本发明涉及一种利用构巢曲霉发酵高产棘白菌素b的方法。
(二)
背景技术：
丝状真菌发酵过程中，其菌丝形态受生长条件及培养环境的影响，随着培养条件、培养基组成等的变化，菌丝形态会出现不同的类型，如无分支的菌丝、有分支且结构复杂的菌丝、菌丝团块、菌丝球等，表现出不同大小、密度及表面结构。此外，随时间变化，不同生长时期的菌丝体内部结构也会发生改变。丝状真菌在液体深层发酵中菌丝体通常呈现絮状、团状和球状三种形态。菌丝体形态对发酵液的粘度等影响较大，菌丝体形态不同，其产物也会发生改变，因此，在丝状真菌发酵过程中需要将其控制在最佳菌丝体形态，以利于目标产物的代谢合成。
在发酵生产过程中，丝状真菌菌丝若形成絮状的菌丝体，会造成发酵液粘度增大，不利于营养物质和氧气的溶解、传递及分布，从而降低好氧发酵产物的产量，严重时会导致产物产率极低；若菌丝体形态呈现紧密的团块状，在团块内部，营养物质及氧气传递受阻，会导致内部出现营养匮乏及缺氧状态，影响菌丝体生长和产物合成，有时还会造成团块内部菌丝体发生自溶现象。深层液体发酵的孢子萌发出菌丝及菌丝延长的过程中，在孢子聚集及机械搅拌作用下，发酵液中的菌丝还可以形成大小适中的菌丝球，此时发酵液的传递效果好，菌丝体生长旺盛，目标代谢产物合成效率高。可以说菌丝体形态是工业发酵中获得目标产物产量最大化的主要影响因素。
目前国内外棘白菌素b(ecb)均是利用微生物发酵法进行制备，其中主要是以构巢曲霉aspergillusnidulans进行发酵。但是该类微生物发酵过程中会碰到一些难以克服的技术问题，如发酵液粘度过高，供养不足以及传质受阻等，这些问题都会导致菌种代谢合成产物的能力下降，因此ecb发酵仍然处于实验研究阶段。要解决上述问题，常用的方法有菌种诱变、培养基优化、气升式发酵罐培养、细胞固定化以及工艺操作条件调控等。近年来，研究学者提出了通过改变发酵培养基成分以及添加外源无机微粒的方式影响丝状微生物生长过程中的菌体形态，并进一步影响产物产量及酶的活性，因此选择合适的方法改变棘白菌素b菌株发酵过程中的菌体形态对实现棘白菌素b发酵生产具有较大的社会和经济效益。
(三)
技术实现要素：
本发明目的是提供一种利用构巢曲霉发酵高产棘白菌素b的方法，提供一种控制构巢曲霉发酵菌株a.nidulanszjb09223菌体形态的发酵培养基，以克服棘白菌素b发酵过程中发酵液粘度过高，溶氧传质受阻的缺陷，然后对该培养基进行前体氨基酸添加的优化，进一步提高棘白菌素b发酵产量。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种利用构巢曲霉发酵高产棘白菌素b的方法，所述方法为：将构巢曲霉接种至发酵培养基，在25℃下培养，获得含棘白菌素b的发酵液，将发酵液分离纯化，获得棘白菌素b；所述发酵培养基终浓度组成为：碳源54～134g/l，氨基酸0.1～12g/l，蛋白胨8.6g/l，黄豆饼粉40.0g/l，花生油20.0g/l，k2hpo4·3h2o3.2g/l，cacl20.5g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，feso4·7h2o0.5g/l，mnso4·h2o0.2g/l，cuso4·5h2o0.6g/l，溶剂为蒸馏水，ph值6～6.8，所述碳源为甘露醇、葡萄糖、甘油或油酸甲酯。
进一步，所述发酵培养基中碳源为油酸甲酯，添加量为54～134g/l，优选114g/l。
进一步，所述发酵培养基中氨基酸为l-苏氨酸、l-鸟氨酸中的一种或两种的混合。
进一步，所述发酵培养基中氨基酸由终浓度0.1～4.1g/l的l-苏氨酸和终浓度6.1g/l的l-鸟氨酸组成。
进一步，所述发酵培养基中氨基酸由终浓度2.1g/l的l-苏氨酸和终浓度6.1g/l的l-鸟氨酸组成。
进一步，所述l-苏氨酸在发酵第6-7天的时候加入。
进一步，所述发酵培养基还含有微粒，所述微粒为玻璃珠或滑石粉。
进一步，所述玻璃珠直径为2mm，添加量为10颗/l培养基。
进一步，所述滑石粉粒径为300-800目(优选325目)，添加量为10-50g/l培养基(优选20g/l)。
进一步，所述发酵培养基终浓度优选组成为：325目滑石粉20g/l，油酸甲酯114g/l，l-苏氨酸3.1g/l，l-鸟氨酸6.1g/l，蛋白胨8.6g/l，黄豆饼粉40.0g/l，花生油20.0g/l，k2hpo4·3h2o3.2g/l，cacl20.5g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，feso4·7h2o0.5g/l，mnso4·h2o0.2g/l，cuso4·5h2o0.6g/l，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
所述构巢曲霉优选构巢曲霉发酵菌株a.nidulanszjb09223(cctccm2012300，已在专利申请cn103509840a，cn201310478251.6中公开)。
本发明发酵培养基能够控制构巢曲霉在发酵过程中的菌体形态，提高和稳定ecb发酵产量。
所述氨基酸检测方法如下：发酵液取样后迅速加入-40℃的50％甲醇进行淬灭，超声破碎菌体，超纯水稀释一定倍数，离心，取上清用于氨基酸含量分析。
经过实施例中的各碳源对比发现葡萄糖，甘油，甘露醇作为碳源菌体生长状态较差，溶液粘稠，不利于产物生成；而优化的碳源为油酸甲酯，以油酸甲酯为碳源相对于其他三者效果较好；微粒中以滑石粉和玻璃珠两者为对照，其中玻璃珠的添加与滑石粉对比，产物效价较低；氨基酸的添加是有针对性地改变ecb合成路径中氨基酸代谢途径的相关氨基酸含量，相关氨基酸最为关键的为苏氨酸。
本发明的有益效果主要体现在：通过优化碳源种类、添加微粒等方式控制构巢曲霉发酵过程中的菌丝体形态，使菌丝体呈现小球状，使发酵中因菌丝体长度过长导致的粘度高、溶氧低、传质不充分等问题得到解决；通过分析ecb合成过程中关键代谢组分，优化发酵过程中的前体添加策略，使发酵产物产量进一步提高一倍以上，具有很好的应用前景。
(四)附图说明
图1为添加不同碳源时的菌体形态。
图2为添加不同无机微粒时的菌体形态。
图3为未添加前体氨基酸发酵培养基中第七天氨基酸分析图。
图4为添加前体氨基酸发酵培养基中第七天氨基酸分析图。
图5为优化后的发酵培养基棘白菌素b的hplc图谱。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：构巢曲霉a.nidulanszjb09223发酵制备棘白菌素b(ecb)
用接种铲挖取面积约1cm2的构巢曲霉a.nidulanszjb09223(cctccm2012300，已在专利申请cn103509840a，cn201310478251.6中公开)平板菌落接种到装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，25℃培养48h，获得种子液。种子培养基(g/l)配制：黄豆饼粉25，葡萄糖10，甘油10，溶剂为蒸馏水，ph值自然，115℃灭菌30min。
为了考察培养基中单一碳源对ecb发酵水平和菌体形态的影响，设计5种不同的发酵培养基，摇瓶装液量为50ml/250ml，发酵培养基组成分别为：
发酵培养基(g/l)i(原始培养基)：甘露醇97，甘油10.0，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，l-苏氨酸2.1，l-鸟氨酸6.1，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
发酵培养基(g/l)ii：甘露醇129.0，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，l-苏氨酸2.1，l-鸟氨酸6.1，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
发酵培养基(g/l)iii：葡萄糖127.4，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，l-苏氨酸2.1，l-鸟氨酸6.1，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
发酵培养基(g/l)iv：甘油128.8，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，l-苏氨酸2.1，l-鸟氨酸6.1，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
发酵培养基(g/l)v：油酸甲酯94.4，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，l-苏氨酸2.1，l-鸟氨酸6.1，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
培养基iv在115℃灭菌30min，其余培养基均在121℃灭菌20min。发酵培养的摇瓶装液量为50ml/250ml，将种子液按照体积浓度5％转接到5种发酵培养基中，在25℃下培养10天。
发酵结束后，移取2ml发酵液，加入8ml甲醇，室温下萃取30min，10000rpm离心10min，上清液经0.22μm微滤膜过滤，滤液采用日立hplc分析。hplc分析条件：色谱柱为c18柱(4.6×250mm,5μm)；流动相为甲醇：乙腈：水＝7:1:2；流速1ml/min；紫外检测波长222nm；进样量为20μl：柱温40℃。发酵液i、ii、iii、iv、v中ecb的浓度分别为930mg/l、1023mg/l、605mg/l、946mg/l和2133mg/l。菌丝体形态分别为平均直径1.6mm菌丝球，平均直径1.5mm菌丝球，絮状形态，平均直径1.1mm菌丝球，平均直径1.2mm菌丝球。
由以上结果可见培养基的碳源对菌体形态(形态图参见图1)以及棘白菌素b发酵水平有较大的影响，当碳源为油酸甲酯时，效果最优。
实施例2：构巢曲霉a.nidulanszjb09223发酵制备ecb
用接种铲挖取面积约1cm2的构巢曲霉(a.nidulans)zjb09223平板菌落接种到装有50.0ml种子培养基的250ml三角瓶中，25℃培养48h，获得种子液。种子培养基同实施例1。
为了考察不同浓度油酸甲酯对ecb发酵水平的影响，设计5种不同的发酵培养基，摇瓶装液量为50ml/250ml，发酵培养基组成分别为：
培养基(g/l)i：油酸甲酯54，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，l-苏氨酸2.1，l-鸟氨酸6.1，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
培养基(g/l)ii：油酸甲酯74，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，l-苏氨酸2.1，l-鸟氨酸6.1，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
培养基(g/l)iii：油酸甲酯94，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，l-苏氨酸2.1，l-鸟氨酸6.1，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
培养基(g/l)iv：油酸甲酯114，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，l-苏氨酸2.1，l-鸟氨酸6.1，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
培养基(g/l)v：油酸甲酯134，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，l-苏氨酸2.1，l-鸟氨酸6.1，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
发酵培养基均在121℃灭菌20min。发酵培养的摇瓶装液量为50ml/250ml，将种子液按照体积浓度5％转接到5种发酵培养基中，在25℃下培养10天。
发酵结束后，移取2ml发酵液，加入8ml甲醇，室温下萃取30min，10000rpm离心10min，上清液经0.22μm微滤膜过滤，滤液采用日立hplc分析(同实施例1)。发酵液i、ii、iii、iv、v中ecb的浓度分别为1630mg/l、1911mg/l、2172mg/l、2882mg/l、2434mg/l。
由以上结果可见，油酸甲酯浓度变化对ecb发酵水平也有较大影响，当油酸甲酯浓度达到114g/l时，效果最优。
实施例3：构巢曲霉a.nidulanszjb09223发酵制备ecb
用接种铲挖取面积约1cm2的构巢曲霉(a.nidulans)zjb09223平板菌落接种到装有50.0ml种子培养基的250ml三角瓶中，25℃培养48h，获得种子液。种子培养基同实施例1。
为了考察不同微粒添加对ecb发酵水平和菌体形态(形态图参见图2)的影响，以实施例3中的培养基为基础设计5种不同的发酵培养基，摇瓶装液量为50ml/250ml，发酵培养基组成分别为：
培养基(g/l)i(空白对照)：油酸甲酯114，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，l-苏氨酸2.1，l-鸟氨酸6.1，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
培养基(g/l)ii：直径2mm玻璃珠10颗/l，油酸甲酯114，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，l-苏氨酸2.1，l-鸟氨酸6.1，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
培养基(g/l)iii：325目滑石粉30，油酸甲酯114，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，l-苏氨酸2.1，l-鸟氨酸6.1，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
发酵培养基均在121℃灭菌20min。发酵培养的摇瓶装液量为50ml/250ml，将种子液按照体积浓度5％转接到3种发酵培养基中，在25℃下培养10天。
发酵结束后，移取2ml发酵液，加入8ml甲醇，室温下萃取30min，10000rpm离心10min，上清液经0.22μm微滤膜过滤，滤液采用日立hplc分析(同实施例1)。发酵液i、ii、iii中ecb的浓度分别为2358mg/l、1827mg/l、2941mg/l。菌丝体形态分别为大小适中的菌丝球、体积较大的菌丝球、大小合适的菌丝球。
由以上结果可知培养基中添加一定浓度的滑石粉有利于棘白菌素b的积累和菌体形态的维持。
实施例4：构巢曲霉a.nidulanszjb09223发酵制备ecb
用接种铲挖取面积约1cm2的构巢曲霉(a.nidulans)zjb09223平板菌落接种到装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，25℃培养48h，获得种子液。种子培养基(同实施例1)。
为了考察不同种类的滑石粉对ecb发酵水平的影响，以实施例3中的培养基为基础设计5种不同的发酵培养基，摇瓶装液量为50ml/250ml，发酵培养基组成分别为：
培养基(g/l)i(空白对照)：油酸甲酯114，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，l-苏氨酸2.1，l-鸟氨酸6.1，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
培养基(g/l)ii：325目滑石粉30，油酸甲酯114，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，l-苏氨酸2.1，l-鸟氨酸6.1，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
培养基(g/l)iii：500目滑石粉30，油酸甲酯114，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，l-苏氨酸2.1，l-鸟氨酸6.1，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
培养基(g/l)iv：600目滑石粉30，油酸甲酯114，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，l-苏氨酸2.1，l-鸟氨酸6.1，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
培养基(g/l)v：800目滑石粉30，油酸甲酯114，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，l-苏氨酸2.1，l-鸟氨酸6.1，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
发酵培养基均在121℃灭菌20min。发酵培养的摇瓶装液量为50ml/250ml，将种子液按照体积浓度5％转接到5种发酵培养基中，在25℃下培养10天。
发酵结束后，移取2ml发酵液，加入8ml甲醇，室温下萃取30min，10000rpm离心10min，上清液经0.22μm微滤膜过滤，滤液采用日立hplc分析(同实施例1)。发酵液i、ii、iii、iv、v中ecb的浓度分别为2233mg/l、2834mg/l、1007mg/l、1057mg/l、1432mg/l。
由以上结果可见，培养基添加325目滑石粉有利于ecb的生成，效果最佳。
实施例5：构巢曲霉a.nidulanszjb09223发酵制备ecb。
用接种铲挖取面积约1cm2的构巢曲霉(a.nidulans)zjb09223平板菌落接种到装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，25℃培养48h，获得种子液。种子培养基同实施例1。
为了考察325目滑石粉不同浓度对ecb发酵水平的影响，以实施例4中的培养基为基础设计5种不同的发酵培养基，摇瓶装液量为50ml/250ml，发酵培养基组成分别为：
培养基(g/l)i：325目滑石粉10，油酸甲酯114，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，l-苏氨酸2.1，l-鸟氨酸6.1，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
培养基(g/l)ii：325目滑石粉20，油酸甲酯114，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，l-苏氨酸2.1，l-鸟氨酸6.1，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
培养基(g/l)iii：325目滑石粉30，油酸甲酯114，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，l-苏氨酸2.1，l-鸟氨酸6.1，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
培养基(g/l)iv：325目滑石粉40，油酸甲酯114，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，l-苏氨酸2.1，l-鸟氨酸6.1，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
培养基(g/l)v：325目滑石粉50，油酸甲酯114，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，l-苏氨酸2.1，l-鸟氨酸6.1，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
发酵培养基均在121℃灭菌20min。发酵培养的摇瓶装液量为50ml/250ml，将种子液按照体积浓度5％转接到5种发酵培养基中，在25℃下培养10天。
发酵结束后，移取2ml发酵液，加入8ml甲醇，室温下萃取30min，10000rpm离心10min，上清液经0.22μm微滤膜过滤，滤液采用日立hplc分析(同实施例1)。发酵液i、ii、iii、iv、v中ecb的浓度分别为1582mg/l、3148mg/l(hplc图参见图5)、2941mg/l、2834mg/l、2078mg/l。
由以上结果可见，培养基中添加一定浓度的325目滑石粉利于ecb的积累，当325目滑石粉浓度为20g/l时，效果最优。
实施例6：构巢曲霉a.nidulanszjb09223发酵液中氨基酸分析对比。
用接种铲挖取面积约1cm2的构巢曲霉a.nidulanszjb09223平板菌落接种到装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，25℃培养48h，获得种子液。种子培养基同实施例1。
为了考察构巢曲霉发酵中关键氨基酸的代谢，设计两种发酵培养基，摇瓶装液量为50ml/250ml，发酵培养基组成分别为：
培养基(g/l)i：未添加任何前体氨基酸，油酸甲酯114，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
培养基(g/l)ii：添加前体氨基酸，油酸甲酯114，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，l-苏氨酸2.1，l-鸟氨酸6.1，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
发酵培养基均在121℃灭菌20min。发酵培养的摇瓶装液量为50ml/250ml，将种子液按照体积浓度5％转接到5种发酵培养基中，在25℃下培养10天。
发酵第四天开始每天提取发酵液1ml，迅速加入-40℃的50％甲醇进行淬灭，超声破碎菌体，超纯水稀释100-300倍，离心，取上清用于氨基酸含量分析。第七天发酵液中苏氨酸浓度达到最高，其中培养基i代谢产生的苏氨酸浓度为1.21mmol/l(参见图3)棘白菌素b浓度为2038mg/l，培养基(g/l)ii代谢产生的苏氨酸浓度为2.28mmol/l(参见图4)ecb浓度为2566mg/l。在代谢过程中鸟氨酸在不同培养基中胞内浓度变化不明显。
由以上结果可见，苏氨酸是棘白菌素b的合成期间的关键前体。
实施例7：构巢曲霉a.nidulanszjb09223发酵前体添加策略
用接种铲挖取面积约1cm2的构巢曲霉a.nidulanszjb09223平板菌落接种到装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，25℃培养48h，获得种子液。种子培养基同实施例1。
为了考察在发酵产物合成关键时期添加苏氨酸浓度梯度对ecb发酵水平的影响，设计5种发酵培养基，摇瓶装液量为50ml/250ml，发酵培养基组成分别为：
培养基(g/l)i：第6天添加l-苏氨酸0.1，油酸甲酯114，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，l-鸟氨酸6.1，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，325目滑石粉20，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
培养基(g/l)ii：第6天添加l-苏氨酸1.1，油酸甲酯114，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，l-鸟氨酸6.1，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，325目滑石粉20，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
培养基(g/l)iii：第6天添加l-苏氨酸2.1，油酸甲酯114，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，l-鸟氨酸6.1，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，325目滑石粉20，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
培养基(g/l)iv：第6天添加l-苏氨酸3.1，油酸甲酯114，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，l-鸟氨酸6.1，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，325目滑石粉20，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
培养基(g/l)v：第6天添加l-苏氨酸4.1，油酸甲酯114，蛋白胨8.6，黄豆饼粉40.0，花生油20.0，l-鸟氨酸6.1，k2hpo4·3h2o3.2，cacl20.5，mgso4·7h2o0.5，feso4·7h2o0.5，mnso4·h2o0.2，cuso4·5h2o0.6，325目滑石粉20，溶剂为蒸馏水，ph值6.68。
发酵培养基均在121℃灭菌20min。发酵培养的摇瓶装液量为50ml/250ml，将种子液按照体积浓度5％转接到5种发酵培养基中，在25℃下培养10天。
发酵结束后，移取2ml发酵液，加入8ml甲醇，室温下萃取30min，10000rpm离心10min，上清液经0.22μm微滤膜过滤，滤液采用日立hplc分析(同实施例1)。发酵液i、ii、iii、iv、v中ecb的浓度分别为1908mg/l、2363mg/l、2214mg/l、2994mg/l、2230mg/l。
由以上结果可见，在发酵产物合成的关键时期添加适当关键前体物质苏氨酸利于ecb的生成，当苏氨酸在发酵第六天添加3.1g/l时，效果最优。