一种乙醛酸转氨酶介导的5-氨基乙酰丙酸生物合成途径的制作方法

文档序号:15457398发布日期:2018-09-15 01:28

本发明属于基因工程及微生物发酵技术领域,具体涉及通过导入异源甘氨酸转氨酶,构建非天然的新型5-氨基乙酰丙酸生产途径的方法。



背景技术:

5一氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,简称5-ALA),是生物体合成叶绿素、血红素、维生素B12等必不可少的物质。5-ALA在农业、医药及有机合成中都有重要应用。研究表明,5-ALA调节叶绿素的合成,提高光合作用效率及促进植物组织分化的生理功能,可以作为农业中植物生长调节剂,此外还可以作为除草剂及杀虫剂,且具有生物降解性,又不引起害虫产生抗药性,是一种新型绿色农药。而由于5-ALA的市场售价较高,应用成本大,一时还难以直接应用。在医学上,5-ALA可以作为一种新型光动力药物,不仅用于局部或全身的皮肤癌的治疗,还可用于膀胱癌、消化道癌、肺癌等的诊断。同时还可用于各种皮肤病及类风湿关节炎等疾病的治疗。

5-ALA早期以化学合成为主,原料可以是马尿酸、琥珀酸、四氢糠胺及乙酰丙酸等,但是大部分化学方法具有原料成本高,反应条件要求苛刻,反应溶剂毒性高及收率低等缺点。

近年来,随着合成生物学技术的发展,生物法合成5-ALA逐渐替代的传统化学法路线,成为研究的重点。生物合成5-ALA目前研究较多时C4途径,即利用三羧酸循环中的丁二酰辅酶A和甘氨酸经5-ALA合成酶的作用生成5-ALA,外源添加丁二酸及甘氨酸都对ALA产量有明显提升。目前基因工程改造方面的研究都集中在对原有5-ALA的合成途径,即原料丁二酰辅酶A、甘氨酸的生产途径优化上,尚未有新的5-ALA合成途径报道。在原料供给方面,甘氨酸作为5-ALA合成的原料之一,其合成途径较长,难以调控强化,而且在甘氨酸合成途径会生成一分子的5,10-亚甲基四氢叶酸,在损失碳源的同时也造成代谢调控的负担。目前多数研究仍以外源添加甘氨酸为原料供给,少数关于甘氨酸供给的调控也未发挥明显作用。



技术实现要素:

为了解决上述技术问题,本发明将提供一种通过导入异源甘氨酸转氨酶构建新型5-氨基乙酰丙酸合成途径的方法,从而实现由葡萄糖到5-ALA的高效转化,解决目前C4生产途径中外源添加甘氨酸的问题,并且避免了原C4途径中生成甘氨酸损失的一分子碳。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一,是提供一株生产5-ALA的基因工程菌,该菌株包含5-ALA合成酶基因hemA,乙醛酸转氨酶基因,以及增强表达的异柠檬酸裂解酶基因aceA基因。

所述的乙醛酸转氨酶为以乙醛酸为氨基受体,其他氨基酸为氨基供体的转氨酶,包括但不限于丙氨酸-乙醛酸转氨酶、谷氨酸-乙醛酸转氨酶、谷胺酰胺-乙醛酸转氨酶,以及可能的丙酮酸-甘氨酸转氨酶、酮戊二酸-甘氨酸转氨酶;

所述的乙醛酸转氨酶来源于人、高等动物、植物、真菌或古细菌;

优选地,所述乙醛酸转氨酶基因为来自人体的丙氨酸-乙醛酸转氨酶编码基因AGXT基因;

所述增强表达的方式可以是表达外源的aceA基因,也可以是过表达宿主中的本底aceA基因,或者敲除宿主中抑制aceA基因表达的基因;

所述抑制aceA基因表达的基因为iclR基因或acrA基因;

所述基因工程菌的宿主包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、球形红细菌(Rhodobactersphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum);

优选地,所述宿主为大肠杆菌;

更优选地,所述宿主为大肠杆菌E.coli BL21star(DE3);

优选地,所述hemA基因的表达载体为petDuet-1;

优选地,所述外源aceA基因的表达载体为pRSFduet-1;

优选地,所述AGXT基因的表达载体为pRSFduet-1;

所述hemA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示;

所述AGXT基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示;

所述aceA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二,是提供一种采用上述基因工程菌生产5-ALA的方法,具体如下:

将经过种子培养的上述基因工程菌,以0.5%-1%体积比接种量接种到发酵培养基,37℃,300-800r/min培养,待菌体OD达到0.5-0.6时,添加0.1-0.5mM IPTG诱导基因表达,调节温度至30℃,用25%氨水调节pH使之维持在6.8-7.2,补加葡萄糖使终浓度维持在5-10g/L,发酵时间16-24h。

发酵培养基组成:蛋白胨10g/L,氯化钠10g/L,酵母粉5g/L,卡那霉素50μg/mL,氨苄霉素100μg/mL,pH 7.0。

有益效果:

1、本发明提供的基因工程菌带有5-ALA合成酶基因(hemA),导入了甘氨酸转氨酶基因(AGXT)及异柠檬酸裂解酶基因(aceA),提供了一种5-ALA新型合成途径,并提高了发酵生产5-ALA产量。异柠檬酸裂解酶(aceA)激活生产菌株中的乙醛酸循环,使异柠檬酸裂解得到乙醛酸和ALA合成的原料之一丁二酸,乙醛酸在外源导入的甘氨酸转氨酶(AGXT)作用下生成另一生产5-ALA原料——甘氨酸,继而生成5-ALA(合成途径见图1)。这一途径解决了传统5-ALA生物合成途径-C4途径中,甘氨酸合成途径难以调控,需要外源添加的问题,并且避免了原C4途径中生成甘氨酸损失的一分子碳。为5-ALA的生物合成提供更为有效、经济的途径开辟了新思路。

2、采用本发明提供的基因工程菌生产5-ALA发酵液产量达到520-550mg/L,较C4途径产量提高38%左右。

附图说明:

图1新型5-氨基乙酰丙酸生产途径;

图2实施例4发酵过程曲线。

具体实施方式:

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,对本专利进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利,并不用于限定本发明。

实验操作未详述的,均根据实验室手册——如《分子克隆》进行操作。

ALA分析方法:采用分光光度法:将标准试剂或样品10μL,加入190μL的0.5M乙酸钠溶液,10μL的乙酰丙酮,加热煮沸15min。冷却加入200μL的改良Ehrlich’s试剂,反应10min,检测554nm下吸光度。

以下实施例所使用培养基:

LB固体培养基(g/L):蛋白胨10,氯化钠10,酵母粉5,琼脂15,pH 7.0;

发酵培养基(g/L):蛋白胨10,氯化钠10,酵母粉5,pH 7.0。

以下实施例生产5-ALA所使用培养条件:

种子培养:100mL摇瓶中加入15mL发酵培养基,对于含有表达载体petDuet-1的菌种加入氨苄霉素(100μg/mL),对于含有表达载体pRSFduet-1的菌株加入加入卡那霉素(50μg/mL),对于同时含有两种表达载体的菌株同时加入两种抗生素。接入100μL保存的甘油菌液,37℃,220r/min培养8小时。

发酵培养:向1.5L发酵罐中加入500mL发酵培养基,根据转入质粒的抗性添加卡那霉素(50μg/mL)或氨苄霉素(100μg/mL),以0.5%-1%体积比接种量接种到发酵培养基,37℃,300-800r/min培养,待菌体OD达到0.5-0.6时,添加0.1-0.5mM IPTG诱导基因表达,调节温度至30℃,用25%氨水调节pH使之维持在6.8-7.2,补加葡萄糖使终浓度维持在5-10g/L,发酵时间16-24h。

实施例1:5-ALA生物合成新途径的体外验证

①将不同来源的乙醛酸转氨酶分别连接到表达载体pet21a上,构建重组表达载体,分别为:人(Homo sapiens)来源的丙氨酸-乙醛酸转氨酶pet21a-AGXT;酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源的丙氨酸-乙醛酸转氨酶pet21a-ScTA;甲基生丝微菌(Hyphomicrobium methylovorum)来源的丙氨酸-乙醛酸转氨酶pet21a-HmTA;

②构建异柠檬酸裂解酶基因表达载体pet21a-aceA;

③构建丁二酰辅酶A合成酶表达载体pet22b-sucCD;

④构建5-ALA合成酶表达载体pet22b-hemA。

将上述表达载体分别转化在大肠肝菌表达宿主E.coli BL21star(DE3)中,37℃发酵培养至OD达到0.5-0.6时,添加0.1mM IPTG诱导基因表达,30℃继续培养10h后收集菌体,超声破碎后取上清,分别得到乙醛酸转氨酶(3种)、异柠檬酸裂解酶、丁二酰辅酶A合成酶及5-ALA合成酶破菌液,备用。

向总体积为1mL pH为6.5的Tris·HCl缓冲液中加入终浓度为10mM的异柠檬酸,10mM丙氨酸,10mM ATP,3mM乙酰辅酶A,1mM磷酸吡哆醛(PLP),1mM氯化镁,加入上述步骤获得的异柠檬酸裂解酶、乙醛酸转氨酶(3种来源分3组添加)、丁二酰辅酶A合成酶及5-ALA合成酶破菌液各150μL,30℃下震荡反应6h,检测其5-ALA浓度,计算转化率。

其中来源于人的乙醛酸转氨酶重组表达载体pet21a-AGXT的表达产物与异柠檬酸裂解酶、丁二酰辅酶A合成酶及5-ALA合成酶的组合对合成5-ALA的转化率最高可达91%,pet21a-ScTA和pet21a-HmTA的转化率分别为85%和78%。这证明了确实可以通过新途径(图1)将异柠檬酸转化为5-ALA。后续选择来源于人的乙醛酸转氨酶作为继续研究对象。

实施例2:含有5-ALA合成酶基因、乙醛酸转氨酶基因及异柠檬酸裂解酶基因的质粒构建

(1)基因合成与扩增:将来源于球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的5-ALA合成酶基因hemA(SEQ ID NO.1所示)与乙醛酸转氨酶基因AGXT(SEQ ID NO.2所示)分别送与南京金斯瑞生物公司合成,获得质粒pUC-hemA与pUC-AGXT。用引物aceA-IF与aceA-IR从大肠杆菌MG1655中扩增出异柠檬酸裂解酶基因aceA备用。

(2)质粒pETDuet-1-hemA的构建:用引物ACYCDuet-VecF与DuetDOWN1从质粒pETDuet-1中扩增出载体片段(backbone),用引物DuetUP2与T7Terminator从质粒pUC-hemA中扩增出插入片段(In-hemA),将两个片段纯化回收后通过吉布森组装(Gibson assembly)的方式连接。连接产物转化至大肠杆菌ToP10感受态中,次日挑选菌株测序验证,正确的克隆命名为ToP10(pETDuet-1-hemA)。

(3)质粒pRSFduet-AGXT-aceA的构建:用引物ACYCDuet-VecF与ACYCDuet-VecR从质粒pRSFDuet-1中扩增出载体片段(backbone),用引物Rs-hemA-01F与RSF-AGXT-R从质粒pUC-AGXT中扩增出插入片段(In-AGXT)。将三个片段(backbone,aceA和In-AGXT)纯化回收后通过吉布森组装(Gibson assembly)的方式连接。连接产物转化至大肠杆菌ToP10感受态中,次日挑选菌株测序验证,正确的克隆命名为ToP10(pRSFduet-AGXT-aceA)。

所用引物序列如下:

实施例3:含有5-ALA生物合成新途径重组菌株的构建

向20mL LB培养基中接入大肠杆菌E.coli BL21star(DE3)保存甘油菌种100μL,37℃,220r/min培养5小时至OD值到达0.5,取2mL菌液离心,弃去上清,菌体沉淀用0.1M氯化钙重旋洗涤,离心后弃去上清,重复洗涤一遍,菌体沉淀用0.1M氯化钙重旋,获得E.coli BL21star(DE3)菌体感受态细胞。

分别从实施例2获得的ToP10(pETDuet-1-hemA)和ToP10(pRSFduet-AGXT-aceA)中提取质粒pETDuet-1-hemA和质粒pRSFduet-1-AGXT-aceA。

向E.coli BL21star(DE3)菌体感受态细胞加入2μL pETDuet-1-hemA质粒,冰上静置30分钟,42℃度水浴放置90秒,再放置在冰上5分钟,加入800μL LB培养基,37℃培养1小时,取200μL均匀涂在带有氨苄霉素(100μg/mL)的LB固体培养基平板上,37℃过夜培养,挑取单菌落培养获得对照组菌株,记为hemA。

向E.coli BL21star(DE3)菌体感受态细胞加入5μL petDuet-1-hemA质粒及5μL pRSFduet-1-AGXT-aceA质粒,冰上静置30分钟,42℃度水浴放置90秒,再放置在冰上5分钟,加入800μL LB培养基,37℃培养1小时,取200μL均匀涂在带有氨苄霉素(100μg/mL)及卡那霉素(50μg/mL)的LB固体培养基平板上,37℃过夜培养,挑取单菌落培养获得实验组菌株,记为hemA/AGXT-aceA。

实施例4:5-ALA生物合成新途径重组菌株的发酵验证

将对照组菌株hemA和实验组菌株hemA/AGXT-aceA按前述方法进行发酵培养:

种子培养:100mL摇瓶中加入15mL发酵培养基,对于含有表达载体petDuet-1的菌种加入氨苄霉素(100μg/mL),对于含有表达载体pRSFduet-1的菌株加入加入卡那霉素(50μg/mL),对于同时含有两种表达载体的菌株同时加入两种抗生素。接入100μL保存的甘油菌液,37℃,220r/min培养8小时。

发酵培养:向1.5L发酵罐中加入500mL发酵培养基,据转入质粒的抗性添加卡那霉素(50μg/mL)和/或氨苄霉素(100μg/mL),以0.5%体积比接种量接种到发酵培养基,37℃,400r/min培养,待菌体OD达到0.5-0.6时,添加0.1mM IPTG诱导基因表达,调节温度至30℃,用25%氨水调节pH使之维持在7.0,补加葡萄糖使终浓度维持在5-10g/L,发酵24h记录发酵过程曲线。

发酵培养基(g/L):蛋白胨10,氯化钠10,酵母粉5,pH 7.0。

结果显示(见图2),导入新合成途径的实验组菌株hemA/AGXT-aceA发酵18小时ALA产量可达521±4mg/L,较对照组hemA(378±3mg/L)有明显提高,产量提高了38%。需要说明的是,由于宿主菌中存在5-AlA水合酶(hemB),会消耗生产的5-ALA,因而在发酵中后期,发酵液中5-ALA含量开始降低。

实施例5 5-ALA生物合成新途径重组菌株的发酵方法

将实施例3所得实验组菌株hemA/AGXT-aceA按前述方法进行发酵培养:

种子培养:100mL摇瓶中加入15mL发酵培养基,对于含有表达载体petDuet-1的菌种加入氨苄霉素(100μg/mL),对于含有表达载体pRSFduet-1的菌株加入加入卡那霉素(50μg/mL),对于同时含有两种表达载体的菌株同时加入两种抗生素。接入100μL保存的甘油菌液,37℃,220r/min培养8小时。

发酵培养:向1.5L发酵罐中加入500mL发酵培养基(发酵培养基组成:蛋白胨10g/L,氯化钠10g/L,酵母粉5g/L,卡那霉素50μg/mL,氨苄霉素100μg/mL,pH 7.0),以1.0%体积比接种量将种子液接种到发酵培养基,37℃,800r/min培养,待菌体OD达到0.5-0.6时,添加0.5mM IPTG诱导基因表达,调节温度至30℃,用25%氨水调节pH使之维持在6.8,补加葡萄糖使终浓度维持在5-10g/L,发酵16h,发酵液中ALA产量可达550mg/L。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本专利构思的前提下,上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进,这些都属于本专利的保护范围。因此,本专利的保护范围应以权利要求为准。

序列表

<110> 北京化工大学

<120> 一种乙醛酸转氨酶介导的5-氨基乙酰丙酸生物合成途径

<130> 1

<141> 2018-04-13

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1224

<212> DNA

<213> 球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)

<400> 1

atggactaca accaggctct ggacaccgct ctgaaccgtc tgcacaccga aggtcgttac 60

cgtaccttca tcgacatcga acgtcgtaaa ggtgctttcc cgaaagctat gtggcgtaaa 120

ccggacggtt ctgaaaaaga aatcaccgtt tggtgcggta acgactacct gggtatgggt 180

cagcacccgg ttgttctggg tgctatgcac gaagctctgg aaaacaccgg tgctggttct 240

ggtggtaccc gtaacatctc tggtaccacc ctgtaccaca aacgtctgga agctgaactg 300

gctgacctgc acggtaaaga agctgctctg gttttctctt ctgcttacat cgctaacgac 360

gctaccctgt ctaccctgcc gcagctgatc ccgggtctgg ttatcgtttc tgacaaactg 420

aaccacgctt ctatgatcga aggtatccgt cgttctggta ccgaaaaaca catcttcaaa 480

cacaacgacc tggacgacct gcgtcgtatc ctgtcttcta tcggtaaagg tcgtccgatc 540

ctggttgctt tcgaatctgt ttactctatg gacggtgact tcggtcagat caaagaaatc 600

tgcgacatcg ctgacgaatt cggtgctctg aaatacatcg acgaagttca cgctgttggt 660

atgtacggtc cgcgtggtgg tggtgttgct gaacgtgacg gtctgatgga ccgtatcgac 720

atcatcaacg gtaccctggg taaagcttac ggtgttttcg gtggttacat cgctgcttct 780

gctaaaatgt gcgacgctgt tcgttcttac gctccgggtt tcatcttctc tacctctctg 840

ccgccggttg ttgctgctgg tgctgctgct tctgttcgtc acctgaaagg tgacgttgaa 900

ctgcgtgaaa aacaccagac cgctgctaaa atcctgaaaa tgcgtctgaa aggtctgggt 960

ctgccgatca tcgaccacgg ttctcacatc gttccggttc acgttggtga cccggttcac 1020

tgcaaaatga tctctgacat gctgctggaa cacttcggta tctacgttca gccgatcaac 1080

ttcccgaccg ttccgcgtgg taccgaacgt ctgcgtttca ccccgtctcc ggttcacgac 1140

tctggtatga tcgaccacct ggttaaagct atggacgttc tgtggcagca ctgcgctctg 1200

aaccgtgctg aagttgttgc ttaa 1224

<210> 2

<211> 1176

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

atggcttctc acaaactgct ggttaccccg ccgaaagctc tgctgaaacc gctgtctatc 60

ccgaaccagc tgctgctggg tccgggtccg tctaacctgc cgccgcgtat catggctgct 120

ggtggtctgc aaatgatcgg ttctatgtct aaagacatgt accagatcat ggacgaaatc 180

aaagaaggta tccagtacgt tttccagacc cgtaacccgc tgaccctggt tatctctggt 240

tctggtcact gcgctctgga agctgctctg gttaacgttc tggaaccggg tgactctttc 300

ctggttggtg ctaacggtat ctggggtcag cgtgctgttg acatcggtga acgtatcggt 360

gctcgtgttc acccgatgac caaagacccg ggtggtcact acaccctgca agaagttgaa 420

gaaggtctgg ctcagcacaa accggttctg ctgttcctga cccacggtga atcttctacc 480

ggtgttctgc aaccactgga cggcttcggt gaactgtgcc accgttacaa atgcctgctg 540

ctggttgact ctgttgcttc tctgggtggt accccgctgt acatggaccg tcagggtatc 600

gacatcctgt actctggttc tcagaaagct ctgaacgctc cgccgggtac ctctctgatc 660

tctttctctg acaaagctaa aaaaaaaatg tactctcgta aaaccaaacc gttctctttc 720

tacctggaca tcaaatggct ggctaacttc tggggttgcg acgaccagcc gcgtatgtac 780

caccacacca tcccggttat ctctctgtac tctctgcgtg aatctctggc tctgatcgct 840

gaacagggtc tggaaaactc ttggcgtcag caccgtgaag ctgctgctta cctgcacggt 900

cgtctgcaag ctctgggtct gcaactgttc gttaaagacc cggctctgcg tctgccgacc 960

gttaccaccg ttgctgttcc ggctggttat gactggcgtg acatcgtgag ctacgttatc 1020

gaccacttcg acatcgaaat catgggtggt ctgggtccgt ctaccggtaa agttctgcgt 1080

atcggtctgc tgggttgcaa cgctacccgt gaaaacgttg accgtgttac cgaagctctg 1140

cgtgctgctc tgcaacactg cccgaaaaaa aaactg 1176

<210> 3

<211> 1305

<212> DNA

<213> 大肠杆菌MG1655()

<400> 3

atgaaaaccc gtacacaaca aattgaagaa ttacagaaag agtggactca accgcgttgg 60

gaaggcatta ctcgcccata cagtgcggaa gatgtggtga aattacgcgg ttcagtcaat 120

cctgaatgca cgctggcgca actgggcgca gcgaaaatgt ggcgtctgct gcacggtgag 180

tcgaaaaaag gctacatcaa cagcctcggc gcactgactg gcggtcaggc gctgcaacag 240

gcgaaagcgg gtattgaagc agtctatctg tcgggatggc aggtagcggc ggacgctaac 300

ctggcggcca gcatgtatcc ggatcagtcg ctctatccgg caaactcggt gccagctgtg 360

gtggagcgga tcaacaacac cttccgtcgt gccgatcaga tccaatggtc cgcgggcatt 420

gagccgggcg atccgcgcta tgtcgattac ttcctgccga tcgttgccga tgcggaagcc 480

ggttttggcg gtgtcctgaa tgcctttgaa ctgatgaaag cgatgattga agccggtgca 540

gcggcagttc acttcgaaga tcagctggcg tcagtgaaga aatgcggtca catgggcggc 600

aaagttttag tgccaactca ggaagctatt cagaaactgg tcgcggcgcg tctggcagct 660

gacgtgacgg gcgttccaac cctgctggtt gcccgtaccg atgctgatgc ggcggatctg 720

atcacctccg attgcgaccc gtatgacagc gaatttatta ccggcgagcg taccagtgaa 780

ggcttcttcc gtactcatgc gggcattgag caagcgatca gccgtggcct ggcgtatgcg 840

ccatatgctg acctggtctg gtgtgaaacc tccacgccgg atctggaact ggcgcgtcgc 900

tttgcacaag ctatccacgc gaaatatccg ggcaaactgc tggcttataa ctgctcgccg 960

tcgttcaact ggcagaaaaa cctcgacgac aaaactattg ccagcttcca gcagcagctg 1020

tcggatatgg gctacaagtt ccagttcatc accctggcag gtatccacag catgtggttc 1080

aacatgtttg acctggcaaa cgcctatgcc cagggcgagg gtatgaagca ctacgttgag 1140

aaagtgcagc agccggaatt tgccgccgcg aaagatggct ataccttcgt atctcaccag 1200

caggaagtgg gtacaggtta cttcgataaa gtgacgacta ttattcaggg cggcacgtct 1260

tcagtcaccg cgctgaccgg ctccactgaa gaatcgcagt tctaa 1305

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 4

gtttaacttt aataaggaga tataccatga aaacccgtac acaacaaatt g 51

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 5

ttagaactgc gattcttcag tggag 25

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 6

ttaacctagg ctgctgccac 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 7

gattatgcgg ccgtgtacaa 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 8

ttgtacacgg ccgcataatc 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 9

gctagttatt gctcagcgg 19

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 10

ggtatatctc cttattaaag ttaaacaaaa ttatttc 37

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 11

ccggctccac tgaagaatcg 20

<210> 12

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 12

gtggcagcag cctaggttaa ttacagtttt tttttcgggc agtg 44

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