本发明涉及一种牡丹皮炭新天然产物在制备抗凝血药物中的用途。
背景技术：
中药牡丹皮为毛茛科植物牡丹paeoniasurulicosaandr.的干燥根皮，始载于《神农本草经》，列为中品，历代本草皆有记载。其性味苦、辛，微寒。归心、肝、肾经，有清热凉血、活血化瘀的功效，用于热入营血、吐血、无汗骨蒸、跌扑伤痛、痈肿疮毒。牡丹皮炭是牡丹皮以武火炒至焦黑色，存性为度的炮制品，具有凉血止血的作用，常用于血热出血，如治吐血、衄血等的十灰散(《十药》)等。现代药理学研究显示，丹皮炭能缩短大鼠aptt、prt、tt和pt，认为丹皮炭及其止血活性部位能够发挥止血和凝血作用的机理可能是通过激活内源性以及外源性的多种凝血因子而起作用的。丹皮炭及其止血活性部位能够提高由adp和胶原诱发导导的大鼠血小板的聚集率以及血浆中血栓素b2的数量，同时还能降低血浆中6-酮-前列腺素f1α的数量。但关于牡丹皮炭药效物质基础不清楚，故对牡丹皮炭进行系统的化学分离。
炭药是中医临床传统用药，炒炭存性，炒炭止血为炭药经典理论，炒炭后一方面产生或增加止血作用，另一方面还保留药物原有药性，从牡丹皮炭中分离到一个新的天然产物-化合物1，具有较好的抗凝血作用，未见本发明化合物1抗凝血作用的报道。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供了式1所示化合物在制备抗凝血药物中的用途
进一步地，所述式1化合物按照下述方法制备而成：
(1)取牡丹皮炭，乙醇提取，得乙醇浸膏；
(2)将乙醇浸膏用水溶解后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取，得石油醚浸膏；
(3)取石油醚浸膏，用硅胶柱层析，依次以石油醚-乙酸乙酯＝100:1、50:1、25:1、10:1、5:1、2:1、1:1(v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，根据薄层追踪，合并含有相似组分的洗脱液，得8个组分fr1-8；
(4)取含有式1化合物的组分fr3，用mci柱层析，依次用甲醇：水＝50:50、75:25、100:1(v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，根据薄层追踪，合并含有相似组分的洗脱液，得到7个馏份fr3a-fr3g；
(5)取含有式1化合物的组分fr3b，分离纯化后，即得式1化合物。
进一步地，所述药物是抑制凝血因子ⅷ和/或凝血因子ⅸ和/或凝血因子ⅺ和/或凝血因子ⅻ活性的药物。
进一步地，所述药物是抑制纤维蛋白的形成的药物。
进一步地，所述药物是以式1所示化合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
本发明还提供了一种抗凝血药物，它是以式1所示化合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
进一步地，所述药物是抑制凝血因子ⅷ和/或凝血因子ⅸ和/或凝血因子ⅺ和/或凝血因子ⅻ活性的药物。
进一步地，所述药物是抑制纤维蛋白的形成的药物。
进一步地，所述制剂为口服制剂或注射制剂。
实验结果表明，式1所示化合物能通过影响内源性凝血系统以及血浆中凝血因子ⅷ、ⅸ、ⅺ、ⅻ的活性产生抗凝血作用，同时也能抑制凝血酶介导的纤维蛋白的形成，具有较好的抗凝血作用。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1、本发明化合物抗凝血作用实验
1主要材料
1)主要试剂与仪器
活化部分凝血活酶时间(aptt)检测试剂盒(批号：557216a)、纤维蛋白原含量(fib)检测试剂盒(批号：46144)和凝血酶时间(tt)(批号：46582)检测试剂盒，均购自希森美康医用电子有限公司。
ca-1500全自动凝血仪(sysmex)；tgl-24mc台式高速冷冻离心机(杭州硕联仪器有限公司)。
2)受试药物
化合物1，可采用现有方法制备，也可由以下方法制备：
将牡丹皮炭干燥药材35kg，分2次投进微型多功能提取罐中，分别倒入8倍量的95％乙醇，真空低温(60℃)回流提取三次，提取时间分别为4h、3h、3h。将得到的总提取液进行减压浓缩并挥干至无醇味，即得到牡丹皮炭95％乙醇提取总浸膏(1kg)。
往上述95％乙醇提取总浸膏中加入1l蒸馏水并搅拌至均匀，制成总浸膏混悬液。然后依次用石油醚(bq60～90℃)、乙酸乙酯、正丁醇(各2l)对总浸膏混悬液进行3～5次的萃取，合并相同溶剂的萃取液并分别进行减压浓缩，得到石油醚部位浸膏(154g)、乙酸乙酯部位浸膏(270g)、正丁醇部位浸膏(178g)、水溶性部位浸膏(85g)。
将石油醚萃取物用硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱(100:1、50:1、25:1、10:1、5:1、2:1、1:1)，每个梯度2倍柱体积，洗脱过程中采用薄层定性检查，以5％磷钼酸与碘蒸气进行显色，合并含有相同成分的洗脱液并减压浓缩，得8个组分，fr1-8。
将上述fr3流份再用mci柱层析，依次以甲醇：水＝50:50、75:25、100:1(v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，每个梯度2倍柱体积，洗脱过程中采用薄层定性检查，以5％磷钼酸与碘蒸气进行显色，合并含有相同成分的洗脱液并减压浓缩，得到7个馏份(fr3a-fr3g)。
将上述馏份fr3b再用sephadexlh-20柱层析(纯甲醇洗脱)，利用薄层色谱定性检识，以5％磷钼酸与碘蒸气进行显色，合并显示一个斑点的流分，挥干溶剂，得浅黄色针状结晶，即为结构式如式1化合物(48.6mg)，其结构如下：
3)受试动物
新西兰大耳白兔(南方医科大学实验动物中心，许可证号:scxk(yue)2016-0041)。
2实验方法
(1)血浆样品的制备
用10.0％的水合氯醛(5g水合氯醛加入到50ml蒸馏水中；腹腔注射，0.3ml/100g)麻醉新西兰大耳白兔，心脏采血，以3.8％枸橼酸钠(血与抗凝剂体积比为9:1)抗凝(取血时要注意防止气泡形成，以免影响血小板功能的测定)，收集于真空采血管中(血凝管)，缓慢颠倒混匀3-4次，然后离心(3500r/min，15min)，吸取上清液。分别加入各浓度的化合物甲醇溶液(0.0116g/ml、0.0058g/ml、0.0029g/ml)，甲醇为阴性对照组，按各指标试剂盒的要求进行凝血指标活化部分凝血活酶时间(aptt)、纤维蛋白原含量(fib)和凝血酶时间(tt)的测定,每个样品均测量三次，取平均值。
(2)统计学处理
根据化合物的凝血指标aptt、fib、tt，采用“均数±标准差”(χ2±s)表示，用spss21.0统计软件处理，各组间进行单因素方差分析(成组比较t检验及方差分析)，取α＝0.05为检验水准，综合评价化合物的凝血作用。
3实验结果
表化合物1对体外凝血活性的影响(均值+标准差)
注：*p<0.05，**p<0.01
从上表可以看出，不同浓度的化合物对凝血酶原时间pt、活化部分凝血活酶时间aptt、fbg纤维蛋白原含量、凝血酶原时间tt的影响作用不同。随着化合物浓度的增加，pt与aptt逐渐增大，tt先增大后减小再增大。与空白组比较，高剂量组的pt、aptt、tt升高，fbg下降，且与空白组比较有显著性的差异。说明本发明化合物能通过影响内源性凝血系统以及激活血浆中凝血因子ⅷ、ⅸ、ⅺ、ⅻ的活性，抑制凝血酶介导的纤维蛋白的形成来发挥抗凝血功效。因此不同浓度的化合物是作用于凝血过程中的多条途径，且浓度变化对每条途径的作用不完全一致，整体上可以表现出抗凝血作用。