗性杂草的出现与发展，严重影响我国当前农药减量使用，影响粮食增产，农民增收和国家粮食安全。因此，开发一种快速、简便易操作的抗药性杂草检测方法十分迫切。
传统的抗药性杂草检测方法通常采集田间疑似抗性杂草的种子，播种在培养盆中，培养一定叶龄后喷施不同剂量的除草剂，继续培养一段时间后，剪取地上部分称鲜重或烘干称干重计算抑制中浓度和抗药性指数。此方法直观性强，能客观评价杂草抗性水平。但也有局限性，主要表现在：一是工作量大，检测周期长；二是不能从微观分子角度解释其抗性机制，指导科学用药。随着分子生物学技术在杂草抗药性机制方面的应用与发展，越来越多的抗药性杂草被发现，抗药性机制被明确。研究表明：反枝苋对als抑制剂类除草剂的抗性机制是由于靶标als基因一个或多个核苷酸发生改变，导致氨基酸变化，进而引起als抑制剂不能有效与als酶相结合，抗药性由此发生。因此，反枝苋是否产生抗药性可以通过分子生物学手段测定靶标als基因保守区的突变位点来确定。
技术实现要素：
本发明的目的是提供抗als抑制剂类除草剂反枝苋的检测方法及检测试剂盒。
为了实现本发明的目的，本发明首先提供一对特异性引物，对不同农田采集的对als抑制剂有不同抗性的反枝苋进行pcr扩增后测序，通过对反枝苋的dna序列进行筛查比对，找到引起als抑制剂有抗性的突变位点。
具体地，本发明提供的用于检测抗als抑制剂类除草剂反枝苋的特异性引物对，其核苷酸序列如seqidno.1-2所示。
本发明提供了含有所述特异性引物对的试剂盒。
本发明提供了上述特异性引物对或所述的试剂盒在鉴定抗als抑制剂类除草剂反枝苋中的应用。
本发明提供了上述特异性引物对或所述的试剂盒在指导农田除草用药中的应用。
进一步地，本发明提供了抗als抑制剂类除草剂反枝苋的检测方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样品基因组dna，以其为模板，利用权利要求1所述特异性引物对进行pcr；
(2)对扩增产物进行测序，检测相应氨基酸位点的氨基酸。
上述方法中，步骤(1)中pcr扩增反应使用的扩增体系，当体系30μl时配制如下：上下游引物各1μl，浓度10pmol/l；taqdna聚合酶1u，15mm的mg2+1μl；dna模板2μl，2.5mm的dntps1μl，双蒸水补至30μl。
步骤(1)中pcr扩增反应条件为95℃预变性4min，95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min，循环30次，72℃延伸10min，4℃保存。
上述方法中，步骤(2)对扩增产物的氨基酸序列进行比对，若扩增产物在122位由丙氨酸突变为苏氨酸、或在197位由脯氨酸突变为组氨酸，或在205位由丙氨酸突变为缬氨酸、或在376位由天冬氨酸突变为谷氨酸，或在574位由色氨酸突变为亮氨酸，或在653位由丝氨酸突变为天冬酰胺，或在654位由丝氨酸突变为酪氨酸，则待测样品为抗als抑制剂类除草剂反枝苋。
本发明提供了用于鉴定抗als抑制剂类除草剂反枝苋的分子标记，其可通过seqidno.1-2所示的引物pcr扩增得到。
进一步的，所述分子标记，是seqidno.1-2所示的引物pcr扩增后，若扩增产物在122位由丙氨酸突变为苏氨酸、或在197位由脯氨酸突变为组氨酸，或在205位由丙氨酸突变为缬氨酸、或在376位由天冬氨酸突变为谷氨酸，或在574位由色氨酸突变为亮氨酸，或在653位由丝氨酸突变为天冬酰胺，或在654位由丝氨酸突变为酪氨酸，则待测样品为抗als抑制剂类除草剂反枝苋。
本发明具有如下优点：(1)本发明所提供的引物对特异性好。(2)本发明的分子标记可进行准确地鉴定，显著鉴别als抑制剂抗性反枝苋。(3)本发明检测方法操作简便，速度快、成本低、准确度高。
附图说明
图1为针对能够涵盖8个突变位点的目的片段设计了4对引物的扩增效果图。第2泳道为本发明引物扩增条带；1泳道为引物als-1f和als-1r、3-4泳道分别为引物als-2f/2r和als-3f/3r扩增效果。
图2为反枝苋als基因pcr灵敏度试验，m为dnamarker
dl2000；1-5为不同模板量0-4μl。
图3为不同反枝苋种群als基因pcr扩增结果；m为dnamarkerdl2000；1-9为不同反枝苋种群als基因pcr扩增结果。
图4的a图为敏感反枝苋种群(13-4)als第122位测序结果；图4的b图为抗性反枝苋种群(15-1)als第122位测序结果。
图5的a图为敏感反枝苋种群(13-4)als第574位测序结果；图5的b图为抗性反枝苋种群(15-1)als第574位测序结果。
图6的a图为敏感反枝苋种群(13-4)als第653位测序结果；图6的b图为抗性反枝苋种群(5-1)als第653位测序结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。
实施例1抗als抑制剂类除草剂反枝苋检测方法的建立
1、反枝苋基因组dna的提取
取反枝苋叶片100mg，液氮充分研磨，ctab法提取反枝苋基因组dna，dna浓度需大于2ng/μl。
2、引物设计与合成
根据genbank中登记的反枝苋als基因序列(登记号af363369)，利用软件oligo7设计了1对特异性引物(目的片段1914bp)。特异性引物包括了目前已报道确认与als抑制剂类除草剂抗性相关的8个突变位点(ala122、pro197、ala205、asp376、arg377、trp574、ser653、gly654)。由于扩增长度需涵盖8个突变位点，在引物设计过程中，发明人针对同一目标序列做了大量的探索，设计了多对引物序列，比较结果后，最终选取引物对als-f和als-r作为本发明确定的用于检测抗als抑制剂类除草剂反枝苋的特异性引物对。引物筛选实验见图1，泳道2为本发明的引物对，泳道1,3,4分别为针对相同目标序列设计的其他引物对。电泳检测验证结果显示泳道1的引物扩增结果特异性强，扩增效率高。引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。用于检测反枝苋als基因突变位点的特异性引物序列如下：
正向引物als-f：5’-ccacttcttcttcttcaatcc-3’(seqidno.1)
反向引物als-r：5’-gatctccaaccaactaataagc-3’(seqidno.2)
引物筛选实验所用的其他三对引物序列如下：
als-1f：5’-cttcaacaatggcgtccac-3’
als-1r：5’-ttgcagcccttaaatcgctca-3’
als-2f：5’-tctcaccgatgataaaccctc-3’
als-2r：5’-ataagcccttcttccatcacc-3’
als-3f：5’-tcatccatttacgctatccct-3’
als-3r：5’-taagcccttcttccatcacc-3’
3、用于检测反枝苋als突变位点的pcr反应体系
pcr反应体系，其中10×pcr反应缓冲液3μl，dntps(2.5mm)1μl，正反向引物各1μl，taqdna聚合酶1u，模板dna2μl，双蒸水补足至30μl。
4、用于扩增反枝苋als基因的反应程序
用于反应条件为95℃预变性4min，95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min，循环30次，72℃延伸10min，4℃保存。
5、pcr反应灵敏度试验
将反枝苋基因组dna稀释为2ng/μl后，分别吸取0、0.5、1、2和4μl反枝苋基因组dna作为模板，进行pcr反应，检测pcr反应的灵敏度，如图2所示，当模板为2μl时，pcr产物条带清晰。通过计算得出用于检测的反枝苋基因组dna的量应不少于4ng。
6、pcr产物鉴定与测序
pcr扩增产物经1％的琼脂糖凝胶检测后送北京擎科新业生物技术有限公司测序。抗性和敏感反枝苋种群als基因测序后进行序列比对分析，寻找als突变位点。
实施例2本发明检测方法的应用
采集疑似发生抗性反枝苋样品，约取200mg反枝苋叶片迅速加入液氮研磨，采用ctab法提取基因组dna，dna浓度需大于2ng/μl。试验方法参见实施例1。检测引物对扩增反枝苋als基因的特异性显示此引物具有很好的特异性，扩增als基因片段约为2000bp(图3)，利用此引物扩增抗性和敏感反枝苋als基因，对pcr产物分别进行测序，通过比对找突变位点(图4～6)。
对黑龙江、内蒙古的不同农田采集的反枝苋样品20个，按照本发明的检测方法进行检测，结果显示，有5个样品的als在122位发生突变，由丙氨酸(ala)突变为苏氨酸(thr)(表1，图4的b)，有9个样品的als在574位发生突变，由色氨酸(typ)突变为亮氨酸(leu)(表1，图5的b)，有4个样品的als在653位发生了突变，由丝氨酸突变为天冬酰胺(表1，图6的b)。
由此可见，本发明实施例1建立的检测方法可以快速、准确的检测田间疑似抗性的反枝苋als突变位点和氨基酸突变种类，可以指导是否可以继续使用als抑制剂类除草剂来防除抗性反枝苋。
表1.pcr法检测不同地区反枝苋als突变位点
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>中国农业科学院植物保护研究所
<120>抗als抑制剂类除草剂反枝苋的检测方法及试剂盒
<130>khp181110639.0
<160>8
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
ccacttcttcttcttcaatcc21
<210>2
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
gatctccaaccaactaataagc22
<210>3
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
cttcaacaatggcgtccac19
<210>4
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
ttgcagcccttaaatcgctca21
<210>5
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
tctcaccgatgataaaccctc21
<210>6
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
ataagcccttcttccatcacc21
<210>7
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
tcatccatttacgctatccct21
<210>8
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>8
taagcccttcttccatcacc20