一种耐高氨氮异养硝化-好氧反硝化的苍白杆菌及其应用的制作方法

本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一种耐高氨氮异养硝化-好氧反硝化的苍白杆菌及其应用。

背景技术：

近年来，高氨氮废水(氨氮浓度＞200mg/l)的排放量日益增多。高氨氮废水处理不当直接排入水体，会导致水体富营养化等现象日趋严重，造成水体质量恶化。为了控制水体氨氮污染，我国颁布了严格的污染物控制新标准，其中氨氮的一级标准为5.0mg/l。新标准对氨氮的有效控制，尤其是对高氨氮废水中氨氮的有效控制提出新的要求。

由于高额成本以及二次污染问题，去除高氨氮废水中氨氮的物化方法（如吹脱法、蒸氨塔蒸馏法，折点加氯法和fenton氧化法等）只是在特殊的化工行业有应用。而生物脱氮以其无污染、经济和安全等优点被认为是目前最具有应用前景的水体除氮方法。

传统生物脱氮技术主要包括a/o工艺（厌氧好氧工艺法），短程硝化反硝化工艺，硝化+厌氧氨氧化等工艺。这些生物脱氮技术都是利用了自养硝化菌的特性，达到去除氨氮的目的。然而，由于高浓度氨氮废水中含有的大量游离氨对自养型的硝化细菌具有极强的抑制作用，导致自养硝化菌氨氧化过程受到抑制，影响氨氮处理效果，导致这些生物方法在处理高氨氮废水时处理效果不佳。此外，这些生物脱氮工艺未摆脱好氧厌氧结合的两段式生物脱氮限制，需要大量的空间来分隔好氧环境和厌氧环境的储罐，使得脱氮设备的建设成本较高。

近年来，有研究者发现了特殊的异养硝化-好氧反硝化细菌，这类细菌具有同步硝化和反硝化的特性，在完全好氧条件下可在一个反应器中实现氨氮和总氮同步脱除，解决了硝化和反硝化过程的矛盾。随着研究的不断深入，还发现该类细菌具有耐盐、耐低温、耐高氨氮和耐贫营养环境等生化特性。

苍白杆菌属是一类专性好氧、严格呼吸代谢、能利用各种氨基酸、有机酸和碳水化合物为碳源的菌群，目前还没有文献记载苍白杆菌属具有异养硝化-好氧反硝化功能。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种耐高氨氮异养硝化-好氧反硝化的苍白杆菌，该菌能够在高氨氮、高盐度条件下的好氧环境中实现同步硝化反硝化脱氮的过程，有效去除高氨氮废水、高盐度废水中的总氮，尤其适用于去除高氨氮废水中的氨氮，具有广泛推广的意义。

本发明所述的总氮（tn），是指氨氮（nh4⁺-n\nh3-n）、硝态氮（no3^-）、亚硝态氮（no2^-）的总和。

本发明的技术方案是：

耐高氨氮异养硝化-好氧反硝化的苍白杆菌，其保藏号为cctccno:m2018028（已于2018年1月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学），分类命名为：ochrobacterumsp.tac-2，其16srdna序列如seqidno:1所示。

本发明所述的耐高氨氮异养硝化-好氧反硝化的苍白杆菌，属于苍白杆菌属。菌落直径1mm左右，半透明，突起，边缘整齐，表面有光泽，颜色呈白色透明，为革兰氏染色阴性。最佳生长温度为25～40℃，ph为6.5～7.5。

本发明所述的苍白杆菌tac-2对高氨氮、高盐度耐受能力强，以有机物为电子受体，nh4⁺为电子供体，将nh4⁺氧化成no2^-或no3^-；同时能够在好氧环境中，以有机物为电子供体，no2^-或no3^-为电子受体，将no2^-或no3^-还原为氮气。本发明所述的苍白杆菌tac-2可应用于高氨氮废水、高盐度废水中高效除氮处理。

本发明所述的苍白杆菌，本申请中命名为苍白杆菌ochrobacterumsp.tac-2，是从养猪场沼液中分离得到的，菌株dna的测序委托大连宝生物公司完成，其16srdna序列如seqidno:1所示。通过对该菌株进行的一系列生理生化以及工艺优化试验表明，本发明提供的苍白杆菌ochrobacterumsp.tac-2，可完全去除高氨氮废水、高盐度废水中的总氮，主要优点如下：

（1）苍白杆菌ochrobacterumsp.tac-2可以各种氨基酸、有机酸和碳水化合物为碳源和氨氮为唯一氮源生长，克服了传统硝化细菌生长缓慢、世代周期长、生物量浓度较低、环境适应性差等缺点。

（2）苍白杆菌ochrobacterumsp.tac-2可在完全好氧环境中去除总氮（氨氮（nh4⁺）、硝态氮（no3^-）、亚硝态氮（no2^-），解决了传统生物脱氮工艺好氧厌氧结合的两段式生物脱氮限制。

（3）苍白杆菌ochrobacterumsp.tac-2具有高氨氮、高盐度耐受性，可高效去除高氨氮废水、高盐度废水中的总氮。

（4）苍白杆菌ochrobacterumsp.tac-2扩大培养所需的培养基成分简单，成本低。特别适用于高氨氮废水的生物脱氮，可以广泛推广应用。

本发明解决了现有高氨氮废水生物脱氮技术中处理效果差、工艺复杂、成本高等问题。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1为苍白杆菌ochrobacterumsp.tac-2在氨氮浓度为400mg/l时对氨氮和总氮的去除曲线；

图2为苍白杆菌ochrobacterumsp.tac-2对不同浓度氨氮的去除曲线。

图3为苍白杆菌ochrobacterumsp.tac-2在不同盐度下对氨氮的去除曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。

1.实验材料

苍白杆菌培养基的组成如下：(nh4)2so42g/l，na3c6h5o710.64g/l，维氏盐溶液50ml/l，其中维氏盐溶液(g/l)：k2hpo45.0，mgso47h2o2.5，nacl2.5，feso47h2o0.05，mnso44h2o0.05。调节苍白杆菌培养基ph值至7.0。

碳源除了乙酸钠外，苍白杆菌还可以直接利用葡萄糖、蔗糖、柠檬酸钠等常见碳源。

其余试剂为市售分析纯产品。

养猪场沼液样品取自重庆木犴生猪养殖厂（重庆市巴南区姜家镇蔡家寺村）。

2.菌种富集与优化实验

1）富集培养：取2ml养猪场沼液接种于装有100ml灭菌后的肉汤培养基的250ml三角瓶中，充分摇匀，30℃、150r·min-1条件下培养，2d后4℃冰箱保存。然后按接种量为2%，将富集微生物接种于装有100ml灭菌后的苍白杆菌培养基的250ml三角瓶中。上述相同条件下传代培养，共富集传代5次。

2）纯菌分离：用已冷却的无菌蒸馏水对上述富集菌液进行10倍系列稀释，制成稀释度为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7的稀释液。采用倾注法进行苍白杆菌培养基培养。将平板置于生化培养箱中，30℃培养2d。将长势好的菌种进行多次传代，纯化。

3）优化实验：利用纯菌株制备一定浓度的菌悬液，将菌液按2%接种装有100ml灭菌后的苍白杆菌培养基的250ml锥形瓶中，充分摇匀，30℃、150r·min-1条件下培养。设置氨氮浓度分别设为100mg/l、200mg/l、400mg/l、600mg/l、800mg/l、1000mg/l；盐度分别设为：1%、2%、3%、4%、5%；只改变单一因素，间隔一段时间检测菌液浓度以及氨氮浓度。

3.菌种鉴定实验

使用qiaquickgenomicdnabufferset进行pcr扩增目的片段。取5μl进行3%琼脂糖凝胶电泳，使用切胶回收目的片段进行dna测序。dna的测序委托大连宝生物公司完成。以seqforward、seqreverse、seqinternal为引物进行dna测序。16srrna扩增采用广谱引物f27(-agagtttgatcatggctcag)其序列如seqidno:2所述，以及r1492(-tacggttaccttgttacgactt)，其序列如seqidno:3所述。

4.检测方法

菌液的od值采用uv2000分光光度计检测，波长为600nm。各污染物的监测分析方法参考《水和废水监测分析方法》（第四版，中国环境科学出版社，2002）。

实施例1苍白杆菌ochrobacterumsp.tac-2在氨氮浓度为400mg/l时的氨氮和总氮去除能力测定实验

配置氨氮浓度为400mg/l的苍白杆菌培养基，取100ml苍白杆菌培养基于250ml锥形瓶中，将其在121℃条件下高温蒸汽灭菌30min，待冷却后用微量移液器向瓶中加入2ml苍白杆菌菌液（od600nm为1-2），采用封口膜密封，放入摇床设定在30℃、150r·min^-1条件下培养，然后每隔24h测定菌液的od600nm值确定菌体生长情况，同时测定培养基中氨氮和总氮的含量，确定氨氮和总氮的去除效果。由图1可知，苍白杆菌ochrobacterumsp.tac-2完全去除400mg/l氨氮，总氮去除率90%以上。

实施例2苍白杆菌ochrobacterumsp.tac-2对不同浓度氨氮去除效果实验

分别配置氨氮浓度为100mg/l、200mg/l、400mg/l、600mg/l、800mg/l、1000mg/l的苍白杆菌培养基，分别取100ml不同氨氮浓度的苍白杆菌培养基于250ml锥形瓶中，将其在121℃条件下高温蒸汽灭菌30min，待冷却后用微量移液器向瓶中加入2ml苍白杆菌菌液（od600nm为1-2），采用封口膜密封，放入摇床设定在30℃、150r·min^-1条件下培养，然后每隔24h测定菌液的od600nm值确定菌体生长情况，同时测定培养基中氨氮的含量，确定氨氮的去除效果。由图2可知，当氨氮浓度小于600mg/l时，氨氮去除率100%，苍白杆菌ochrobacterumsp.tac-2最大氨氮耐受浓度可达800mg/l，氨氮去除率为34.2%，这主要是由于高浓度氨氮培养基中含有大量的游离氨，抑制菌株的活性。

实施例3苍白杆菌ochrobacterumsp.tac-2在不同盐度条件下高氨氮去除效果实验

分别配置盐度为1%、2%、3%、4%、5%的苍白杆菌培养基，各苍白杆菌培养基的氨氮浓度均为400mg/l，分别取100ml不同盐度的苍白杆菌培养基于250ml锥形瓶中，将其在121℃条件下高温蒸汽灭菌30min，待冷却后用微量移液器向瓶中加入2ml苍白杆菌菌液（od600nm为1-2），采用封口膜密封，放入摇床设定在30℃、150r·min^-1条件下培养，然后每隔24h测定菌液的od600nm值确定菌体生长情况，同时测定培养基中氨氮的含量，确定氨氮的去除效果。由图3可知，当盐度小于2%时，氨氮去除率85.7%，苍白杆菌ochrobacterumsp.tac-2最大盐度耐受浓度可达2%，氨氮去除率为33.8%，其原因是由于高盐度培养基渗透压偏高，微生物细胞质壁分离，使其生长受到阻碍甚至停止。

本发明从养猪场沼液筛选得到的苍白杆菌tac-2对高氨氮、高盐度耐受能力强，并且可以利用有机碳源为唯一碳源，氨氮为唯一氮源进行新陈代谢，通过异养硝化-好氧反硝化作用将高氨氮完全去除，同时实现总氮去除。该菌株也能以硝酸盐氮、亚硝酸盐氮为唯一氮源，通过好氧反硝化作用将其高效去除。该菌株应用于高氨氮废水、高盐度废水的处理，可实现单一好氧条件下氨氮、总氮的同步去除，有助于解决高氨氮条件下生物脱氮的难题，应用前景广阔。

以上列举的仅是本发明的三个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110>重庆理工大学

<120>一种耐高氨氮异养硝化-好氧反硝化的苍白杆菌及其应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>425

<212>dna

<213>苍白杆菌(ochrobacterumsp.tac-2的16srdna序列)

<400>1

gtggggaatattgcacaatgggggaaaccctgatgcagcaacgccgcgtgagtgatgacg60

gtcttcggattgtaaagctctgtctttggggacgataatgacggtacccaaggaggaagc120

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gactgtaactgacgctgaggctcgaaagcgtggggagcaaacaggattagaaacccctgt420

agtcc425

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

agagtttgatcatggctcag20

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tacggttaccttgttacgactt22