本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及多聚半乳糖醛酸酶及其突变体tepg28b_n85e/s86w和应用。
背景技术：
果胶酶(pectinase)是指能分解果胶类物质的一类酶的总称，广泛分布于高等植物和微生物。果胶酶一般分为四大类：果胶水解酶，果胶裂解酶和果胶酯酶和原果胶酶等。果胶酶在食品应用中非常广泛，如果汁澄清，提高果蔬出汁率，改善酒的色泽品质，增加酒的香气。此外，果胶酶在纺织，饲料发酵和洗涤等行业有重要作用。果汁出汁方面，果胶酶可分解植物细胞壁上的多聚糖类基质，使果蔬汁自流量增加，也可以将果胶分解成果胶酸小分子物质，或者控制果汁中的浸渍作用、脱去果胶，软化果肉组织,降低粘度，改善压榨性能，提高果蔬的出汁率。纺织工艺方面，有研究发果胶酶预处理可以除去部分覆盖在纤维表面的抽出物,从而暴露出更多的碳水化合物和木素,提高其后过氧化氢漂白的效果，并且，纸张的性能也得到了很明显的改善。在饲料行业，果胶酶可提高肉鸡肠道消化酶的活性，改善空肠组织形态，提高其营养物质消化率。
天然果胶酶来源于动植物，但产量低，提取困难且成本高，不满足实验和生产的需求，微生物因具有生长条件简单、生长速度快，代谢过程特殊和分布广，纯化简单等特点而成为果胶酶的重要来源。因此利用微生物开发、挖掘和研究优质的果胶酶资源具有很大的经济意义，本发明通过分子改良手段，对多聚半乳糖醛酸酶进行改造，获得高比活、高催化效率突变菌株，为其他酶类提高催化效率方面分子改良也提供了依据。
技术实现要素：
本发明提供了一种多聚半乳糖醛酸酶，并进一步将野生型t3loop区上第85位的天冬酰胺突变成谷氨酸和第86位的丝氨酸突变成色氨酸从而获得高催化效率的突变体。
本发明的目的是提供一种高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体。
本发明的再一目的是提供编码上述多聚半乳糖醛酸酶突变体的基因。
本发明的另一目的是提供包含上述突变体基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述突变体基因的重组菌株。
根据本发明的母本多聚半乳糖醛酸酶所述氨基酸序列如seqidno.1所示。
根据本发明的高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体氨基酸序列如seqidno.2所示。
本发明还提供编码上述多聚半乳糖醛酸酶的基因。
本发明还提供编码上述多聚半乳糖醛酸酶突变体的基因。
本发明还提供了包含上述多聚半乳糖醛酸酶基因或多聚半乳糖醛酸酶突变体基因的重组载体。
本发明还提供了包含上述多聚半乳糖醛酸酶基因或多聚半乳糖醛酸酶突变体基因的重组菌株。
本发明还提供了一种制备高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体的方法，包括以下步骤：
1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组多聚半乳糖醛酸酶表达；
3)回收并纯化所表达的高催化效率多聚半乳糖醛酸酶n85e/s86w；
本发明提供的多聚半乳糖醛酸酶突变体催化效率高，在此改造条件下，突变体n85e/s86w对多聚半乳糖醛酸的kcat/km比野生型催化效率提高，突变体的kcat/km提高了1.034倍；酶促反应最适温度不变和最适ph不变。
本发明还提供了包含上述多聚半乳糖醛酸酶突变体基因的重组载体，优选为ppic9r-n85e/s86w。
本发明还提供了上述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体的应用。运用基因工程手段来产业化生产多聚半乳糖醛酸酶。
本发明是从talaromycesleycettanusjcm12802获得到一个高温高比活内切多聚半乳糖醛酸酶tepg28b基因作为野生型后进行异源表达，通过定点突变获得催化效率高于野生型的突变菌株。本发明提供了一个新的高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体，可作应用于饲料、食品、纺织等工业。根据本发明的技术方案就可以实现利用分子改良手段生产性质优良适合工业应用的多聚半乳糖醛酸酶。
附图说明
图1显示母体多聚半乳糖醛酸酶以及突变体的最适温度。
图2显示母体多聚半乳糖醛酸酶以及突变体的最适ph。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株：pichiapastorisgs115，载体：ppic9。
2、酶类：内切酶购自fermentas公司，连接酶购自invitrogen公司，fastmutagenesissystem购自北京全式金生物技术有限公司
3、试剂：底物多聚半乳糖醛酸购买自sigma公司，其它都为国产试剂。
4、培养基：
(1)产酶培养基：30g/l麦麸，30g/l玉米芯粉，30g/l豆粕，5g/l(nh4)so4，1g/lkh2po4，0.5g/lmgso4·7h2o，0.01g/lfeso4·7h2o，0.2g/lcacl2于1l去离子水中，121℃条件下灭菌处理20min
(2)大肠杆菌培养基lb(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％naci，ph7.0)。
(3)ypd培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖
(4)md固体培养基：2％葡萄糖，1.5％琼脂糖，1.34％ynb，0.00004％biotin
(5)bmgy培养基；1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％ynb，0.000049<biotin，1％甘油(v/v)。
(6)bmmy培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与bmgy相同，ph4.0。
实施例1多聚半乳糖醛酸酶以及高催化效率的突变体的编码基因的克隆
以t.leycettanusjcm12802克隆的基因tepg28b，然后构建起重组质粒ppic9r-tepg28b，以该质粒为模板，设计引物，然后进行扩增，获得特异性点突变基因n85e/s86w。
表1.高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体所用特异性引物
实施例2高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体的制备。
对重组质粒ppic9r-tepg28b进行特异性点突变扩增获得高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体质粒ppic9r-n85e/s86w并转化毕赤酵母gs115，获得重组酵母菌株gs115-n85e/s86w。
取含有重组质粒的gs115菌株，接种于300mlbmgy培养基的1l三角瓶中，置于30℃，220rpm摇床培养48h；后将培养液3000g离心5min，弃上清，沉淀用100ml含有0.5％甲醇的bmmy培养基重悬，并再次置于30℃，220rpm条件下诱导培养。每隔12h补加0.5ml甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5％，同时取上清用于酶活性检测。
重组高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体n85e/s86w最适温度为70℃，与野生型母本保持一致，最适ph较野生型相比向右偏移一个单位，由3.5变为4.0，n85e/s86w突变体对多聚半乳糖醛酸的kcat/km比野生型都提高，突变体n85e/s86w的kcat/km较野生型相比提高了1.034倍。
实施例3重组高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体和母本野生型的活性分析
一、采用dns法都该发明的多聚半乳糖醛酸酶进行活性分析。具体方法如下：在给定的ph、温度条件下，1ml的反应体系包括100μl适当的稀释酶液，900μl底物，反应30min，加入1.5mldns终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定od值。多聚半乳糖醛酸酶活性单位定义：在70℃，ph3.5条件下，每分钟内催化水解底物释放出1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活单位。
二、重组高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体和母本野生型的性质测定
1、重组高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体和母本野生型的最适温度测定方法如下:
重组高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体和母本野生型的最适温度的测定为在0.1mol/l柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(ph3.5)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。酶反应最适温度测定结果(图1)表明，重组高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体(70℃)和野生型(70℃)的最适温度一致。
2、重组高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体和母本野生型的ph测定方法如下
将纯化的重组高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体和母本野生型在不同的ph下进行酶促反应以测定其最适ph。底物多聚半乳糖醛酸用不同ph的0.1mol/l柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中70℃下进行多聚半乳糖醛酸酶酶活力测定。结果(图2)表明，突变体n85e/s86w最适作用ph为4.0。
3、组高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体和母本野生型的动力学参数测定
组高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体和母本野生型比活测定方法如下：
以0.66％的多聚半乳糖醛酸作为底物，在最适条件下(ph3.5，70℃)反应10min,进行活力测定。
测定tepg28b及突变体动力学常数的反应时间为5min,以浓度范围0.4～5mg/ml的聚半乳糖醛酸为底物，ph3.5，温度70℃条件下测量酶活，利用软件graphpadprism5的酶动力学双曲线拟合计算得到km及vmax的值，利用excel软件计算km值及vmax。组高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体和母本野生型在最适条件下的km、vmax、kcat、kcat/km值分别如表2所示。
表2重组高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体和母本野生型动力学参数
序列表
<110>中国农业科学院饲料研究所
<120>多聚半乳糖醛酸酶及其突变体tepg28b_n85e/s86w和应用
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>376
<212>prt
<213>t.leycettanusjcm12802
<400>1
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