本发明属于生物核酸分子检测技术领域，涉及重组酶依赖扩增技术检测方法(rpa)与胶体金试纸检测方法(gica)相结合的实现猪伪狂犬病疫苗毒与野毒鉴别检测的方法及试剂盒。
背景技术：
动物检验检疫问题成为了近些年国际社会关注的热点问题，我国是畜牧养殖业大国，生猪养殖与消费占全球第一。每年因母猪流产的病毒病就造成养猪业造成巨大经济损失。目前应用于猪病毒性传染病的检测方法有以下几种：传统聚合酶链式反应(pcr)、荧光定量pcr、病毒分离培养鉴定法、电镜观察、酶联免疫吸附试验、免疫荧光试验等。现实中临床上发病猪往往以多种病毒混合感染为主，上述方法检测成本高，操作不便，不利于同时多批量现场快速检测应用。
重组酶聚合酶扩增技术(rpa)，该技术由英国twistdxinc公司开发出来，它是一种新的核酸分子快速恒温扩增技术，被称为是可以替代pcr的核酸检测技术。该技术主要包括：在37℃恒温下，该重组酶可与引物dna紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板dna上搜索到与之完全互补的序列时，在单链dna结合蛋白(single-strandeddnabinding，ssb)的帮助下，使模板dna解链，并在dna聚合酶的作用下，形成新的dna互补链。反应产物也是以指数级增长，通常在1小时内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用。
猪伪狂犬病毒的分子检测方法有pcr、荧光定量pcr、lamp方法，猪伪狂犬病毒的免疫学检测方法有elisa和胶体金试纸检测方法。其中，在现有的恒温核酸体外扩增方法中，环介导基因恒温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)是一种相对比较成熟的新技术。lamp扩增方法的核心是使用链置换型dna聚合酶，当dna双链在65℃处于动平衡状态时，反应中的引物可通过类似于滚环复制的链替换反应，在同一条链上产生互补序列，周而复始形成大小不一的扩增产物。lamp扩增方法的特点是需使用4-6条引物，在一个蛋白的作用下，并在65℃的恒温条件下进行dna扩增反应。其反应灵敏度高于巢式pcr,并且特异性高。若使用荧光染料，还可以直接用肉眼观察到反应的扩增产物。
缺点1：lamp方法使用的引物较复杂,必须用特殊的软件设计4-6个引物，设计难度大，易造成扩增产物引物二聚体过多的缺点。
缺点2：lamp方法易发生非特异性扩增，由于其同一反应中引物长度相对较短且数量相对较多，所以易造成引物的错配率增加，从而造成假阳性反应的缺点。
缺点3：lamp方法得到的扩增产物是一些大小不等的片段，无法直接克隆和测序，只能用于判定目的基因是否存在，这也是lamp方法最大的局限性。
缺点4：因为引物数量较多，lamp方法只能单纯扩增反应，不能进行双重扩增核酸鉴别诊断同一病原的不同基因型，如猪伪狂犬病毒的野毒与疫苗毒区分。
相应的术语：prv(porcinepseudorabiesvirus,猪伪狂犬病毒)；rpa(recombinasepolymeraseamplification,重组酶聚合酶扩增技术)；lamp(loop-mediatedisothermalamplification，环介导基因恒温扩增技术)；gica(colloidal-goldimmunochromatographyassay,胶体金免疫层析技术)。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种能够现场快速鉴别检测猪伪狂犬病毒核酸的实用性检测方法。所述的核酸定性检测方法中使用的引物和探针均为针对猪伪狂犬病毒(prv)特征性片断区域。本发明能够同时鉴别诊断猪伪狂犬病毒的疫苗毒与野毒，特异性极高。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种将rpa技术与gica技术联用建立鉴别诊断猪伪狂犬病毒的现场快检方法，其主要方案在于：所述的核酸现场快速鉴别诊断技术包括针对猪伪狂犬病毒特征片段的引物和探针，所述的引物和探针选自以猪伪狂犬病毒(prv)特征片段。所述引物和探针均为根据prv特性设计，应用人工化学法合成并加入了特定大小的dna指纹序列以及分子标记。
较为具体地，本发明提供了一种用于检测猪伪狂犬病毒ul52基因和/或猪伪狂犬病毒ge基因的试剂盒，所述试剂盒包括：用重组酶聚合酶扩增技术扩增猪伪狂犬病毒ul52基因序列和/或猪伪狂犬病毒ge基因序列的试剂，用胶体金试纸显示所述猪伪狂犬病毒ul52基因扩增产物和/或所述猪伪狂犬病毒ge基因扩增产物的试剂，以及胶体金试纸。
在一些实施方案中，用重组酶聚合酶扩增技术扩增猪伪狂犬病毒ul52基因序列的所述试剂包括：
针对所述猪伪狂犬病毒ul52基因的第一方向引物ul52primer1；
针对所述猪伪狂犬病毒ul52基因的中间探针ul52probe，所述ul52probe的上游连接有第一标记分子、下游连接有防止聚合反应的保护标签，中间包含能够被具有dna损伤修复活性的酶识别并切除的人工碱基类似物；
针对所述猪伪狂犬病毒ul52基因的第二方向引物ul52primer2，所述ul52primer2的上游连接有第二标记分子；
其中，所述ul52primer1与所述ul52probe针对所述ul52基因的同一个方向，且针对所述ul52基因所述ul52probe位于所述ul52primer1与所述ul52primer2之间；和/或用重组酶聚合酶扩增技术扩增猪伪狂犬病毒ge基因序列的所述试剂包括：
针对所述猪伪狂犬病毒ge基因的第一方向引物geprimer1；
针对所述猪伪狂犬病毒ge基因的中间探针geprobe，所述geprobe的上游连接有第一标记分子、下游连接有防止聚合反应的保护标签，中间包含能够被具有dna损伤修复活性的酶识别并切除的人工碱基类似物；
针对所述猪伪狂犬病毒ge基因的第二方向引物geprimer2，所述geprimer2的上游连接有第三标记分子；
其中，所述geprimer1与所述geprobe针对所述ge基因的同一个方向，且针对所述ge基因所述geprobe位于所述geprimer1与所述geprimer2之间；并且
其中，所述第二标记分子和所述三标记分子是不同结合特性的标记分子。
在一些实施方案中，所述胶体金试纸包括加样垫、对照线、1号检测线和/或2号检测线；
所述加样垫含有胶体金颗粒标记的所述第一标记分子特异结合物；
所述对照线包被有所述第一标记分子特异结合物的特异结合物；
所述1号检测线包被有第二标记分子特异结合物；
所述2号检测线包被有第三标记分子特异结合物；
在一些实施方案中，所述第一标记分子为荧光分子fam，所述第一标记分子特异结合物为抗fam抗体；
所述第二标记分子为生物素，所述第二标记分子特异结合物为链霉亲和素；
所述第三标记分子为地高辛，所述第三标记分子特异结合物为地高辛抗体；
所述第一标记分子特异结合物的特异结合物是抗fam抗体的抗体；
所述防止聚合反应的保护标签为c3-spacer；以及
能够被具有dna损伤修复活性的酶识别并切除的所述人工碱基类似物为四氢呋喃。
在一些实施方案中，所述ul52primer1的序列为:
5’-gcgcgccatggagtacttttacacgtcccagtgccc-3’；
所述ul52primer2的序列为:
5’-[biotin]-acctcgtcaacgtcaacctgggcagcctctcggagct-3’；
所述ul52probe的序列为:
5’-[fam]-gcgctcagcgaggccgagctcgagttctaccgctt-[thf]-ctcttcgccttcctct-[c3-spacer]-3’；
所述geprimer1的序列为:
5’-gacgacgcccgggcggctgtttgtgctggcgctggg-3’；
所述geprobe的序列为:
5’-[fam]-tgctcccggcgccgggcggcctcgcggccgttcc-[thf]-ggtgccgacgcgggcgc-[c3-spacer]-3’；
所述geprimer2的序列为:
5’-[dig]-cgtcgtagtagtcctcgtgcgtgggcaggctggtgt-3’；
其中，biotin表示生物素分子，dig表示地高辛分子，fam表示荧光分子fam，thf代表四氢呋喃分子。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括nfo酶；重组酶uvsx；辅助蛋白uvsy；gp32蛋白；bsudna聚合酶；dntps；二硫苏糖醇；三磷酸腺苷；三甲基甘氨酸；聚乙二醇20000；肌酸激酶；磷酸激酶；醋酸钾；醋酸镁。
本发明还提供了一种用于检测猪伪狂犬病毒ul52基因和/或猪伪狂犬病毒ge基因的方法，所述方法用于非诊断目的，所述方法包括用重组酶聚合酶扩增技术扩增猪伪狂犬病毒ul52基因序列和/或猪伪狂犬病毒ge基因序列，然后用胶体金试纸显示所述猪伪狂犬病毒ul52基因扩增产物和/或所述猪伪狂犬病毒ge基因扩增产物。
在一些实施方案中，所述方法包括如下步骤：
(1)提取可能包含猪伪狂犬病毒ul52基因和/或猪伪狂犬病毒ge基因的生物材料中的核酸；
(2)使用如权利要求2-6中任一项所述的ul52primer1、ul52probe与ul52primer2，和/或geprimer1、geprobe、geprimer2对步骤(1)中所得到的核酸进行重组酶聚合酶扩增；
(3)使用如权利要求1-6中任一项所述的胶体金试纸对步骤(2)所得到的扩增产物进行显示。
在一些实施方案中，所述步骤(2)包括如下子步骤：
(i)取2μl步骤(1)所获得的核酸提取样本加入0.2ml离心管，再加入45.5μlrpa扩增反应液；100ng/μl重组酶uvsx；50ng/μl辅助蛋白uvsy；100ng/μlgp32蛋白；25ng/μlbsudna聚合酶；0.5mmdntps；1mm二硫苏糖醇；3mm三磷酸腺苷；100mm三甲基甘氨酸,ph8.0；5％聚乙二醇20000；100ng/μl肌酸激酶；20mm磷酸激酶；80mm醋酸钾；
其中所述rpa扩增反应液中有含有特定核酸扩增与检测用的标记引物与标记探针，具体成份包括50pmul52primer1,50pmul52primer2,10pmul52probe,50pmgeprimer1,50pmgeprimer2,10pmgeprobe,10unitsnfo酶；
(ii)将上述反应液混合均匀后，再加入2.5μl的100mmol/l醋酸镁，混匀后、置于38℃的恒温金属浴中温浴15-30min,获得的扩增反应产物作为待检扩增样品。
在一些实施方案中，所述步骤(3)包括如下子步骤：
(a)取胶体金检测卡于室温平衡；
(b)加样，取步骤(2)中的扩增产物用纯水稀释后滴加于所述胶体金检测卡的样品孔中；
(c)读取结果。
解决问题1：提升恒温核酸扩增反应的特异性问题，rpa反应只使用一对引物且引物相较传统pcr和lamp方法中的引物长度长十个碱基左右，根据碱基互补的原则可知，引物越长则特异性越高，因此，采用rpa方法将大幅提升核酸扩增反应的特异性和可靠性。分别以猪伪狂犬病毒的ul52和ge基因为靶基因，设计两套鉴别用引物和特异性标记探针，实现同一反应中同时扩增ul52和ge基因片段。
解决问题2：解决prv现场快速鉴别检测的问题，将rpa扩增反应的结果与gica试纸卡检测相结合，进一步提升检测的方便性，并使扩增检测结果直观化，可直接区分扩增ul52和ge基因片段的检测结果，分别以ul52基因为内参代表疫苗毒和/或ge基因代表野毒设计对应检测线，以此实现猪伪狂犬病毒的鉴别检测。
解决问题3：实现猪伪狂犬病毒的现场快速分子检测，rpa技术为恒温条件下扩增核酸的方法，因此不需要pcr仪，解决了pcr贵重成本高的缺点；将rpa扩增反应时间在二十分钟左右即可完成，与pcr方法相比节约了大量时间；rpa方法与gica试纸检测卡相结合使和使检测结果可直接现场判读，无需要依赖贵重的凝胶成像系统和电脑等设备，从而实现猪伪狂犬病毒的分子检测现场化、快速化。
本发明相比现有技术的有益效果为：
1、本发明能够同时鉴别检测猪伪狂犬病毒的疫苗毒与野毒。
2、本发明采用针对伪狂犬病毒核酸的特异性长引物和探针杂扩增后产物提高了检测结果的特异性与可靠性。
3、本发明省去了原有的pcr或lamp扩增产物需要经过凝胶电泳后进行结果的判定的过程，将rpa扩增与gica试纸检测卡相结合使和使检测结果可直接现场判读，从而实现猪伪狂犬病毒的分子检测现场化、快速化。
4、本发明实现猪伪狂犬病毒的现场快速分子检测，rpa技术为恒温条件下扩增核酸的方法，因不需要pcr仪，解决了pcr贵重成本高的缺点；
5、本发明因rpa扩增反应时间在二十分钟左右即可完成，与pcr方法相比节约了大量时间；
有益效果1：rpa技术能够在15-20分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件装备的要求不高，特别适合用于食品安全、兽医、生物防御、农业等领域的现场快速检测和诊断。一般来讲，传统常规pcr必须经过变性、退火、延伸三个步骤实现核酸扩增过程，pcr仪本质上就是一个控制温度升降的设备。rpa反应的最适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在常温下即可进行。能大大加快扩增的速度。使快速检测成为可能。
有益效果2：rpa方法由于不需要温控设备，rpa可以真正实现便携式的快速核酸检测。rpa检测的灵敏度很高，能够将痕量的核酸(尤其是dna)模板扩增到可以检出的水平，从单个模板分子得到大约1012扩增产物。rpa不需要复杂的样品处理，适用于无法提取核酸的实地检测。
有益效果3：rpa既可以扩增dna也可以扩增rna，无需额外的cdna合成步骤。不仅可以对扩增产物进行终点检测，还可以对扩增产物通过胶体金免疫层析试纸卡进一步放大检信号后直接读取结果。
附图说明
图1示出了rpa扩增原理示意图。
图2示出了nfo-rpa扩增产物经gica试纸卡读取的原理示意图。
nfo-rpa是在rpa扩增体系基础上再加入nfo酶(核酸内切酶iv)和特异性分子标记核酸探针及末端修饰的下游扩增引物，如图2所示，分子标记核酸探针设计原理是在核酸探针5’端标记fam(荧光素分子)，中间引入异源核苷酸残基thf(四氢呋喃)，核酸探针3’端添加阻断物c3-spacer以防止诱导bsu聚合酶扩增非目的dna。只有当探针与dna链互补结合后，具有dna损伤修复活性的nfo酶识别特异位点thf并将其切除，bsu聚合酶延此位点继续扩增延伸，最终形成同时具有上游5’端标记fam探针和下游5’端标记biotin(生物素)或dig(地高辛)的特异性扩增子产物。
gica试纸卡上检测区分别包被有biotin特异性接合物(biotin-ligand)对应位置为1号检测线、抗dig抗体对应2号检测线、抗抗fam抗体(anti-anti-fam)对应位置为对照c线。
当nfo-rpa扩增子产物滴加于加样槽后，加样垫上的胶体金颗粒标记的抗fam抗体将随着液体样品流动的同时特异性地结合nfo-rpa扩增子的5’fam分子，同时该扩增子的另一端将分别被1号线或2号线包被分子特异性捕获形成夹心式的复合物，未特异性结合到扩增子的胶体金颗粒标记的抗fam抗体被对照c线处包被的抗抗fam抗体结合形成对照检测线。
图3示出了nfo-rpa-gica联用后试纸卡读取判定方法示意图。
当nfo-rpa扩增子产物滴加于加样槽后，10分钟内进行检测结果判定，判定方法为：(1)当对照c线出现证明实验有效，此时1、2检测线同时出现的情况下证明有prv野毒检出判定为阳性结果；(2)当对照c线出现证明实验有效，此时仅1号检测线出现的情况下证明有prv疫苗毒检出判定为阳性结果；(3)当对照c线出现证明实验有效，此时1、2检测线均不出现时证明prv疫苗毒和野毒均未检出判定为阴性结果；(4)当对照c线不出现时证明实验无效，检测结果无意义。
图4示出了nfo-rpa-gica试纸卡检测灵敏度实验结果。
从上到下,第1个试纸卡为空对照，以空质粒pmd18-t为模板经nfo-rpa扩增产物的gica检测结果；第2-5个试纸卡，以分别含有prvul52基因和ge基因的pmd18-t-ul52、pmd18-t-ge质粒经稀释调整为五个相同浓度即3.6×10、3.6×102、3.6×103、3.6×104、3.6×105copy/μl为模板，经rpa-gica扩增后的gica检测结果。
图5示出了prvul52基因pcr检测灵敏度对照实验结果。
图示凝胶浓度为1.5％；1号泳道代表空对照模板为1×105copy/μlpmd18-t质粒；2-6号泳道分别代表浓度为3.6×10、3.6×102、3.6×103、3.6×104、3.6×105copy/μlpmd18-t-ul52质粒模板经pcr扩增灵敏度检测结果。m代表dnamarkerdm2000。
图6示出了prvge基因pcr检测灵敏度对照实验结果。
图示凝胶浓度为1.5％；1号泳道代表空对照模板为1×105copy/μlpmd18-t质粒；2-6号泳道分别代表浓度为3.6×10、3.6×102、3.6×103、3.6×104、3.6×105copy/μlpmd18-t-ge质粒模板经pcr扩增灵敏度检测结果。m代表dnamarkerdm2000。
图7示出了nfo-rpa-gica试纸卡检测特异性实验结果。
从上到下,第1个试纸卡为prv野毒病毒核酸检测结果；第2个试纸卡为prv疫苗病毒核酸检测结果；第3个试纸卡为猪瘟病毒(csfv)核酸检测结果；第4个试纸卡为猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)核酸检测结果；第5个试纸卡为猪圆环病病毒2型(pcv2)核酸检测结果；第6个试纸卡为猪细小病毒(ppv)核酸检测结果；第7个试纸卡为猪流行乙型脑炎病毒(pjev)核酸检测结果。
图8示出了prvul52基因pcr检测特异性对照实验结果。
图中凝胶浓度为1.5％，m代表dnamarkerdm2000；1号泳道为疫苗毒prvul52基因pcr检测结果，2-6号泳道分别为csfv、prrsv、pcv、ppv和pjev核酸pcr对照。
图9示出了prvge基因pcr检测特异性对照实验结果。
图中凝胶浓度为1.5％，m代表dnamarkerdm2000；1号泳道为疫苗毒prvge基因pcr检测结果，2-6号泳道分别为csfv、prrsv、pcv、ppv和pjev核酸pcr对照。
具体实施方式
为了更好的解释本发明的技术方案，下面结合附图详细介绍本发明的实施例。以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的固定或限制。若未特别指明，实施例中所用的技术特征可以替换为具有在不背离发明构思前提下等同或相似功能或效果的其他本领域已知的技术特征。
1.发明构思
1.1猪伪狂犬病毒ul52基因概述
猪伪狂犬病(pseudorabies，pr)是由伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus，prv)引起的一种高度接触性传染病。prv属于疱疹病毒科、甲型疱疹病毒亚科、水痘病毒属成员。病毒粒子为圆形、直径150nm～180nm。病毒结构由四部分组成，包括芯髓、衣壳、中间质层和囊膜。prv基因组为大小约150kb的线形双链dna分子。prv的基因组包括一个独特的长区序列(ul)和短区序列(us)，在us两侧存在着末端重复序列(trr)和内部重复序列(irs)。prv基因根据它们所在的区域和发现的顺序命名，但也可根据其编码的蛋白命名。位于ul区的非结构蛋白基因包括能够与复制起点结合的ul9，编码dna聚合酶的ul30，编码解旋酶的ul52以及参与转录调节的ul54等。经blast序列比对分析发现编码解旋酶的ul52基因部分区域相对极为保守，与其它复制必须编码基因相比其保守性较高，如已报道的prv毒力相关因子编码基因gb、gd等，因此，选取ul52基因作为prv特异性诊断的靶基因。目前，尚未见关于利用ul52基因作为prv诊断靶位基因的报道。
1.2猪伪狂犬病毒ge基因概述
prv的基因组共编码16个膜蛋白，11个膜蛋白是被o联或n联糖所修饰，分别命名为gb、gc、gd、ge、gg、gh、gi、gk、gl、gm和gn，还有4种蛋白没有被糖基化(ul20、ul43、us9、ul24和ul34)。其中ge、gi并不是病毒增殖所必需的，但它们是prv主要的毒力基因。当ge缺失后，虽然会导致prv无法入侵到动物的三级神经元，但并不影响prv侵入宿主细胞及病毒的免疫原性。因此，利用prvge基因的可缺失特点，众多的ge基因缺失疫苗被开发出来被广泛应用于当前的养殖行业中。目前，我国市售的应用最为广泛的以prv弱毒冻干疫苗(bathar-k61株)，一种ge/gi双基因缺失弱毒疫苗为代表，其基因缺失阻断了弱毒株毒性恢复的可能性，在很大程度上提高了疫苗的安全性。该弱毒活疫苗是最早的通过野毒株分离，并经非猪源细胞反复传代，加入突变剂或适应鸡胚后在较高的培养温度下，细胞反复传代培养所获得的。国内外，已经开发出多种ge基因缺失疫苗，为猪伪狂犬病的净化提供了有力工具。根据猪场使用ge基因缺失疫苗的情况结合必要的分子生物学监测手段，为该病的防控提供了重要科学依据。
1.3鉴别诊断的意义
基于上述内容可知，同时集成检测样本中猪伪狂犬病毒ul52基因和猪伪狂犬病毒ge基因对猪伪狂犬病的防控具有重要临床诊断意义。根据猪场使用猪伪狂犬病疫苗的实际情况，可对猪场是否感染伪狂犬野毒作出准确快速的判断。即第一种情况，在没有使用伪狂犬ge基因缺失疫苗的情况下，采用本方法检测到两种或至少一种基因就可以基本判断猪场存在伪狂犬病野感染。第二种情况，在使用了伪狂犬ge基因缺失疫苗情况下，采用本方法检测到ge基因阴性ul52基因阳性的猪只证明未发生伪狂犬病野毒感染，ge基因阳性ul52基因阴性的情况几乎不会发生；若检测出二者均为阴性可能预示着接种的失败，或产生保护性免疫后病毒颗粒的消除；若检测出二者均为阳性预示着已经发生伪狂犬病野毒感染。
1.4核心构思
rpa具有快、准、经济、可便携等特点，具体如下：
rpa技术能够在15-20分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件装备的要求不高，特别适合用于食品安全、兽医、生物防御、农业等领域的现场快速检测和诊断。一般来讲，传统常规pcr必须经过变性、退火、延伸三个步骤实现核酸扩增过程，pcr仪本质上就是一个控制温度升降的设备。rpa反应的最适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在常温下即可进行。能大大加快pcr的速度，达到了现场快速检测技术上的方便性要求。
rpa方法由于不需要温控设备，rpa可以真正实现便携式的快速核酸检测。rpa检测的灵敏度很高，能够将痕量的核酸(尤其是dna)模板扩增到可以检出的水平，从单个模板分子得到大约1012扩增产物。rpa不需要复杂的样品处理，适用于无法提取核酸的实地检测。
rpa既可以扩增dna也可以扩增rna，无需额外的cdna合成步骤。不仅可以对扩增产物进行终点检测，还可以对扩增产物通过胶体金免疫层析试纸卡进一步放大检信号后直接读取结果。
胶体金免疫层析检测技术(gica)的原理是将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。该方法的可靠性取决于，所采用的单克隆抗体、多元克隆抗体、抗原、半抗原、蛋白嵌合物及胶体金等原料的灵敏性及特异性等是否能达到最高的标准，此为金标试剂的质量之最重要的标准。
方便之处在于：
1.可直接取出将待检样品滴加到样品口后，在十分钟内出现检测结果，可肉眼直接判定。
2.试纸条在真空包装袋中保质期达半年以上。即开即用非常方便使用和携带。
3.试纸条可大规模批量生产方便检测标准化制定。
4.批量生产的试纸条可大降低经济成本，使现场检测成为可接受的常规诊断项目。
基于上述构思，本发明提供一种利用rpa技术鉴别诊断猪伪狂犬病毒的现场快检方法，包括的核心步骤为：
a、将疑似已经感染上述病毒的发病猪或死亡猪尸体内的血液、鼻腔分泌液体样本进行核酸提取处理，得到待测样品模板；
b、将所述的待测样品模板与rpa反应液混合恒温38℃20分钟条件下得到扩增产物；
c、胶体金检测试纸卡上分别设置猪伪狂犬病毒ul52和ge基因扩增产物的检测线，将所述的扩增产物稀释滴加到时胶体金检测试纸卡上10分钟内读取检测结果，进而判断猪只的感染状况。
技术关键点1：设计可特异性识别猪伪狂犬病毒ul52和ge基因的分子标记核酸探针和引物。
技术关键点2:优化反应条件将ul52和ge基因的分子标记核酸探针和引物与rpa试剂混合制成mastermix反应液实现便捷操作减少加样操作步骤降低反应污染概率。
技术关键点3：设计胶体金检测试纸卡(gica)中包被特异性捕获ul52和ge基因扩增产物上引入的分子标记，实现猪伪狂犬病毒的疫苗毒与野毒的鉴别检测。
2.引物的设计
为了实现上述目的，本发明针对猪伪狂犬病毒的ul52和ge基因设计引物和探针。经过对比来自于genbank中的jf797217.1、jf797219.1、jq809328.1、kj789182.1、kp098534.1、km189914.3、kp722022.1、km189912.1、kx423960.1、kt824771.1、kc981239.1的ul52和ge基因同源序列对比分析，确定保守核心区域并针对该区域设计引物和探针，以此作为检测猪伪狂犬病毒的通用性基因检测靶点。所有的引物和探针都均委托上海生物工程有限公司合成。
首先提供了一种利用rpa技术鉴别诊断猪伪狂犬病毒的现场快检方法的引物和探针，包括如下的序列组：
1)包括下述正向、反向引物和分子标记核酸探针的两组序列：
针对猪伪狂犬病毒ul52基因的正向引物、反向引物和分子标记核酸探针分别依次为：
ul52primer1(序列如seqidno.1所示):
5’-gcgcgccatggagtacttttacacgtcccagtgccc-3’
ul52primer2(序列如seqidno.2所示):
5’-[biotin]-acctcgtcaacgtcaacctgggcagcctctcggagct-3’
ul52probe(fam与thf之间部分序列如seqidno.3所示；thf与c3-spacer之间部分序列如seqidno.4所示):
5’-[fam]-gcgctcagcgaggccgagctcgagttctaccgctt-[thf]-ctcttcgccttcctct-[c3-spacer]-3’
以及
针对猪伪狂犬病毒ge基因的正向引物、反向引物和分子标记核酸探针分别依次为：
geprimer1(序列如seqidno.5所示):
5’-gacgacgcccgggcggctgtttgtgctggcgctggg-3’
geprimer2(序列如seqidno.6所示):
5’-[dig]-cgtcgtagtagtcctcgtgcgtgggcaggctggtgt-3’
geprobe(fam与thf之间部分序列如seqidno.7所示；thf与c3-spacer之间部分序列如seqidno.8所示):
5’-[fam]-tgctcccggcgccgggcggcctcgcggccgttcc-[thf]-ggtgccgacgcgggcgc-[c3-spacer]-3’
3.检测步骤
(1)样品预处理：
样本可为猪血清、鼻咽拭子、咽拭子、或是其他组织；①血清样品：收集5ml静脉血置10ml带垫圈的螺口塑料离心管中(不含抗凝剂)，以1，000g离心5-10分钟，分装100μl/管。②咽拭子和鼻咽拭子标本：咽拭子采集是用棉签适度用力擦拭双侧咽后壁部位；鼻咽试子采集是将棉签平行于上颚插入鼻孔吸收分泌物，拭抹双侧鼻孔。③病料组织：采集新鲜病料大小3～5mm3即可。
(2)病毒dna提取：
采用磁珠法快速提取方法进行，步骤如下：
针对组织样本，用剪子和镊子取3-5mm3的组织块放于1.5ml离心管底部，用研磨器迅速研磨至泥状，加入500μl裂解液(10mmol/ltris.cl(ph8.0)、10mmol/ledta、150mmol/lnacl、0.5％sds、100～200μg/ml蛋白酶k)，充分振荡混匀；
针对血浆、血清、腹水以及细胞培养物等液体样本直接取200μl加入1.5ml无核酸酶离心管，随后加入500μl裂解液(10mmol/ltris.cl(ph8.0)、10mmol/ledta、150mmol/lnacl、0.5％sds、100～200μg/ml蛋白酶k)，充分振荡混匀。
将样本混合物于65-70℃温浴裂解5分钟。
在离心管中加入10μl的充分混匀后的磁珠液(磁珠标记一层硅胶质膜，其反应原理是在高盐离子的条件下核酸和硅胶质膜靠正负电吸附力结合核酸，然后在低盐离子的环境中把核酸洗脱分离，达到核酸分离的目的)，室温下颠倒混匀10分钟。
将离心管置于磁力架上1分钟，使管内磁珠被吸附，用移液器移走管内液体，取下离心管。
加入500μl去蛋白漂洗液(ph8.0的50mmtris-hcl，200mmnacl、50％乙醇溶液)，使磁珠重新悬浮，将离心管置于磁力架上1分钟，用移液器移走管内液体，取下离心管。
加入500μl洗涤液(70％的乙醇溶液)，使磁珠重新悬浮，将离心管置于磁力架上1分钟，用移液器移走管内液体，取下离心管。
再加入500μl洗涤液(70％的乙醇溶液)，使磁珠重新悬浮，将离心管置于磁力架上1分钟，用移液器移走管内液体，同时保持离心管置于磁力架上，使磁珠继续被吸附，室温晾干5min。
从磁力架上取下离心管，加入50μl-100μl洗脱液(te缓冲液即ph8.010mmtris-hcl，1mmedta)，使磁珠重新悬浮，55℃温浴5分钟，其间轻轻晃动两次使核酸，提取的病毒基因组dna，充分洗脱。
将离心管轻离后置于磁力架上1分钟，使磁珠被吸附，将液体转移至新的1.5ml无rna酶离心管，作为扩增模板备用。
(3)rpa扩增反应
操作步骤如下：
取上述步骤(2)扩增模板2μl加入0.2ml离心管，再依次加入45.5μlrpa扩增反应液(该反应液中有含有特定核酸扩增与检测用的标记引物与标记探针，具体成份包括50pmul52primer1,50pmul52primer2,10pmul52probe,50pmgeprimer1,50pmgeprimer2,10pmgeprobe,10unitsnfo酶(核酸内切酶iv)；100ng/μl重组酶uvsx；50ng/μl辅助蛋白uvsy；100ng/μlgp32蛋白(ssb，单链dna结合蛋白)；25ng/μlbsudna聚合酶；0.5mmdntps；1mmdtt(二硫苏糖醇)；3mmatp(三磷酸腺苷)；100mmtricine(三甲基甘氨酸),ph8.0；5％peg20k(聚乙二醇20000)；100ng/μlcreatinekinase(肌酸激酶)；20mmphosphokinase(磷酸激酶)；80mmpotassiumacetate(醋酸钾)，将上述反应液混合均匀后，再加入2.5μl的rpa扩增反应启动液(成份为100mmol/l醋酸镁)，混匀后置于38℃的恒温金属浴中温浴20min,获得的扩增反应产物作为待检样品。
探针可以不断的以上下游引物扩增产物为模板进行中心小片段再扩增，这种设计极大的提高了双标记产物的特异性产生，也确保了后继胶体金检测的特异性。另外，为了进一步提高反特异性，反应体系中引物浓度高于标记探浓度五倍左右。这样就使得最终产物中有足够的模板量供探针识别结合，以标记探针和下游引物为5’端的扩增产物的量得到充足保障。为后续的胶体金试纸检测的灵敏度提供了可靠基础。
(4)结果检测与判定
a.检测原理
gica检测原理，如图2所示，nfo-rpa是在rpa扩增体系基础上加入nfo酶(核酸内切酶iv)和特异性分子标记核酸探针及修饰的下游扩增引物的一种改进方法，如图2所示，分子标记核酸探针设计原理是在核酸探针5’端标记fam(荧光素分子)，中间引入异源核苷酸残基thf(四氢呋喃)，核酸探针3’端添加阻断物c3-spacer以防止诱导bsu聚合酶扩增非目的dna。只有当探针与dna链互补结合后，具有dna损伤修复活性的nfo酶识别特异位点thf并将其切除，bsu聚合酶延此位点继续扩增延伸，最终形成同时具有上游5’端标记fam探针和下游5’端标记biotin(生物素)或dig(地高辛)的特异性扩增子产物。
gica试纸卡上检测区分别包被有biotin特异性接合物(biotin-ligand)对应位置为1号检测线、包被抗dig抗体对应2号检测线、抗抗fam抗体(anti-anti-fam)对应位置为对照c线。当nfo-rpa扩增子产物滴加于加样孔后，加样垫上的胶体金颗粒标记的抗fam抗体将随着液体样品流动的同时特异性地结合nfo-rpa扩增子的5’fam分子，同时该扩增子的另一端将分别被1号线或2号线包被分子特异性捕获形成夹心式的复合物，未特异性结合到扩增子的胶体金颗粒标记的抗fam抗体被对照c线处包被的抗抗fam抗体结合形成对照检测线。
判定方法：如图3所示，当nfo-rpa扩增子产物滴加于加样孔后，10分钟内进行检测结果判定，判定方法为：(1)当对照c线出现证明实验有效，此时1、2检测线同时出现的情况下证明有prv野毒检出判定为阳性结果；(2)当对照c线出现证明实验有效，此时仅1号检测线出现的情况下证明有prv疫苗毒检出判定为阳性结果；(3)当对照c线出现证明实验有效，此时1、2检测线均不出现时证明prv疫苗毒和野毒均未检出判定为阴性结果；(4)当对照c线不出现时证明实验无效，检测结果无意义。
b.具体操作
第一步，取胶体金检测卡于室温平衡后打开依次标记序号。
第二步，加样，取步骤(3)中待检样品5μl用纯水75μl稀释后滴加于胶体金检测卡的样品孔中。
第三步，读取结果，当室温下作用3-5min后即可读取检测结果(<10min内完成)。判定方法依据图3所示，对照线出现条带的条件下说明检测有效，此时若仅有1号检测线位置出现条带证明有猪伪狂犬病毒ul52基因检出，判定结果为疫苗毒阳性；若2号检测线位置出现条带证明有猪伪狂犬病毒ge基因检出，与此同时1号检测线也有检出则判定结果为猪伪狂犬病毒野毒阳性；此时若1、2号检测线均不出现条带结果判定为阴性。
4.具体实施例
实施例1用于敏感性检测prvul52基因和ge基因质粒的制备
按照分子克隆的常规方法使用pmd18-t克隆质粒为载体分别构建含prvul52基因和ge基因重组质粒，分别命名为pmd18-t-ul52和pmd18-t-ge，prvul52基因和ge基因序列分别参见genbank号：jf797218的47996-48309nt和122529-122714nt编码序列，采用紫外分光光度计进行3次浓度测定取平均值，二者重组质粒碱基数分别为2915bp和2892bp，经下列公式计算质粒拷贝数，即拷贝数(copies/μl)＝6.02×1023×质粒浓度(ng/μl)×10-9/(质粒碱基数×660)计算得出，将最终二者确定的3.3×109copies/μl,作为起始样本，分别经10倍梯度稀释后调整为3.3×10、3.3×102、3.3×103、3.3×104、3.3×105五个梯度浓度质粒作为模板，分装、标记保存备用。
实施例2smartmixrpa反应液的配制
常规rpa扩增反应液体系成份组成：100ng/μl重组酶uvsx；50ng/μl辅助蛋白uvsy；100ng/μlgp32蛋白(ssb，单链dna结合蛋白)；25ng/μlbsudna聚合酶；0.5mmdntps；1mmdtt(二硫苏糖醇)；3mmatp(三磷酸腺苷)；100mmtricine(三甲基甘氨酸),ph8.0；5％peg20k(聚乙二醇20000)；100ng/μlcreatinekinase(肌酸激酶)；20mmphosphokinase(磷酸激酶)；80mmpotassiumacetate(醋酸钾)。在常规rpa基础组成成份基础之上加入10unitsnfo酶(核酸内切酶iv)，50pmul52primer1,50pmul52primer2,10pmul52probe,50pmgeprimer1,50pmgeprimer2,10pmgeprobe,混均后按45.5μl每管分装即可得到rpa或nfo-rpasmartmix快速反应液低温保存备用。另将100mmmagnesiumacetate(醋酸镁)分装成2.5μl/管常温保存备用，作用为rpa扩增反应启动液。
实施例3猪血清样品中prv核酸的磁珠法提取
针对血浆、血清、腹水以及细胞培养物等液体样本直接取200μl加入1.5ml无核酸酶离心管，随后加入500μl裂解液(10mmol/ltris.cl(ph8.0)、10mmol/ledta、150mmol/lnacl、0.5％sds、100～200μg/ml蛋白酶k)，充分振荡混匀。
将样本混合物于65-70℃温浴裂解5分钟。
在离心管中加入10μl的充分混匀后的磁珠液(磁珠标记一层硅胶质膜，其反应原理是在高盐离子的条件下核酸和硅胶质膜靠正负电吸附力结合核酸，然后在低盐离子的环境中把核酸洗脱分离，达到核酸分离的目的。)，室温下颠倒混匀10分钟。
将离心管置于磁力架上1分钟，使管内磁珠被吸附，用移液器移走管内液体，取下离心管。
加入500μl去蛋白漂洗液(ph8.0的50mmtris-hcl，200mmnacl、50％乙醇溶液)，使磁珠重新悬浮，将离心管置于磁力架上1分钟，用移液器移走管内液体，取下离心管。
加入500μl洗涤液(70％的乙醇溶液)，使磁珠重新悬浮，将离心管置于磁力架上1分钟，用移液器移走管内液体，取下离心管。
再加入500μl洗涤液(70％的乙醇溶液)，使磁珠重新悬浮，将离心管置于磁力架上1分钟，用移液器移走管内液体，同时保持离心管置于磁力架上，使磁珠继续被吸附，室温晾干5min。
从磁力架上取下离心管，加入50μl-100μl洗脱液(te缓冲液即ph8.010mmtris-hcl，1mmedta)，使磁珠重新悬浮，55℃温浴5分钟，其间轻轻晃动两次使核酸(提取的病毒基因组dna)充分洗脱。
将离心管轻离后置于磁力架上1分钟，使磁珠被吸附，将液体转移至新的1.5ml无rna酶离心管，作为扩增模板备用。
实施例4rpa-gica联用检测prvul52基因和ge基因的敏感性比较实验
一.rpa-gica联用检测操作步骤：
第一步，以实施例1中制备的pmd18-t-ul52和pmd18-t-ge五个梯度浓度质粒分别作为检测模板，各取2μl分别加入标记好序号的实施例2中制备的rpasmartmix中混合均匀至总体系47.5μl，瞬时离心3秒。
第二步，取实施例2中rpa反应启动液以2.5μl每管依次加入第一步中各样品反应管盖内口中，小心依次扣紧上盖，手动振荡5-10次混合均匀混合均匀至总体系50μl，瞬时离心3秒。
第三步，将上述反应管放入恒温金属浴38℃条件下作用20分钟。
第四步，各取上一步反应液5μl，分别用75μl纯水稀释，滴加于gica试纸卡加样孔中，室温静止等待5-10分钟。
第五步，读取试纸卡检测结果，如图4所示，判定方法按照图3说明进行。rpa-gica检测prvul52基因和ge基因极限为3.3×10copies/μl。当prvul52基因和ge基因质粒模板达达3.3×103之后，检测线1、2号达到最大信号峰度值，不再随着模板浓度增加而增加。
二.pcr检测prvul52基因和ge基因的敏感性实验操作步骤：
第一步，加样，将实施例1中制备的pmd18-t-ul52和pmd18-t-ge五个梯度浓度质粒分别作为检测模板，各取2μl分别加入标记好序号的反应管中，再分别加入15μl2×pcrmix(含0.1u/μltaqdna聚合酶、400mmdntps、20mmtris-cl、3mmmgcl2和100mmkcl的混合物)，再分别加入1μl10pm的ul52上下游引物(ul52p1:5’-ggagtacttttacacgtcccagt-3’(序列如seqidno.9所示)，ul52p2:5’-ctccgagaggctgcccaggt-3’(序列如seqidno.10所示))和1μl10pm的ge上下游引物(gep1:5’-ggctgtttgtgctggcgctg-3’(序列如seqidno.11所示)，gep2:5’-cgtcgtagtagtcctcgtgc-3’(序列如seqidno.12所示))，最终分别以12μl纯水将各反应管补足至30μl的pcr反应体系。
第二步，pcr扩增，将上一步反应管放入pcr循环仪中，设置pcr扩增程序：预变性参数为94℃,5min；扩增反应参数为94℃,30s变性；61℃,30s退火；72℃,1min延伸；共30个循环；终延伸72℃,10min；4℃，保存。
第三步，电泳，制备1.5％琼脂糖凝胶，取上述pcr反应产物各5μl点样，100v、80ma条件下电泳20-30min。
第四步，扫胶观察pcr检测结果，使用tanon1600凝胶成像系统扫描记录电泳结果。
第五步，pcr结果的分析，如图5和图6所示，prvul52基因和ge基因质粒的pcr检测极限为3.3×102copies/μl。
结论：rpa-gica检测prvprvul52基因和ge基因的敏感性高于pcr检测的敏感性一个数量级。
实施例5rpa-gica联用检测prvul52基因和ge基因的特异性比较实验
一.rpa-gica联用检测操作步骤：
第一步，选取市售的商业化冻干弱毒疫苗猪伪狂犬(prv，含ge的hb-98株；不含ge的bartha-k61株)、猪瘟病毒(csfv，ch-1r株)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv，tjm-f92株)、猪流行乙型脑炎病毒(pjev，sa14-14-2株)、和实验室分离猪圆环病病毒(pcv)、猪细小病毒(ppv)阳性血清病料为实验材料。参照实施例3提取各病毒核酸，各取2μl分别加入标记好序号的实施例2中制备的rpasmartmix中混合均匀至总体系47.5μl，瞬时离心3秒。
第二步，取实施例2中rpa反应启动液以2.5μl每管依次加入第一步中各样品反应管盖内口中，小心依次扣紧上盖，手动振荡5-10次混合均匀混合均匀至总体系50μl，瞬时离心3秒。
第三步，将上述反应管放入恒温金属浴38℃条件下作用20分钟。
第四步，各取上一步反应液5μl，分别用75μl纯水稀释，滴加于gica试纸卡加样孔中，室温静止等待5-10分钟。
第五步，读取试纸卡检测结果，如图7所示，判定方法按照图3说明进行。rpa-gica检测prvul52基因和ge基因扩增产物特异性好不与其它病毒核酸扩增产物的非特异性结合。当prvul52基因和ge基因同时检出时1、2号线同时出现，当prvul52基因检出时1号线出现。
二.pcr检测检测prvul52基因和ge基因的特异性比较实验操作步骤：
第一步，提取病毒核酸，选取市售的商业化冻干弱毒疫苗猪伪狂犬(prv，含ge的hb-98株；不含ge的bartha-k61株)、猪瘟病毒(csfv，ch-1r株)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv，tjm-f92株)、猪流行乙型脑炎病毒(pjev，sa14-14-2株)、和实验室分离猪圆环病病毒(pcv)、猪细小病毒(ppv)阳性血清病料为实验材料，按照实施例3提取各病毒核酸备用。
第二步，pcr扩增，各取2μl提取的病毒核酸作为检测模板分别加入标记好序号的反应管中，再分别加入15μl2×pcrmix(含0.1u/μltaqdna聚合酶、400mmdntps、20mmtris-cl、3mmmgcl2和100mmkcl的混合物)，再分别加入1μl10pm的ul52上下游引物(ul52p1:5’-ggagtacttttacacgtcccagt-3’，ul52p2:5’-ctccgagaggctgcccaggt-3’)和1μl10pm的ge上下游引物(gep1:5’-ggctgtttgtgctggcgctg-3’，gep2:5’-cgtcgtagtagtcctcgtgc-3’)，最终分别以12μl纯水将各反应管补足至30μl的pcr反应体系。将反应管放入pcr循环仪中，设置pcr扩增程序：预变性参数为94℃,5min；扩增反应参数为94℃,30s变性；61℃,30s退火；72℃,1min延伸；共30个循环；终延伸72℃,10min；4℃，保存。
第三步，电泳，制备1.5％琼脂糖凝胶，取上述pcr反应产物各5μl点样，100v、80ma条件下电泳20-30min。
第四步，扫胶观察pcr检测结果，使用tanon1600凝胶成像系统扫描记录电泳结果。
第五步，pcr结果的分析，如图8-9所示，疫苗毒prvul52基因和ge基因扩增特异性强，未发生其它病毒核酸非特异性扩增结果。
结论：rpa-gica检测prvprvul52基因和ge基因的特异性与pcr检测的特异性相当。
实施例6临床猪血液样品中prv核酸分子检测对比实验
分别应用rpa-gica与pcr方法对15份采集自锦州市周边未使用prv疫苗免疫的三个猪场的血清病料进行对比检测，以此验证本发明方法的重复性与可靠性，并对其检测效能进行评估。结果如表1所示，rpa-gica及pcr方法一致性为100％，同时检测出prv阳性样品3份和阴性样品12份。
表1rpa-gica与qrt-pcr检测15份猪血清样品中prv的比较结果
*表注:一致性concordance＝100％,经kappaconcordancetest
以上各个实施例只是用于进一步说明本发明，并不是用来限制本发明的保护范围，凡是基于本发明的构思所作出的等同变换及对本发明的各个技术方案显而易见的改进，均落入本发明的保护范围。
序列表
<110>锦州医科大学
<120>一种猪伪狂犬病疫苗毒与野毒鉴别检测的方法及试剂盒
<141>2018-03-23
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