本发明属于微生物工程
技术领域：
，具体涉及一株用于土壤改良的高效溶磷菌及其应用。
背景技术：
：磷素是植物生长发育所必需的大量营养元素，不仅参与植物体内许多重要化合物的组成，而且以各种途径参与植物体内的生理代谢活动，决定农作物的产量和品质，在土壤-植物生态系统中具有不可替代的作用。土壤中磷素缺乏是目前农业生产中的主要限制因素之一。我国土壤中可利用磷素占土壤含磷量比重低于5％，远远不能满足农作物生长发育的需要，必须通过施用磷肥来补充。由于磷肥在土壤中移动性较小，肥效转化慢，目前我国磷肥利用率仅为10～25％，大部分磷酸根离子与土壤中ca2+、fe3+、al3+等阳离子结合形成难溶性磷酸盐而沉积，固定于土壤。据报道，目前我国积累在土壤中的磷超过13万吨不能被植物吸收利用。长期施用磷肥会导致土壤中缓效磷的富集，在增产增收的同时也造成土壤板结和肥力下降，并且导致水体污染和土壤污染等一系列环境问题。因此，磷素缺乏及利用率低是我国农业产生中亟待解决的重要问题。自然界中的微生物参与土壤中磷素的地球生物化学循环，推动土壤中磷素的有效利用。从自然界中筛选高效溶磷菌能够有效开发和利用土壤中被固定的磷素，是解决土壤磷素缺乏和土壤因过量化学肥料施用导致环境问题的有效方法。因此，高效溶磷菌的研究及其应用不仅可以有效改善土壤质量，同时增强作物的抗性，增加农作物对肥料的利用率，减少环境污染，调节土壤中微生物生态平衡，对培育和提升土壤生态肥力、保持农业生态环境和农业可持续发展具有十分重要的意义。技术实现要素：为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种用于土壤改良的高效溶磷菌。本发明的另一目的在于提供上述高效溶磷菌的应用。利用上述溶磷菌可以高效地将土壤中难溶磷转换为有效态，可供植物直接吸收利用。本发明提供了一株具有高效溶解难溶性无机磷功能的细菌，可用于将土壤中难溶性磷溶解出来，有效解决土壤供磷不足的难题，减少化肥施用。本发明的目的通过下述技术方案实现：本发明提供一株高效溶磷菌，命名为pseudomonasprosekiiylyp6，从活性污泥中分离纯化得到。所述的高效溶磷菌为pseudomonasprosekiiylyp6，其保藏信息：保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏日期2017年06月28日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：cctccno：m2017390。菌体培养特征和形态特征为：菌体为革兰氏阴性细菌；有芽孢，芽孢中生或偏端生，芽孢呈椭圆形；菌体单个或成对排列。在蒙金娜(pvk)固体培养基和lb固体培养基上均长势良好，30℃培养24h，菌落呈淡黄色，菌落扁平隆起，边缘高于中心，表面光滑不透明，边缘不整齐，湿润(图1)；扫描电子显微镜下呈长杆状，菌体平均长度为2～3μm，平均宽度0.2～0.4μm，见图2，生理生化实验结果见表1。本发明还提供上述pseudomonasprosekiiylyp6在溶解难溶磷酸盐中的应用。所述的难溶性磷酸盐为磷酸钙、磷酸铝或磷酸铁。优选的，所述的难溶磷酸盐为磷酸钙。所述的pseudomonasprosekiiylyp6在nbrip液体培养基中，溶解难溶性磷酸盐至可溶性磷含量达436.2±2.9mg/l～682.0±3.5mg/l，优选达553.1±7.1mg/l～682.0±3.5mg/l。所述的pseudomonasprosekiiylyp6在有效增加土壤中有效磷含量的应用。所述的pseudomonasprosekiiylyp6菌株能够使土壤中有效磷增加达29.7mg/kg。所述的pseudomonasprosekiiylyp6可用作农用微生物菌剂肥料，直接施用于磷素缺乏的土壤。所述的农用微生物菌剂的制备方法按照以下方法进行：将菌株pseudomonasprosekiiylyp6接种在lb液体培养基中培养12h，4℃，6000rpm离心3min，收集菌体，用0.9％无菌生理盐水洗涤菌体3次，并用生理盐水制备得到菌密度为108cfu/ml的菌悬液，即为农用微生物菌剂。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明提供了一株新的高效溶磷菌pseudomonasprosekiiylyp6，补充了溶磷菌的微生物资源库，该菌株培养条件及方法简便易行，且溶磷能力强，能够在较短时间内大幅度提升土壤有效磷含量，且能够在土壤中保持持久溶磷活性，适应能力强，增加土壤中有效磷含量，适应能力强，具有良好的应用潜力，适于作为微生物菌剂应用于农业生产，具有广阔的应用前景。附图说明图1是菌株pseudomonasprosekiiylyp6在lb固体培养基培养24h的菌落形态特征。图2是菌株pseudomonasprosekiiylyp6细胞形态特征。图3是菌株pseudomonasprosekiiylyp6系统发育进化树。图4是菌株pseudomonasprosekiiylyp6在nbrip培养液中有效磷含量动力学曲线。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1高效溶磷菌的筛选：(1)所述菌株的分离方法为平板筛选法：采集活性污泥于50ml无菌离心管中，置于净冰盒中。称取1g活性污泥，用0.9％无菌生理盐水将样品梯度稀释制成10-1～10-5溶液。(2)培养基：蒙金娜(pvk)固体培养基：磷酸钙5.0g，蔗糖10.0g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.1g，七水合硫酸镁0.1g，氯化钾0.2g，硫酸锰0.03g，酵母膏0.5g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，ph7.0～7.2。lb培养基：酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g，蒸馏水1000ml，ph7.0。固体营养琼脂培养基添加15g琼脂粉。(3)菌种分离和筛选：分别吸取不同稀释倍数的稀释液0.1ml，均匀涂布于pvk固体培养基上，置于30℃倒置培养3～5天，挑选长势良好、解磷圈显著的菌落，用划线法再次转接至pvk固体培养基上，重复2～3次，最终纯化获得一株溶磷能力较强的溶磷菌，其编号为ylyp6。将其转接至lb培养基试管斜面于4℃冰箱保藏，用于后续实验。实施例2高效溶磷菌株ylyp6鉴定：形态特征和生理生化的检测依据和方法为细菌鉴定程序ms(i)/c005-c01。形态鉴定：菌体为革兰氏阴性细菌；有芽孢，芽孢中生或偏端生，芽孢呈椭圆形；菌体单个或成对排列。在lb固体培养基上培养24h，菌落湿润，表面光滑不透明，边缘不整齐(图1)，电子显微镜下呈长杆状，菌体平均长度为2～3μm，平均宽度0.2～0.4μm，见图2。生理生化特征鉴定：生理生化实验结果见表1。表1ylyp6菌的生理生化特征鉴定生理生化试验结果生理生化试验结果接触酶+精氨酸脱羟酶-氧化酶+精氨酸双水解酶+厌氧生长-硝酸盐还原-荧光色素观察+6.5％nacl生长实验-明胶液化-脲酶-柠檬酸盐利用+丙二盐酸利用-赖氨酸脱羟酶-七叶苷水解-鸟氨酸脱羟酶-淀粉水解-+：阳性；-：阴性分子生物学鉴定：采用细菌总dna提取试剂盒提取该菌总dna，采用细菌16srdna通用引物f27和r1492对该菌基因组进行pcr扩增。pcr产物由上海生工完成测序，序列如seqidno：1所示，将测序结果与genbank中已报道的16srdna序列进行同源性比对，并进行系统进化树分析，该菌株ylyp6的16srdna序列与pseudomonasprosekii(kx812776.1)同源性较高，同源率达99％，构建的系统发育进化树见图3。因此，根据所述菌株的形态、生理生化特征以及系统进化分析，将该菌株鉴定为pseudomonasprosekii，隶属于假单胞菌属。菌种命名为pseudomonasprosekiiylyp6。所述的pseudomonasprosekiiylyp6的保藏信息：保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏日期：2017年06月28日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：cctccno：m2017390。实施例3菌株pseudomonasprosekiiylyp6溶磷能力的定量分析：(1)菌悬液的制备：用接种环挑取少量菌种于50mllb液体培养基中，于30℃，130rpm，培养10h，取40ml培养液于50ml离心管中，4℃，6000rpm离心3min，收集菌体，用0.9％无菌生理盐水洗涤菌体3次，并用生理盐水制备得到菌密度为108cfu/ml的菌悬液。(2)磷酸盐预处理：分别称取20.0g磷酸钙、磷酸铝或磷酸铁于大烧杯中，用2l超纯水超声溶解，每隔30min弃去上层溶液，保留烧杯底部不溶解的磷酸盐，重复超声洗涤2～3次至上层溶液澄清，并收集烧杯底部沉淀的磷酸盐，置于60℃烘箱烘干，碾磨后，装入棕色试剂瓶中，置于干燥器中备用。(3)pvk液体培养基和nbrip培养基配制：pvk液体培养基：磷酸钙5.0g，蔗糖10.0g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.1g，七水合硫酸镁0.1g，氯化钾0.2g，硫酸锰0.03g，酵母膏0.5g，蒸馏水1000ml，ph7.0～7.2。磷酸盐生长(nbrip)培养基：葡糖糖10.0g，磷酸盐(磷酸钙、磷酸铝或磷酸铁)5.0g，六水合氯化镁5.0g，七水合硫酸镁0.25g，氯化钾0.2g，硫酸铵0.1g，蒸馏水1000ml，ph7.0。按照上述配方以难溶磷酸盐为唯一磷源配制培养基，用碱液(naoh溶液)调节ph值至7.0，于121℃灭菌20min。(4)接种和培养：将上述制备好的菌密度为108cfu/ml的菌悬液按照培养体系的4％(v：v)的接种量，接种到pvk和nbrip液体培养基。于30℃，130rpm培养7d。(5)可溶性磷酸盐的测定：培养7d后，取培养液2ml于离心管，4℃，5000rpm下离心10min，取0.2ml上清液稀释至10ml，用钼锑抗分光光度法测定可溶性磷酸盐的含量(gnw07417(asa-16))。以121℃灭菌20min的菌悬液作为对照。nbrip液体培养基中，溶解难溶性磷酸盐达可溶性磷含量分别为436.2±2.9mg/l、553.1±7.1mg/l和682.0±3.5mg/l。实施例4菌株ylyp6的溶磷动力学：(1)培养液的配置：按照实施例3步骤(3)的配方配制nbrip培养基，在配制过程中分装50ml培养液于150ml锥形瓶后再准确称取处理后的磷酸钙，并用naoh溶液调节ph值至7.0，于121℃灭菌20min。(2)接种和培养：将实施例3步骤(1)制备的菌悬液(108cfu/ml)按照培养体系的4％(v：v)的接种量进行接种，于30℃，130rpm培养。(3)可溶性磷酸盐的测定：每12h取1.2ml培养液于2ml的离心管，4℃，5000rpm离心10min，取0.2ml上清液稀释至10ml，用钼锑抗分光光度法测定可溶性磷酸盐的含量。以接种在121℃灭菌20min的菌悬液作为对照。pseudomonasprosekiiylyp6在接种培养后，溶液中的可溶性磷量逐渐上升，培养第4d，可溶性磷含量达605.9mg/l，之后趋于平缓，培养至第6天可溶性磷含量622.4mg/l(图4)。实施例5菌株pseudomonasprosekiiylyp6在土壤中的溶磷能力测定：(1)供试土壤：华南农业大学农田水稻土，ph5.76，有机质17.64g/kg，总氮0.78g/kg，总磷0.60g/kg，风干后过60目。(2)菌剂制备：将菌株ylyp6接种在lb培养基中培养12h，4℃，6000rpm离心3min，收集菌体，用0.9％无菌生理盐水洗涤菌体3次，并用生理盐水制备得到菌密度为108cfu/ml的菌悬液。(3)菌株ylyp6在土壤中的溶磷能力评价设置不接菌的常规土壤(n-ck)，接菌的常规土壤(n-p6)处理，每处理设置3个重复。分别称取上述常规和灭菌的土壤600g于500ml的烧杯中，烧杯四周用锡箔纸遮光处理，向土壤中添加步骤(2)制备的菌悬液60ml，充分混匀。将土壤含水量调整至田间持水量的30％，于30℃培养，并于培养10d取样按照国标法gnw07417(asa-16)测定土壤中有效磷含量。培养10d后，不接菌处理土壤中有效磷含量为39.8mg/kg，接菌处理土壤中有效磷含量为69.5mg/kg。pseudomonasprosekiiylyp6能够有效提升土壤中有效磷的含量，增量达29.7mg/kg。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>暨南大学<120>一株用于土壤改良的高效溶磷菌及其应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1438<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>pseudomonasprosekiiylyp6的16srdna序列<400>1cgcatggggcagctaccatgcaagtcgagcggtagagagaagcttgcttctcttgagagc60ggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcctggtagtgggggataacgttcggaaac120ggacgctaataccgcatacgtcctacgggagaaagcaggggaccttcgggccttgcgcta180tcagatgagcctaggtcggattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgat240ccgtaactggtctgagaggatgatcagtcacactggaactgagacacggtccagactcct300acgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgaaagcctgatccagccatgccgc360gtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttaagttgggaggaagggcagttacc420taatacgtgattgttttgacgttaccgacagaataagcaccggctaactctgtgccagca480gccgcggtaatacagagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgta540ggtggttagttaagttggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcattcaaaac600tgactgactagagtatggtagagggtggtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtag660atataggaaggaacaccagtggcgaaggcgaccacctggactgatactgacactgaggtg720cgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtc780aactagccgttgggagccttgagctcttagtggcgcagctaacgcattaagttgaccgcc840tggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggt900ggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggccttgacatccaatg960aactttctagagatagattggtgccttcgggaacattgagacaggtgctgcatggctgtc1020gtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaacccttgtcctta1080gttaccagcacgttatggtgggcactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaagg1140tggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacggcctgggctacacacgtgctacaatgg1200tcggtacagagggttgccaagccgcgaggtggagctaatcccagaaaaccgatcgtagtc1260cggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgcgaatcaga1320atgtcgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgg1380gttgcaccagaagtagctagtctaaccttcgggggacggtaccacggggataacggtc1438当前第1页12