本发明涉及一种用于检测短喙矮小综合征鹅细小病毒的引物，属于畜牧兽医检测领域。
背景技术：
短喙与矮小综合征鹅细小病毒（shortbeakanddwarfismsyndrome-gooseparvovirus，sbds-gpv）是细小病毒科依赖病毒属成员，为泛组织嗜性单链dna病毒，临床上主要引起半番鸭和樱桃谷鸭以生长障碍、短喙、舌头外露、易骨析为特征的高度接触性传染病，在人工感染条件下，其对不同品种水禽均有感染性。本病最早由villatted.报道在法国半番鸭群中流行，2009年匈牙利palyav.分离鉴定了病原，并命名为sbds-gpv，2015年陈少莺等在中国大陆南方半番鸭与樱桃谷鸭群中检测到sbds-gpv感染，从发病半番鸭组织中分离到sbds-gpv并进行了系统鉴定。随着水禽养殖业的发展，短喙矮小综合征已经成为目前危害养鸭业的重要传染病之一，给养鸭业造成严重的经济损失。
鹅细小病毒（gooseparvovirus，gpv）基因组中间为编码区存在两个开放阅读框，从左往右依次为rep基因和vp基因，编码区两侧是包含有倒置末端重复序列的非编码区（untranslatedregion，utr）。vp基因编码三种结构蛋白vp1、vp2、vp3。vp3是gpv主要的免疫原性蛋白，能够在自然感染条件下诱导机体产生中和抗体，因此vp3常做为gpv分子生物学诊断的首选目标基因。gpv只有一种血清型，sbds-gpv与经典小鹅瘟病毒（classicalgpv，c-gpv）、基因重组型番鸭小鹅瘟病毒（muscovyduck-origingpv，mdgpv）分离株密切相关，vp3基因核苷酸序列同源性达91%～96%，与番鸭细小病毒（muscovyduckparvovirus，mdpv）分离株vp3基因序列同源性为84%～85%。目前，针对sbds-gpv建立的聚合酶链式反应（pcr）检测方法（常规pcr、荧光定量pcr、pcr-lamp）均以sbds-gpvvp3基因核苷酸序列为基础而设计引物，因此pcr引物特异性不高，容易产生假阳性结果，常将c-gpv、mdgpv和mdpv误判为sbds-gpv；实验室鉴别sbds-gpv基因特征的方法还是主要依据病毒基因组的核苷酸序列测定分析，然而在基层实验室日常检测工作中，针对大量临床感染样本的测序存在成本高、操作繁琐、耗时长等缺点，不适用于疫病的快速鉴别诊断和分析工作。因此，建立快速、特异、灵敏的sbds-gpv分子生物学检测方法十分重要。
不同疾病型gpv各分离株之间基因组核苷酸序列存在广泛的变异，尤其以5’末端非编码区（5’-untranslatedregion，5’-utr）序列变异最大，并且具有耐受碱基突变、插入或缺失的能力。与genbank中c-gpv、mdgpv和mdpv标准株全长基因多序列比对发现，sbds-gpv代表株的5’-utr基因在第250～400位核苷酸序列内存在连续15个碱基的独特缺失以及多处连续碱基突变，因此可以根据此段序列设计特异性pcr引物对sbds-gpvdna进行检测。目前国内外还未见到针对5’-utr设计特异性引物检测sbds-gpv的研究报道。我们在大量分析gpv和mdpv不同分离株基因组序列基础上，在国内外首次针对5’-utr序列设计用于检测sbds-gpv的特异性pcr引物，能够有效避免sbds-gpv核酸检测过程中假阳性结果的出现。本发明的建立可填补国内外相关领域的空白。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种针对5'-utr基因检测短喙矮小综合征鹅细小病毒的pcr引物，针对5’-utr序列设计用于检测sbds-gpv的特异性pcr引物，能够有效避免sbds-gpv核酸检测过程中假阳性结果的出现。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
用于检测短喙矮小综合征鹅细小病毒的引物包括：
一种针对5'-utr基因检测短喙矮小综合征鹅细小病毒的pcr引物，所述引物序列如下：
pcr上游引物sbds-gpv-f1：5’-gcacgtgacaggatgtgcgtca-3’；
pcr下游引物sbds-gpv-r1：5’-gcgcgcaaaatattttct-3’。
利用本发明的引物可用于短喙矮小综合征鹅细小病毒的相应基因进行检测，尤其适用于基层科研实验室的检测。通过对反应体系和反应条件的各种优化，建立一套可用于检测短喙矮小综合征鹅细小病毒的常规pcr方法。
具体操作方法如下：
1、引物设计：参考genbank中的短喙矮小综合征鹅细小病毒基因组5’-utr核苷酸序列，利用lasergenev7.1dnastar软件进行同源性分析比较，利用oligo6.0软件，设计短喙矮小综合征鹅细小病毒特异性pcr引物，采用blast工具进行检索，初步验证其特异性。
2、反应体系的优化：优化出的25μl最佳反应体系为：q5high-fidelity2×mastermix12.5μl，上、下游引物（20μmol/l）各0.5μl，模板2μl，加灭菌双蒸水补足至25μl。最佳反应条件为：98℃10s；98℃10s、53℃20s、72℃30s，共33个循环，72℃延伸5min。
3、pcr产物电泳检测：pcr反应结束后，取3μl扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果：在130bp处未出现特异性基因条带的样品，表示该样品不含有短喙矮小综合征鹅细小病毒；在130bp处出现基因条带的样品，表示该样品含有短喙矮小综合征鹅细小病毒。
本发明的优点和有益效果：对本发明引物的特异性和灵敏度进行分析的结果，于供试的短喙矮小综合征鹅细小病毒阳性样品中，在130bp处扩增出特异的目的条带，而健康水禽组织样品及c-gpv、mdgpv和mdpv在130bp处都未扩增出特异条带；通过克隆测序，扩增序列与genbank公布的短喙矮小综合征鹅细小病毒的不同分离株基因相应序列的同源性最高（95%-100%），证明该引物具有良好的特异性，检测结果具有可靠性。本发明的引物特异性高、且片段小，敏感性高，整个pcr过程可以在1.5h内完成，能够特异性检测出短喙矮小综合征鹅细小病毒的存在，可以有效避免短喙矮小综合征鹅细小病毒pcr检测假阳性结果的出现。
通过对引物灵敏度分析，该特异引物的灵敏度高，因此在样品量较少或者在组织样品中病毒含量很低的情况下，也能用该引物检测。通过pcr检测短喙矮小综合征鹅细小病毒在水禽细小病毒分子流行病学检测过程中具有重要的应用价值，为短喙矮小综合征的早期预防控制奠定技术基础。
附图说明
图1为pcr引物特异性示意图。其中，m表示dl2000dnamarker；1表示sbds-gpvm15株dna样品；2表示健康鸭组织总dna样品；3表示c-gpvfj株dna样品，不含sbds-gpv核酸；4表示mdgpvpt株dna样品，不含sbds-gpv核酸；5表示mdpvp株dna样品，不含sbds-gpv核酸。
图2为pcr引物灵敏度分析示意图。m表示dl2000dnamarker；1表示dna相对浓度为30ng；2表示dna相对浓度为3ng；3表示dna相对浓度为300pg；4表示dna相对浓度为30pg；5表示dna相对浓度为3pg；6表示阴性对照。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所述试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
实施例1检测短喙矮小综合征鹅细小病毒的pcr检测方法
一、材料：
短喙与矮小综合征鹅细小病毒m15株（sbds-gpvm15）、基因重组型番鸭小鹅瘟病毒pt株（mdgpvpt）、番鸭细小病毒p株（mdpvp）与经典鹅细小病毒fj株（c-gpvfj）均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所动物病毒室分离、鉴定并保存。
二、步骤
1、仪器与试剂：t100型梯度pcr仪，购自bio-rad伯乐公司；pmd18-t载体、dl2000marker均购自宝生物工程（大连）有限公司；q5超保真2×mastermix购自neb公司；dna纯化试剂盒e.z.n.a.tmgelextractionkit和质粒快速提取试剂盒e.z.n.a.tmplasmidminikit购自omega公司。
2.引物设计和合成
利用oligo6.0软件根据sbds-gpv的5’-utr保守区域序列设计1对寡核苷酸引物，上游引物sbds-gpv-f1和下游引物sbds-gpv-r1。
上游引物及其序列为：
sbds-gpv-f1（seqidno：1）：5’-gcacgtgacaggatgtgcgtca-3’；
下游引物及其序列为：
sbds-gpv-r1（seqidno：2）：5’-gcgcgcaaaatattttct-3’。
3.针对5'-utr基因短喙矮小综合征鹅细小病毒pcr检测方法的建立
以常规方法提取短喙矮小综合征鹅细小病毒基因组dna。pcr反应体系为25μl，包括9.5μl灭菌水，q5high-fidelity2×mastermix12.5μl，上、下游引物（20μmol/l）各0.5μl，模板2μl，混匀后于t100型梯度pcr仪上进行扩增；反应条件为：98℃10s；98℃10s、53℃20s、72℃30s，共33个循环，72℃延伸5min。
pcr反应结束后，取3μl扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察、拍照。以是否产生130bp特异性条带来判断样品中是否含有短喙矮小综合征鹅细小病毒。
实施例2短喙矮小综合征鹅细小病毒pcr的特异性检测
取分别人工感染sbds-gpv、c-gpv、mdgpv与mdpv发病鸭组织阳性样品以及健康鸭组织阴性样品，按实施例1以常规方法提取总dna、进行pcr扩增，凝胶电泳检测结果。结果sbds-gpv感染病料中产生130bp的特异条带，而c-gpv、mdgpv和mdpv感染病料以及健康鸭组织样品均未产生130bp的特异条带，检测结果如图1所示。将pcr产物回收纯化后克隆至pmd18-t载体并测序。结果表明，扩增的目的片段序列与genbank公布的sbds-gpv的不同病毒分离株5'-utr相应序列的同源性最高（95%-100%）。因此该引物为针对5'-utr基因短喙矮小综合征鹅细小病毒特异性引物，可用于短喙矮小综合征鹅细小病毒的快速检测。
上述结果表明建立的pcr方法具有良好的特异性，可用于短喙矮小综合征鹅细小病毒的检测。
实施例3短喙矮小综合征鹅细小病毒pcr的灵敏性检测
按实施例1以常规方法提取sbds-gpv病毒dna，将提取的dna进行10倍系列稀释，进行pcr扩增，以检测该方法的相对灵敏度。pcr检测结果如图2所示。该特异引物sbds-gpv-f1（seqidno：1）和sbds-gpv-r1（seqidno：2）能检测到的最低相对dna浓度的灵敏度为3pg，引物灵敏度好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
sequencelisting
110福建省农业科学院畜牧兽医研究所
120一种针对5'-utr基因检测短喙矮小综合征鹅细小病毒的pcr引物
130sbds-gpv
1501
1512018-02-07
1602
170patentinversion3.5
2101
21122
212dna
213parvo-likevirus
4001
gcacgtgacaggatgtgcgtca22
2102
21118
212dna
213parvo-likevirus
4002
gcgcgcaaaatattttct18