本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种t系肿瘤噬菌体抗体库的构建方法及筛选的单克隆抗体。
背景技术：
t细胞肿瘤(tcellmalignances)是一类起源于单个t淋巴前体细胞的恶性肿瘤，具有独特的组织病理和临床特征，占所有淋巴系统恶性肿瘤的25％，包括t淋巴细胞白血病/淋巴瘤。相对b细胞白血病/淋巴瘤，它们更具侵袭性，对于传统的化疗不太敏感。目前，治疗t细胞白血病/淋巴瘤的主要方法是化疗、异基因造血干细胞移植(allogeneichematopoieticstemcelltransplantation，allo-hct)，其它方法有靶向治疗、放疗、免疫治疗。放化疗、造血干细胞移植(hematopoieticstemcelltransplantation，hct)后白血病复发的主要原因之一是t细胞白血病/淋巴瘤细胞发生新的染色体及基因突变。因为放化疗是重要的诱变剂，所以不良反应较小的免疫治疗、靶向治疗等越来越受到关注。合适的靶点意味着靶向治疗药物或生物治疗性t识别肿瘤性t细胞的同时不自我攻击，有人提出用car-nk治疗，但在没有肿瘤特异性靶点的情况下，t细胞减少症将会引起可预见的严重毒副反应。现在的商业化抗体库因为是非疾病特异性的，所以很难筛查到针对该病种特有的抗体，使治疗方式受限，建立一个t细胞肿瘤特异的噬菌体抗体库则有可能解决该问题。
噬菌体展示(phagedisplay)最早是由george开始于1985年。最先构建的噬菌体多肽或抗体展示文库则始于1990年。由此,噬菌体展示技术进入了一个飞速发展的时期。噬菌体展示的基本概念是将外源蛋白质或多肽的基因表达产物与噬菌体衣壳蛋白融合,并在其表面展示,同时将其遗传密码信息整合到个体噬菌体的基因组中。这个技术的最大优点是直接将可现的表达型与其基因型联系在一起,再利用其配体的特异性亲和力,将所感兴趣的蛋白质或多肽挑选出来。由此建立的噬菌体文库的滴度可达到106-1012。10年来,噬菌体展示技术被用于抗体的制备、多肽及蛋白质和酶的制备。特别是近几年来,该技术被作为一种新工具用于多肽和蛋白质药物的发现与研制、蛋白质-蛋白质的相互作用及蛋白质-dna相互作用的研究、蛋白质结构和功能的研究以及基因治疗药物的定向传递等多方面的研究。
tcr的多样性产生与tcr基因的遗传学特点和重排阶段的特殊过程有关，胚系中未重排的dna有大量的v基因片段和一定数量的d、j基因片段，其随机组合可以产生识别不同抗原表位tcr。tcr最大量的多样性的产生主要来自于连接时，在v-(d)-j连接区之间核苷酸的插入和删除。v-(d)-j的连接区即为cdr3区域，是特异性识别抗原的区域，不同的t细胞克隆具有不同序列或者不同长度的tcrcdr3基因，从而决定其特异性。传统的tcrcdr3受体库测序的方法远不能满足免疫组库庞大多样性的检测要求，新一代的测序技术能够实现单次测定几十万到几百万条序列的通量，为免疫组库全面、系统的研究提供了高效的技术平台，使得tcrcdr3区域深度测序用于准确评估患者免疫状态成为可能。来自健康志愿者的tcr具有丰富多样性，肿瘤患者tcr多样性呈寡克隆分布，在对t系肿瘤的研究中，我们也发现，此类患者免疫组库多样性方面存在明显的缺陷，多呈寡克隆状态。而且，在t系肿瘤患者中可以看到某一个克隆的显著性增高，与临床上相关信息如流式细胞数或骨髓细胞形态学等所描述的恶性肿瘤细胞相对应，例如流式或骨髓细胞形态学报告的某患者的白血病细胞占80％，该患者对应的某一克隆数也可能占到所在克隆的80％左右，如一个淋巴瘤患者，病理报告淋巴瘤细胞占8％，则异常增加的克隆数也会在8％左右，故我们认为增加的这个克隆即为疾病相关克隆。通过与免疫组库数据库(https://db.cngb.org/pird)的生物信息学比对，这类克隆也并非健康者免疫组库中所有的，故用这个克隆的cdr3的多肽片段作为靶点，通过噬菌体展示库淘选相应抗体，在理论上是不会发生治疗后相关免疫缺陷病或自身免疫病等不良反应，实现对t细胞肿瘤个性化精准治疗。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题，在于提供一种t系肿瘤噬菌体抗体库的构建方法及筛选的单克隆抗体。
本发明是这样实现的
一种针对t系肿瘤噬菌体单链抗体库的的构建方法，是从健康人群及t细胞白血病/淋巴瘤患者的外周血单个核细胞中扩增全套人源性抗体的重链和重链可变区基因，并进行交叉重叠，形成抗体scfv基因片段，然后插入噬菌体载体pcantab5f，建立t系肿瘤噬菌体抗体库。
具体包括以下步骤：
(1)分离健康人群及t细胞白血病/淋巴瘤患者的外周血单个核细胞pbmc及总rna的提取，通过rt-pcr合成cdna；
(2)以cdna为模板，扩增轻链kappa、轻链lambda和重链可变区基因，采用的引物如seq.no.5-35所示；
(3)通过重叠延伸overlappcr，将重链可变区基因分别连接轻链kappa、轻链lambda基因，制备单链抗体scfv；
(4)使用sfii分别酶切单链抗体scfv及pcantab5f载体，然后连接酶切产物；
(5)将连接的酶切产物电击转化tg1感受态细胞后，经辅助噬菌体m13ko7超感染，将目的单链抗体基因片段序列整合到噬菌体基因组中，收集所有克隆的质粒dna，即为抗体库dna。
本发明还保护了所述方法筛选到的单链抗体。
进一步地，用cdr3多肽作为靶抗原，用噬菌体展示的方法，筛选t系肿瘤噬菌体抗体库，从而筛选出抗cdr3的特异性单链抗体。
更具体地，以氨基酸序列为astrgqgvneqy的cdr3多肽为抗原，淘选得到的与该cdr3多肽特异性结合的噬菌体抗体，其氨基酸序列的重链及轻链可变区测序结果如下：
本发明具有如下优点：
本发明从健康志愿者外周血和t细胞白血病/淋巴瘤患者的外周血、骨髓、淋巴结或其它病理组织的单个核细胞中扩增全套人源性抗体的重链和重链可变区基因，并进行交叉重叠，形成抗体scfv基因片段，插入噬菌体载体pcantab5f，建立了t细胞白血病/淋巴瘤噬菌体抗体库，容量为2.70×108，符合大容量抗体库的标准。该抗体库主要用来高通量筛选靶向t细胞白血病/淋巴瘤的抗cdr3高亲合力人源化抗体，具有较高的敏感性、特异性。
附图说明
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1为重链可变区基因pcr扩增产物图。
图2为轻链可变区基因pcr扩增产物图。
图3为overlappcr产物琼脂糖凝胶电脉。
图4为噬菌体酶切产物电泳图。
图5为采用流式细胞术检测抗体特异性结合相应t系肿瘤原代细胞表面表达tcrcdr3抗原的结果，横坐标代表与抗体结合的阳性细胞数值，纵坐标代表阳性细胞占总细胞百分比。
具体实施方式
1实验主要试剂
(1)pbs(gbico,cat#14190-250)
(2)oxoidtmtryptone(thermo,cat#lp0042t)
(3)oxoidtmyeastextractpowder(thermo,cat#lp0021t)
(4)
(5)agarose(thermo,cat#75510019)
(6)pcantab5f载体(爱康得生物科技有限公司)
(7)peg8000(sigma,cat#89510-1kg-f)
(8)nacl(sigma,cat#s7653-250g)
(9)m13ko7helperphage(neb，cat#n0315s)
(10)trypsin(sigma,cat#t1426)
(11)氨苄青霉素(solarbio，cat#a8180)
(12)卡钠霉素(solarbio，cat#k8020)
(13)70％酒精
(14)tg1感受态(icartab,cat#el792)
(15)trizolreagent(thermo,cat#15596018)
(16)异丙醇
(17)氯仿
(18)coatingbuffer：tbs(50mmtris-hcl，ph7.5,150mmnacl)或0.1m碳酸钠(ph8.6)
(19)75％乙醇(用rnase-free水配置)
(20)rnase-free水(thermo,cat#r0581)
(21)酒精(分出部分置于-20℃)
(22)primescripttmii1ststrandcdnasynthesiskit(takara,cat#6210b)
2主要引物合成
2.1重链引物
vhf1:
ggtggttcctctagatcttcctcctctggtggcggtggctcgggcggtggtgggcaggtgcagctggtgcagtctgg
vhf2:
ggtggttcctctagatcttcctcctctggtggcggtggctcgggcggtggtgggcagatcaccttgaaggagtctgg
vhf35:
ggtggttcctctagatcttcctcctctggtggcggtggctcgggcggtggtggggaggtgcagctggtgsagtctgg
vhf3a:
ggtggttcctctagatcttcctcctctggtggcggtggctcgggcggtggtggggaggtgcagctgktggagtctg
vhf4:
ggtggttcctctagatcttcctcctctggtggcggtggctcgggcggtggtgggcaggtgcagctgcaggagtcggg
vhf4a
ggtggttcctctagatcttcctcctctggtggcggtggctcgggcggtggtgggcaggtgcagctacagcagtgggg
vhr1234
cctggccttcgtggcctgactagtgaccgatgggcccttggtggargc
vhrm
cctggccttcgtggcctgactagtaagggttggggcggatgcactccc
vhra
cctggccttcgtggcctgactagtgaccttggggctggtcggggatgc
vhrd
cctggccttcgtggcctgactagtcacatccggagccttggtgggtgc
vhre
cctggccttcgtggcctgactagtgacggatgggctctgtgtggaggc
2.2轻链引物
轻链kappa引物
vkf1
gggcccagccggccgagctccagatgacccagtctcc
vkf24
gggcccagccggccgagctcgtgatgacycagtctcc
vkf3
gggcccagccggccgagctcgtgwtgacrcagtctcc
vkf5
gggcccagccggccgagctcacactcacgcagtctcc
vkr14
ggaagatctagaggaaccacctttgatytccaccttggtccc
vkr2
ggaagatctagaggaaccacctttgatctccagcttggtccc
vkr3
ggaagatctagaggaaccacctttgatatccactttggtccc
vkr4
ggaagatctagaggaaccacctttaatctccagtcgtgtccc
轻链lambda引物
vlbf1a
gggcccagccggccgagctcgtgbtgacgcagccgccctc
vlbf1b
gggcccagccggccgagctcgtgctgactcagccaccctc
vlbf2
gggcccagccggccgagctcgccctgactcagcctccctccgt
vlbf3
gggcccagccggccgagctcgagctgactcagccaccctcagtgtc
vlbf4
gggcccagccggccgagctcgtgctgactcaatcgccctc
vlbf6
gggcccagccggccgagctcatgctgactcagccccactc
vlbf78
gggcccagccggccgagctcgtggtgacycaggagccmtc
vlbf9
gggcccagccggccgagctcgtgctgactcagccaccttc
vlbf10
gggcccagccggccgagctcgggcagactcagcagctctc
vlbr1236
ggaagatctagaggaaccaccgcctaggacggtcascttggtscc
vlbr4
ggaagatctagaggaaccaccgcctaaaatgatcagctgggttcc
vlbr57
ggaagatctagaggaaccaccgccgaggacggtcagctsggtscc
2.3overlapextensionprimers
rscf
gaggaggaggaggaggaggcggggcccagccggccgagctc
rscr
gaggaggaggaggaggagcctggccttcgtggcctgactagtg
3主要实验耗材
50mlfalcon离心管(corning,cat#352070)
15mlfalcon离心管(corning,cat#430052)
96孔elisa平板(corning，#3690)
0.45um滤膜(merckmillipore,cat#slhp033rs)
10cm培养皿(corning,cat#430167)
4主要实验设备
普通光学倒置显微镜
离心机
生物安全柜
超速离心机(beckmanxl-90)
5实验方法步骤
5.1总rna提取
1.使用trizol将健康捐献者及t细胞白血病/淋巴瘤患者临床样本(外周血、骨髓、淋巴结或其它病理组织)分离的pbmc、组织充分裂解；
2.室温孵育5分钟；
3.向每个离心管中，分别加入200ul氯仿/1mltrizol裂解液，盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色。
4.室温静置5分钟；
5.12,000g、4℃离心15分钟。从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液(含rna)、中间的白色蛋白层(大部分为dna)及带有颜色的下层有机相。
6.吸取上清液转移至另一新的离心管中(切勿吸出白色中间层)。
7.向上清中加入500ul异丙醇/管，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10分钟。
8.12,000g、4℃离心10分钟。一般在离心后，试管底部会出现rna沉淀。
9.小心弃去上清,切勿触及沉淀，残留少量异丙醇没有关系。加入1ml/管75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，7,500×g、4℃离心5分钟后小心弃去上清，切勿触及沉淀。
10.打开离心管盖，室温干燥沉淀几分钟。沉淀干燥后，每管加入30ul的rnase-free水溶解沉淀。
5.2cdna制备
1.在microtube中配制下列反应混合液：
2.65℃保温5min后，冰上迅速冷却。(注：本处理可使模板rna变性，提高反转录效率。)
3.在上述microtube管中配制下列反转录反应液，总量为160μl。
4.缓慢混匀后，置于42℃反转录1小时。
5.然后70℃孵育15分钟。
6.最后将cdna样品置于冰上或-20℃长期保存。进行下游pcr时，每100ulpcr反应体系，使用1-2ulcdna样品作为模板。
5.3pcr克隆
5.3.1第一轮pcr：扩增vk或vλ及vh
1)引物准备：按照重链和轻链引物组合，分别准备重链、轻链的上下游引物混合物。
2)配置pcr反应体系
3)pcr反应程序如下：
4)琼脂糖电泳分析
取5-10ulpcr产物，使用2％的琼脂糖进行电泳分析，正确的条带大小为350bp左右，如图1、2所示。
5)纯化pcr产物，并用nanodrop测定浓度(1.8ug/ul)。
5.3.2第二轮pcr：overlapextensionpcr连接vk-vh或vλ-vh进行overlappcr，制备单链抗体scfv。
1)配置pcr反应体系
2)pcr反应程序如下：
3)琼脂糖电泳分析
取5-10ulpcr产物，使用2％的琼脂糖进行电泳分析，正确的条带大小为700bp左右，如图3所示。
4)纯化pcr产物，并用nanodrop测定浓度(2.0ug/ul)。
5.4酶切overlappcr产物及pcantab5f载体
使用sfii酶切pcantab5f载体及overlappcr的产物；
pcr产物的酶切体系如下：
pcantab5f载体的酶切体系如下：
置于50℃酶切5小时；
使用1％的琼脂糖凝胶纯化pcr产物；用0.6％的琼脂糖凝胶分离载体片段，并分别测定回收产物的浓度。
5.5酶切产物连接
overlappcr产物连接：
1)16℃过夜连接后，65℃加热处理15min使t4ligase失活。
2)加入0.1倍体积的3m醋酸钠(ph5.2-6)、5ugglycogen，混匀后，再加入2倍体积的100％酒精，混匀后，-80℃放置2小时或过夜。(沉淀下来的连接产物可在-80℃放置数月)
3)12000g、4℃离心15分钟后，去掉上清，加入70％的酒精后，轻轻上下颠倒数次，洗涤沉淀2次；
4)12000g、4℃离心15分钟后，去掉上清，空气中稍加干燥后，加入15ul无菌水溶解dna沉淀。
取连接的酶切产物，使用2％的琼脂糖进行电泳分析，如图4所示，确认为阳性的重组克隆。
5.6电转化及phagerescue
1)将电转杯、连接产物置于冰上10分钟；同时在冰上解冻电转感受态500ul。
2)将500ul感受态加入到200ul的连接产物中，将移液枪头用剪刀剪去一截，上下吹打一次后，将dna/感受态混合物分装转移到电转杯中(50ul/0.2cm电转杯)，避免气泡，置于冰上1分钟，然后用预设的电转程序电击(25μf,2.5kvat200ohms、3.5ms)。
3)每次电击结束后，向每个电转杯中立即加入1ml2xyt-g培养基重悬菌体，然后转移至一个50ml离心管中，经2次电击结束后，共收集到约10ml菌液，向菌液中加入6ml新鲜的室温2xyt-g培养基，37℃、250rpm培养1小时。
4)向菌液中加入终浓度为100ug/ml的氨苄青霉素，向菌液中加入6*1010pfu的辅助噬菌体m13ko7，37℃、250rpm培养1小时。
m13ko7体积＝6*1010pfu/m13ko7滴度
5)2000xg室温或4℃离心10分钟，将上清完全去掉。
6)用200ml预热至37℃的2xyt-ak培养基重悬菌体沉淀，37℃、250rpm过夜培养；
7)3000xg、4℃离心15分钟，将含有重组噬菌体的上清转移至一个新的无菌锥形瓶中，同时收集菌体沉淀，用质粒大抽试剂盒抽提其中的phagemid；向上清中加入peg8000至终浓度为w/v＝4％和nacl至终浓度为w/v＝3％，200rpm、37℃震荡10分钟后，将锥形瓶置于冰中静置30分钟；
8)15000xg、4℃离心15分钟，小心去掉上清后，用2ml1％bsa的tbs缓冲液重悬沉淀。
9)将重悬后的沉淀转入2ml离心管中，用1ml移液器吹打混匀后，12000xg、4℃离心5分钟；将上清通过pes材质的0.45um的滤膜过滤至一个新的离心管中后，立即进行噬菌体淘选的步骤。
5.7固定多肽抗原噬菌体淘选
使用elisa包被抗原的平板，包被目的蛋白，经历数次洗脱步骤后，使用胰酶将结合在固定抗原上的重组噬菌体洗脱下来，并进行扩增；经历3-4轮淘选后，挑选单克隆进行测序。
1.每孔包被0.1-1ug抗原(cdr3多肽)，每孔25ul；使用密封膜密封包被的孔，置于4℃过夜；每种抗原需要包被两个well；
2.甩干孔内的包被液，加入150ul3％bsa进行封闭，密封后，置于37℃1小时；
3.甩干孔内的封闭缓冲液，加入50ul/孔新鲜制备的重组噬菌体库，密封后，置于置于37℃2小时；
4.同时，在一个15ml离心管中，加入2mler2738菌的培养基及相应浓度的四环素，250rpm、37℃摇菌培养，直至o.d600达到1.0；每种抗原准备一管。
5.将孵育好重组噬菌体的孔板从培养箱中取出，甩掉孔内的液体，每孔加入150ul0.5％的tween20，室温静置5分钟后，甩掉所有的液体；重复洗涤5次；
6.最后每孔加入50ul10mg/ml的胰酶，密封之后，置于37℃、30分钟；用移液器吹打10次，将消化下来的噬菌体加入到上面步骤准备的er2738菌中，室温静置15分钟；
7.加入6ml预热的培养基及相应浓度的四环素后，将总共8ml菌液转移至一个新的50ml离心管中，250rpm、37℃摇菌培养1小时；
8.向菌液中加入终浓度为100ug/ml的氨苄青霉素、1ml的辅助噬菌体m13ko7(1012-1013pfu)，37℃、250rpm培养1小时。
9.2000xg室温或4℃离心10分钟，将上清完全去掉。
10.用200ml预热至37℃的2xyt-ak培养基重悬菌体沉淀，加入100ug/ml的氨苄青霉素、50ug/ml的卡那霉素、37℃、250rpm过夜培养；同时准备包被第二天淘选用的孔板。
11.3000xg、4℃离心15分钟，将含有重组噬菌体的上清转移至一个新的无菌锥形瓶中，同时收集菌体沉淀，用质粒大抽试剂盒抽提其中的phagemid；向上清中加入peg8000至终浓度为w/v＝4％和nacl至终浓度为w/v＝3％，200rpm、37℃震荡10分钟后，将锥形瓶置于冰中静置30分钟；
12.15000xg、4℃离心15分钟，小心去掉上清后，用2ml1％bsa的tbs缓冲液重悬沉淀。
13.将重悬后的沉淀转入2ml离心管中，用1ml移液器吹打混匀后，12000xg、4℃离心5分钟；将上清通过pes材质的0.45um的滤膜过滤至一个新的离心管中后，立即进行噬菌体淘选的步骤。
14.重复以上淘选步骤3-4次。
6.结果
6.1建立了t细胞白血病淋巴瘤的噬菌体展示抗体库
该噬菌体展示抗体库库容量为2.70×108。
6.2利用该抗体库淘选出的靶向cdr3多肽的抗体序列
以序列为astrgqgvneqy的cdr3多肽淘选得到的与该cdr3多肽结合的噬菌体抗体基因序列，对应的抗体氨基序列。
表1cdr3peptide1全人源抗体重链及轻链可变区测序结果
如表1所示的抗体1和抗体2即为噬菌体抗体库中筛选出的单链抗体序列，该序列是针对肽段astrgqgvneqy的特异性抗体。
6.3噬菌体抗体库的敏感性、特异性
5个cdr3肽段落每个都用该抗体库找到了对应抗体，筛选效率高，敏感性高。
在淘选过程中，只有能和噬菌体展示上的抗体结合的抗体才被结合多肽，不会被洗脱下来，如图5所示，图中左侧峰图代表无关抗体同型对照占总细胞百分比(16.2％)，右侧峰图代表与抗cdr3特异性抗体结合的阳性细胞百分比(83.8％)。证明筛选的单链抗体可以和cdr3特异性结合。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
序列表
<110>陈丹娜
<120>t系肿瘤噬菌体抗体库的构建方法及筛选的单克隆抗体
<160>37
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>105
<212>prt
<213>(人工序列)
<400>1
gluleuglnmetthrglnserproserthrleuseralaservalgly
151015
aspargvalthrilethrcysargalaserglnserilesersertrp
202530
leualatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile
354045
tyrlysalaserserleugluserglyvalproserargphesergly
505560
serglyserglythrgluphethrleuthrileserserleuglnpro
65707580
aspaspphealathrtyrsercysleuglntyrserthrtyrtrpala
859095
pheglyglnglythrlysvalgluile
100105
<210>2
<211>122
<212>prt
<213>(人工序列)
<400>2
glnvalglnleuvalglnserglyalaglugluarglysproglyala
151015
servallysilesercysthrthrseralahisserphethrasntyr
202530
tyrphehistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpile
354045
glyilevalasnproserglyserargthrlystyralagluargphe
505560
glnglyargvalthrmetthrargaspargserserthrthrvaltyr
65707580
metglumetthrserleuglyprogluaspthralailetyrphecys
859095
alaargaspmetgluthrvalglyalathrtyrcyspheaspglntrp
100105110
glyproglythrleuvalthrvalserser
115120
<210>3
<211>111
<212>prt
<213>(人工序列)
<400>3
gluleuaspalavalvalthrglngluseralaleuthrthrserpro
151015
glygluthrvalthrleuthrcysargserserthrglyalavalthr
202530
thrserasntyralaasntrpvalglnglulysproasphisleuphe
354045
thrglyleuileglyglythrasnasnargalaproglyvalproala
505560
argpheserglyserleuileglyasplysalaalaleuthrilethr
65707580
glyalaglnthrgluaspglualailetyrphecysalaleutrptyr
859095
serasnhisleuvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleu
100105110
<210>4
<211>114
<212>prt
<213>(人工序列)
<400>4
gluvalmetleuvalgluseraspalagluleuvallysproglyala
151015
servallysilesercyslysalaserglytyrthrphethrasphis
202530
alailehistrpvallysglnlysprogluglnglyleuglutrpile
354045
glytyrileserproglyasnglyaspilelystyrasnglulysphe
505560
lysglylysalathrleuthralaasplysserserserthralatyr
65707580
metglnleuasnserleuthrsergluaspseralavaltyrphecys
859095
hisleuhistyrtyrglytyrtrpglyglnglythrthrleuthrval
100105110
serser
<210>5
<211>77
<212>dna
<213>(人工序列)
<400>5
ggtggttcctctagatcttcctcctctggtggcggtggctcgggcggtggtgggcaggtg60
cagctggtgcagtctgg77
<210>6
<211>77
<212>dna
<213>(人工序列)
<400>6
ggtggttcctctagatcttcctcctctggtggcggtggctcgggcggtggtgggcagatc60
accttgaaggagtctgg77
<210>7
<211>77
<212>dna
<213>(人工序列)
<400>7
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cagctggtgsagtctgg77
<210>8
<211>76
<212>dna
<213>(人工序列)
<400>8
ggtggttcctctagatcttcctcctctggtggcggtggctcgggcggtggtggggaggtg60
cagctgktggagtctg76
<210>9
<211>77
<212>dna
<213>(人工序列)
<400>9
ggtggttcctctagatcttcctcctctggtggcggtggctcgggcggtggtgggcaggtg60
cagctgcaggagtcggg77
<210>10
<211>77
<212>dna
<213>(人工序列)
<400>10
ggtggttcctctagatcttcctcctctggtggcggtggctcgggcggtggtgggcaggtg60
cagctacagcagtgggg77
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<211>48
<212>dna
<213>(人工序列)
<400>11
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<211>48
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<213>(人工序列)
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<211>48
<212>dna
<213>(人工序列)
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<213>(人工序列)
<400>14
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<212>dna
<213>(人工序列)
<400>15
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<212>dna
<213>(人工序列)
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<212>dna
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<213>(人工序列)
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<212>dna
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<213>(人工序列)
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