本发明涉及一种酶及其应用，编码该酶的核酸，包括所述核酸的表达载体，包括所述表达载体的宿主细胞，以及包括上述酶、核酸、表达载体、宿主细胞中的至少一种的试剂。更具体地说，它涉及同型半胱氨酸甲基转移酶突变体及其应用、编码该同型半胱氨酸甲基转移酶突变体的核酸，包括所述核酸的表达载体、包括所述表达载体的宿主细胞，以及包括上述同型半胱氨酸甲基转移酶突变体、核酸、表达载体、宿主细胞中的至少一种的试剂。
背景技术：
甲基转移酶可催化s-腺苷甲硫氨酸（sam）上的甲基转移到底物分子上，生成多种重要的含甲基的生理活性物质，达到功能调节的目的。
同型半胱氨酸甲基转移酶（hmt，ec2.1.1.10）是甲基转移酶中的一种，可催化同型半胱氨酸和sam反应生成s-腺苷同型半胱氨酸和甲硫胺酸，可用于配制同型半胱氨酸（hcy）生化诊断试剂，是一种关键原料酶。
现有hmt为酿酒酵母sam4氨基酸序列，活性低、稳定性差。
针对以上问题，中国发明专利cn102391999b公开了一种同型半胱氨酸甲基转移酶及其核苷酸序列、重组载体、重组宿主细胞及制法和试剂盒，从白色念珠菌(candidaalbicanssc5314)中得到具有seqidno：1所示的氨基酸序列的同型半胱氨酸甲基转移酶，并且利用随机突变的方法得到具有seqidno：3所示的氨基酸序列的同型半胱氨酸甲基转移酶。所得两种同型半胱氨酸甲基转移酶都具有很好的耐热性，能在宽的温度范围内保持较高的稳定性。两种同型半胱氨酸甲基转移酶在40℃下于ph6.0的缓冲液中静置15分钟后仍都具有60％以上的相对活性。
但是上述方案中的同型半胱氨酸甲基转移酶仅仅提高了耐热性，但是酶经常要在4℃需要放置数月甚至按年来计算，40℃高温稳定性一定要好，而上述方案中40℃、15min后仅有60%的相对活性还是比较低的，而且整体的活性还是相对较低。
技术实现要素：
针对现有技术存在的不足，本发明的目的一在于提供一种同型半胱氨酸甲基转移酶突变体，显著提高了酶的耐热性、活性和稳定性。
本发明的上述技术目的一是通过以下技术方案得以实现的：一种同型半胱氨酸甲基转移酶突变体，在野生型hmt的基础上在d53、d283、l252、q219氨基酸处含有一处或两处以上氨基酸突变，且在d53、d283、l252、q219突变的氨基酸为不包括原氨基酸的19种氨基酸中的任一种氨基酸。
通过采用上述技术方案，通过理论知识和经验，选取了在特定氨基酸位置上进行定向突变，与野生型（wt）相比，突变体的活性和稳定性都有一定的提高，而且耐热性也得到了提高。
本发明进一步设置为：同型半胱氨酸甲基转移酶突变体在d53、d283氨基酸处突变为谷氨酸、天冬酰胺或甘氨酸。
本发明进一步设置为：同型半胱氨酸甲基转移酶突变体在d53氨基酸处突变为谷氨酸，d283氨基酸处突变为天冬酰胺。
本发明进一步设置为：同型半胱氨酸甲基转移酶突变体在l252氨基酸处突变为异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸或赖氨酸；同型半胱氨酸甲基转移酶突变体在q219氨基酸处突变为谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺。
本发明进一步设置为：同型半胱氨酸甲基转移酶突变体在其他位置氨基酸处含有氨基酸突变。
本发明的目的二在于提供一种核酸，编码获得的同型半胱氨酸甲基转移酶突变体相对于野生型hmt的活性和稳定性都得到了显著提高。
本发明的上述技术目的二是通过以下技术方案得以实现的：一种编码同型半胱氨酸甲基转移酶突变体的核酸，所述核酸为编码上述方案中所述的同型半胱氨酸甲基转移酶突变体的核酸。
本发明的目的三在于提供一种表达载体，表达载体中含有的同型半胱氨酸甲基转移酶突变体相对于野生型hmt的活性和稳定性都得到了显著提高。
本发明的上述技术目的三是通过以下技术方案得以实现的：一种表达载体，包含上述方案中所述的核酸的表达载体。
本发明的目的四在于提供一种宿主细胞，宿主细胞中含有的同型半胱氨酸甲基转移酶突变体相对于野生型hmt的活性和稳定性都得到了显著提高。
本发明的上述技术目的四是通过以下技术方案得以实现的：一种宿主细胞，包含上述方案中所述表达载体的宿主细胞。
本发明进一步设置为：所述宿主细胞为原核细胞。
本发明进一步设置为：所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。
本发明进一步设置为：所述宿主细胞为大肠杆菌bl21（de3）细胞。
本发明的目的五在于提供同型半胱氨酸甲基转移酶突变体的应用，催化s-腺苷甲硫氨酸与同型半胱氨酸反应生成s-腺苷同型半管氨酸和甲硫氨酸效率更高。
本发明的上述技术目的五是通过以下技术方案得以实现的：上述方案中同型半胱氨酸-s-甲基转移酶突变体催化s-腺苷甲硫氨酸与同型半胱氨酸反应生成s-腺苷同型半管氨酸和甲硫氨酸的应用。
一种同型半胱氨酸检测试剂，该试剂含有上述方案中所述的同型半胱氨酸甲基转移酶突变体。
通过采用上述技术方案，可以减少hmt用量及延长hcy试剂的使用期限，从而降低生产成本，减少定标次数，增加试剂的有效检测数量。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
其一、本发明是将编码hmt的核酸序列按照大肠杆菌密码子偏好进行优化并合成，相对比于野生菌来源的序列，优化后的基因序列更有利于在大肠杆菌中表达，表达量高而且重组质粒稳定，重复性好且不宜丢失。
其二、经过多轮的试验，进行了大量的组合，检测酶活性和稳定性，结果表明d283氨基酸处突变为天冬酰胺、l252氨基酸处突变为异亮氨酸和q219氨基酸处突变为天冬氨酸这3个位置同时突变时，得到了酶活性、稳定性都得到明显提高的突变体，最终酶活性提高了一倍，稳定性也有极大提高，从野生型的75%提高到90%左右。
其三、本发明经过优选，选取了pet-28a(+)表达载体、选取了bl21（de3）细胞进行表达，pet系列的载体，带有t7启动子，t7表达系统可使用强力的噬菌体t7启动子进行高水平表达。它非常适用于在大肠杆菌中表达可溶的无毒性重组蛋白质。本发明得到的pet-28a-hmt在进行表达时得到了明显的高水平表达。t7rna聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体de3区的lacuv5启动子，非常适用于t7、t7lac启动子的表达系统，如pet、peasy等。上述本发明优选了pet-28a系列的表达载体，配对bl21（de3）表达细胞，是非常利于hmt蛋白的可溶性高表达量的表达。经过优化后的载体和细胞的组合通过试验得到了可溶性的、高水平表达的目的蛋白。
其三、本发明直接采用hcy检测试剂盒的原理，经过组合后反过来检测hmt的活性，使得该酶在hcy试剂盒中活性高低变化对试剂盒的影响更为直接，这样会避免单纯的酶活性检测和酶在试剂盒中活性检测的不一致的问题，简单说，试剂盒成分复杂，简单酶活性检测说明酶活性高了是不能直接说明在试剂盒中实际应运的时候就一定能提高整个试剂盒的活性的。
最终，一系列的试验说明了可以在减少hmt用量的同时延长hcy试剂的使用期限，从而降低生产成本，减少定标次数，增加试剂的有效检测数量。
具体实施方式
本发明seqidno.1为来源于酿酒酵母的hmt氨基酸序列，seqidno.2为本发明优化的hmt核苷酸序列，序列表见表5。seqidno.3-17为本发明的hmt突变体氨基酸序列。
本发明是将酿酒酵母来源的hmt如seqidno.1所示的氨基酸序列经过大肠杆菌密码子优化如seqidno.2所示的核苷酸序列后，利用随机突变和定点突变得到本发明的一系列的hmt突变体，其中如seqidno.3-15所示的hmt突变体具有较好的酶活，同时seqidno.5、seqidno.6、seqidno.9、seqidno.12、seqidno.14、seqidno.15具有明显较好的稳定性。
本发明提供了一种hmt突变体，其中所述的hmt突变体的氨基酸序列为，
seqidno.3序列中突变点为：d53e
seqidno.4序列中突变点为：d283n
seqidno.5序列中突变点为：l252i
seqidno.6序列中突变点为：q219d
seqidno.7序列中突变点为：d53e+l252i
seqidno.8序列中突变点为：d53e+d283n
seqidno.9序列中突变点为：d53e+q219d
seqidno.10序列中突变点为：d283n+l252i
seqidno.11序列中突变点为：d283n+q219d
seqidno.12序列中突变点为：l252i+q219d
seqidno.13序列中突变点为：d53e+l252i+d283n
seqidno.14序列中突变点为：d53e+l252i+q219d
seqidno.15序列中突变点为：d283n+l252i+q219d
将含有上述突变体的基因连入pet-28a(+)，并在宿主细胞大肠杆菌escherichiacolibl21（de3）中表达，获得突变体蛋白。
下面结合表格和实施例进一步说明本发明，除非特别说明本发明所用到的试剂、培养基均为市售商品。
实施例1易错pcr(error-pronepcr)方法构建hmt突变文库
采用genemorphiirandommutagenesiskit，以优化的hmt（见seqidno.2）核苷酸序列为模板扩增hmt基因，随机引入突变。
扩增引物
f：5’-catgccatggctagattgccattgaag（下划线为ncoi内切酶）
r：5’-ccgctcgagagtgtacttcttaacagcag（下划线为xhoi内切酶）
反应条件：反应条件为：94°c预变性10min，94°c变性30s，60°c退火60s和72°c延伸2min，共25个循环，0.8%琼脂糖电泳，试剂盒回收目的基因片段。按照neb公司产品说明书描述的方法，用ncoi和xhoi双酶切后，与经过ncoi和xhoi酶切的pet-28a(+)载体（kana抗性）进行连接反应，反应条件为：载体和片段按摩尔比1:3的比例混合，加入0.5μltakarat4dna连接酶，16°c过夜。电击法转入e.colihst08premiumelectrocells，得到超过105个克隆的突变体库。
实施例2hmt突变体库的筛选
将实施例1中突变库克隆收集后提取质粒，转入大肠杆菌表达菌株bl21（de3），涂布含有kana的lb平板，培养12h。挑取单克隆于96孔板，每孔含有150μltb培养基（含有50μg/ml卡纳霉素，1mmiptg），37°c，245rpm，震荡培养36h。96孔板复制器复制各单克隆于lb固体培养基平板，37°c培养12h后，4°c冰箱保存。用排枪轻轻吸出96孔板各孔中的细胞培养物，按相应位置分配于a板和b板的96孔板中，每块96孔板各孔中的培养物为70μl。4000rpm，4°c，离心10min，弃去上清，各孔中菌体细胞反复冻融5次后用30μl，50mm，ph7.6的磷酸钠缓冲液重悬。a板直接加入不含hmt的hcy检测试剂r1124μl和r232μl，加入酶标仪混匀后，检测反应情况，筛选出酶活高于野生型对照的突变体。
实施例3稳定性检测
将b板中对应于a板中活性提高的突变体做稳定性检测。
筛选出4个对活性有影响的突变体，将突变体单克隆送测序公司测序，氨基酸序列见seqidno.3-seqidno.6
四个突变位置分别为d53、d283、l252、q219。
实施例4定点随机突变
根据易错pcr筛选结果，选择对活性有影响的d53、d283、l252、q219作为突变位置，采用quikchange®xlsite-directedmutagenesiskit，以优化的hmt（见seqidno.2）核苷酸序列为模板扩增hmt基因，引入随机突变。
扩增引物
d53-f：
5'-caatctttctgttagcagaagactcnnnagaccagaaagactcagagatgaat-3'
d53-r：
5'-attcatctctgagtctttctggtctnnngagtcttctgctaacagaaagattg-3'
d283-f：
5'-caacagtgtcccaagagttcaacttnnnagagtttggcaaccaaatcttcttc-3'
d283-r：
5'-gaagaagatttggttgccaaactctnnnaagttgaactcttgggacactgttg-3'
l252-f：5'-catgtttggcaaagcttggtgnnnagactccaagatgtctggaga-3'
l252-r：5'-tctccagacatcttggagtctnnncaccaagctttgccaaacatg-3'
q219-f：5'-ttgtcacccaagtccttgataacnnnagcaatctcctccatagtagtac-3'
q219-r：5'-gtactactatggaggagattgctnnngttatcaaggacttgggtgacaa-3'
pcr体系：10×buffer5μl，pet28-hmt模板2μl，引物（10μm）各2μl，dntp（2.5mm）2μl，quiksolution3μl，pfu（2.5u/μl)1μl，超纯水补足50μl。
扩增条件：95°c预变性1min，95°c变性50s，60°c退火50s，68°c延伸7min，共18个循环，68°c延伸7min。pcr产物用1μldpni处理，37°c处理1h。取10μl采用化学法转入e.colidh5a。提取质粒转入表达菌株e.colibl21（de3）。酶活检测按照实施例二，稳定性检测按照实施例三。具体数据见表1。
表1经过第一轮定点随机突变后筛选的阳性突变体的酶活与稳定性，wt为野生型。
注：
1.突变体表示方法：野生型氨基酸-突变位置-突变后氨基酸；
2.“-”仅表示反应是吸光度向下的反应，数值的绝对值表示了酶活性的高低；
3.拿各自在37℃加速7天样品的反应度与4℃保存的样品的反应度相比较，百分比表示经过加速后保留的酶的活性百分比。
采用的上述一系列技术方案中，通过理论知识和经验，选取了在特定氨基酸位置上进行定向突变，在第一轮的随机突变筛选中，我们首先筛选到了酶活性有明显变化的突变子，与野生型（wt）相比有的酶活性提高，有的基本保持不变，有的还有降低，稳定性也是变化各异，最终我们选择了酶活性提高了50%及以上的突变体作为进一步往下进行试验提供了依据，即d53氨基酸处突变为谷氨酸，d283氨基酸处突变为天冬酰胺，l252氨基酸处突变为异亮氨酸，q219氨基酸处突变为天冬氨酸。
实施例五第二轮定点随机突变
以第一轮定点随机突变的活性和稳定性都提高的阳性克隆为模板，以其他三个突变位置任选一个作为引物，进行第二轮定点随机突变。其他参照实施例四。
组合如下：
d53和l252，
d53和d283，
d53和q219，
d283和l252，
d283和q219，
l252和q219。
第二轮定点随机突变后酶活及稳定性见表2。
表2经过第二轮定点随机突变后筛选的阳性突变体的酶活与稳定性，wt为野生型。
注：
1.突变体表示方法：野生型氨基酸-突变位置-突变后氨基酸；
2.“-”仅表示反应是吸光度向下的反应，数值的绝对值表示了酶活性的高低；
3.拿各自在37℃加速7天样品的反应度与4℃保存的样品的反应度相比较，百分比表示经过加速后保留的酶的活性百分比。
同样我们选择了酶活性提高了77%及以上且稳定性比较好的突变体作为进一步往下进行试验提供了依据。
实施例六第三轮定点随机突变
以第二轮定点随机突变的活性和稳定性都提高的阳性克隆为模板，以其他两个突变位置任选一个作为引物，进行第二轮定点随机突变。其他参照实施例四。
组合如下：
d53、l252和d283，
d53、l252和q219，
d53、d283和q219，
l252、d283和q219。
第三轮定点随机突变后酶活及稳定性见表3。
表3经过第三轮定点随机突变后筛选的阳性突变体的酶活与稳定性，wt为野生型。
注：
1.突变体表示方法：野生型氨基酸-突变位置-突变后氨基酸；
2.“-”仅表示反应是吸光度向下的反应，数值的绝对值表示了酶活性的高低；
3.拿各自在37℃加速7天样品的反应度与4℃保存的样品的反应度相比较，百分比表示经过加速后保留的酶的活性百分比。
同样我们选择了酶活性提高了90%及以上且稳定性比较好的突变体作为进一步往下进行试验提供了依据。
实施例七第四轮定点随机突变
以第三轮定点随机突变的活性和稳定性都提高的阳性克隆为模板，以没有做个的那个位置的引物作为引物，进行第二轮定点随机突变。其他参照实施例四。
组合为：d53、d283、l252、q219。
第四轮定点随机突变后酶活及稳定性见表4。
表4经过第四轮定点随机突变后筛选的阳性突变体的酶活与稳定性，wt为野生型。
注：
1.突变体表示方法：野生型氨基酸-突变位置-突变后氨基酸；
2.“-”仅表示反应是吸光度向下的反应，数值的绝对值表示了酶活性的高低；
3.拿各自在37℃加速7天样品的反应度与4℃保存的样品的反应度相比较，百分比表示经过加速后保留的酶的活性百分比。
通过上述实验分析可以发现，相比野生型hmt，本发明的13个突变体均具有较好的酶活性，seqidno.3-15对应突变体活性分别提高了1.49倍、1.75倍、1.80倍、1.71倍、1.89倍、1.83倍、1.78倍、1.96倍、1.92倍、1.94倍、2.00倍、1.90倍、2.20倍；其中seqidno.5、seqidno.6、seqidno.9、seqidno.12、seqidno.14、seqidno.15在稳定性方面表现突出，野生型相比（75%），稳定性分别提高到85%、81%、85%、80%、90%，显示出在hcy检测试剂中降低生产成本，延长保质期，增加有效检测数量的优势。
综上所述，经过大量的组合，检测酶活性和稳定性，结果表明d283氨基酸处突变为天冬酰胺、l252氨基酸处突变为异亮氨酸和q219氨基酸处突变为天冬氨酸这3个位置同时突变时，得到了酶活性、稳定性都得到明显提高的突变体，最终酶活性提高了一倍，稳定性也有极大提高，从野生型的75%提高到90%左右。
高温下酶的稳定性测试，业内一般做42℃和37℃的高温实验，或是40℃的也有做，这个具体温度没有标准，本发明下采用37℃放置7天的加速实验来验证酶的稳定性（见各突变体酶活及稳定性数据表格），本发明中上述提到效果好的突变，37℃放置7天后与4℃放置的蛋白相对活性能保留80%以上，效果相当优异。
一种表达载体，包含上述实施例中所述的核酸的表达载体，本发明优选的pet系列的载体，带有t7启动子，t7表达系统可使用强力的噬菌体t7启动子进行高水平表达。它非常适用于在大肠杆菌中表达可溶的无毒性重组蛋白质。本发明得到的pet-28a-hmt在进行表达时得到了明显的高水平表达，平均每克离心后的菌体中蛋白的产量经过纯化可得到至少约30-40mg的纯度高达至少93%以上的目的蛋白。
一种宿主细胞，宿主细胞中含有的同型半胱氨酸-s-甲基转移酶突变体相对于野生型hmt的活性和稳定性都得到了显著提高；宿主细胞为原核细胞，优选为大肠杆菌细胞，进一步优选为大肠杆菌bl21（de3）细胞。本发明优选bl21（de3）细胞，其特点是t7rna聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体de3区的lacuv5启动子，非常适用于t7、t7lac启动子的表达系统，如pet、peasy等。pet-28a系列的表达载体，配对bl21（de3）表达细胞，是非常利于hmt蛋白的可溶性高表达量的表达。
对于非t7启动子的表达载体（如tac启动子的pgex或是pmal系列表达载体）可以选用bl21表达菌株。
一种同型半胱氨酸检测试剂，该试剂含有上述实施例中所述的同型半胱氨酸-s-甲基转移酶突变体，本发明直接采用hcy检测试剂盒的原理，经过组合后反过来检测hmt的活性，使得该酶在hcy试剂盒中活性高低变化对试剂盒的影响更为直接，这样会避免单纯的酶活性检测和酶在试剂盒中活性检测的不一致的问题，简单说，试剂盒成分复杂，简单酶活性检测说明酶活性高了是不能直接说明在试剂盒中实际应运的时候就一定能提高整个试剂盒的活性的。
最终，一系列的试验说明了可以在减少hmt用量的同时延长hcy试剂的使用期限，从而降低生产成本，减少定标次数，增加试剂的有效检测数量。
表5seqidno.1-seqidno.6的序列表
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。