本发明属于农业和生物
技术领域：
：，具体涉及玉米基因zmereb180在植物耐渍中的应用。
背景技术：
：：随着全球气候的改变，涝渍灾害在全球范围内发生的频率和强度越来越高(bailey-serresetal.,2012a)。尤其是最近十年，在亚洲、欧洲和非洲，涝渍事件发生的次数明显增加。在美国，过去12年里由于涝渍灾害造成的作物产量损失是仅次于干旱胁迫的，涝渍胁迫成为仅次于干旱的作物第二大非生物胁迫因子(bailey-serresetal.,2012b)。玉米是世界范围内种植范围最广的作物，其产量也受到各种非生物逆境胁迫因子的影响。在亚洲地区，涝渍灾害是限制玉米产量的重要非生物胁迫因子之一。仅在南亚和东南亚地区，超过18％的玉米种植面积频繁受到涝渍胁迫的影响(zaidietal.,2010)，每年由于涝渍灾害造成大约25％-30％的产量损失(sarkaretal.,1998)。我国玉米产区也易受涝渍灾害的影响，其中黄淮海地区的夏玉米和长江流域的春玉米受涝渍胁迫最为严重。黄淮海地区夏季降水量一般占全年的60％-70％，且降水时间相对集中于播种后的短时间内，因此苗期易受涝渍胁迫，进而影响玉米的生长发育和产量(余卫东2013)。在长江流域中下游地区，玉米苗期常遇低温春雨，花期易遇连绵梅雨，严重影响了南方玉米的高产和稳产。玉米耐渍性相关性状主要表现为玉米在涝渍胁迫条件下能够提高其存活能力的适应性性状，如不定根和通气组织的形成(manoetal2006b)等。日本mano实验室在玉米耐渍性遗传定位中做出了很多工作：mano等(2005a，2005b)利用玉米自交系b64与大刍草杂交以及两个玉米自交系b64和na4杂交构建的f2分离群体将渍水胁迫下不定根形成相关的qtl共定位在第8染色体8.05bin上；利用两玉米自交系f1649和h84构建的f2群体将氧化还原土壤条件下耐渍性相关的qtl定位于第一染色体1.03-1.04bin(manoetal2006a)；利用玉米自交系与大刍草杂交的f2群体(manoetal2008；manoetal2007；manoetal2012)以及自交系mi29与大刍草杂交的高代回交群体(manoandomori2008)将控制通气组织形成的qtl定位于除第4和6染色体外的8条染色体上；利用玉米深根自交系b73与浅根系大刍草杂交构建f2分离群体，将控制根夹角相关的qtl定位于第2、4、7和10共4条染色体上(omoriandmano2007)；利用玉米自交系mi29和大刍草杂交，构建了以mi29为背景的45个导入系的群体，将耐渍性主效qtl定位于第4染色体4.07-4.08bin上，包含该qtl的导入系材料可直接用于玉米耐渍性遗传改良(manoandomori2013)。华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室玉米团队的qiu等(2007)利用耐渍性强玉米自交系hz32和耐渍性敏感自交系k12构建f2分离群体，在两个不同环境下将玉米苗期耐渍性相关的qtl定位于第4、7和9三个主要的qtl密集区域。osman等(2013)进一步调查了该群体渍水胁迫后动态表达的qtl，其中6个qtl在两个时期都有表达，7个est和microrna基因与动态定位qtl共定位于第1、4、6、7和9五条染色体上。zhang等(2013)利用144份玉米自交系的关联群体在第5、6和9三条染色体上共鉴定到4个显著关联的snp位点，其中一个snp位点正好位于高代回交群体定位的qtl区间内。印度zaidi等(2015)利用ril群体，将5个产量耐渍性qtl定位于第1、3、5、7和10共5条染色体上，共解释约30％的表型变异。鉴于渍水胁迫后性状表型的复杂性，目前为止，科学研究者并没有克隆到玉米耐渍基因。因此，研究玉米苗期耐渍性的遗传机理，发掘苗期耐渍性优良等位基因，为玉米耐渍性的遗传改良提供基因资源和理论指导。技术实现要素：针对上述问题，本发明提供了玉米基因zmereb180在植物耐渍中的应用，其所述的zmereb180基因的cds序列为seqidno.1所示，在玉米和拟南芥中过表达该基因能够显著增强它们的耐渍性，因此其可用于制备耐渍转基因植株。本发明的另一个目的在于提供了一段玉米基因zmereb1805'-utr区域设计的特异性引物，利用该引物可进行耐渍玉米的育种筛选。为了达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：本研究通过候选基因关联分析鉴定到zmereb180与玉米苗期耐渍性显著关联，进一步通过重测序和表达量分析鉴定其优良等位基因。在拟南芥和玉米中过表达zmereb180证实其耐渍功能。玉米基因zmereb180在植物耐渍中的应用，包括利用本领域的常规方式将zmereb180在植株中进行过表达，可显著增强植株的耐渍性；所述的植株优选为玉米和拟南芥。针对玉米基因zmereb1805'-utr区域设计的特异性引物，引物为f：gcaaaactaagactttctctagca，r：tgtgccctgtgtatttttcgaca在玉米育种中的应用，包括利用本领域的常规方式检测到待测玉米中待测玉米中出现特异性序列，即可对耐渍玉米进行筛选。更进一步方案详见具体实施方式。与现有技术相比，本发明具有以下优点：本申请通过关联分析找到了一个能够控制玉米苗期耐渍性的候选基因zmereb180，是克隆的首个影响玉米苗期耐渍性的基因；重测序和表达量分析表明zmereb180基因5’-utr变异影响该基因表达量进而影响存活率表型，拟南芥和玉米过表达遗传转化证实了该基因能够增强拟南芥和玉米苗期耐渍性。附图说明图1为zmereb180基因表达量与表型相关性分析示意图；a：zmereb180在正常水分(control)、短期渍水处理(4h)和长期渍水处理(3d)条件下相对表达量与植株存活率的相关性分析。b：zmereb180在正常水分(control)、短期渍水处理(4h)和长期渍水处理(3d)条件下相对表达量在hap1和hap2之间的比较图2为zmereb180基因在拟南芥中过表达分析示意图；其中：a：rt-pcr检测zmereb180在拟南芥野生型(wt)以及过表达株系oe5和oe8中的表达差异，取生长3周幼苗淹水处理前(0h)和淹水后(4h)分析其表达模式；b：拟南芥和转基因的35s:zmereb180拟南芥植株完全淹没处理10天恢复生长9天后表型差异；c：恢复生长9天后地上部分表型差异；d：恢复生长9天后地上部分鲜重差异；e：拟南芥四个厌氧响应标记基因(atadh1，atpdc1，atsus1和atsus4)在wt、oe5和oe8中的表达模式分析。图3为过表达zmereb180转基因玉米渍水胁迫后表型差异分析示意图；其中：a：zmereb180在c01，oe115和oe240渍水处理前后不同时间段根系中表达模式分析；b：渍水处理15天后c01，oe115和oe240表现型差异；c：渍水处理15天后c01，oe115和oe240根系及地上部分形态差异；d：渍水处理15天后c01，oe115和oe240最长根系的长度；e：渍水处理15天后c01，oe115和oe240地上部分鲜重；f：渍水处理15天后c01，oe115和oe240不定根(ar)数目；g：渍水处理15天后c01，oe115和oe240最长不定根(ar)的长度；h：渍水处理15天后c01，oe115和oe240不定根(ar)的平均长度；统计分析采用单因素方差分析，字母a和b表示多重检验差异显著性。图4为hap1和hap2存活率表型差异分析。具体实施方式本发明所述技术方案，如未特备说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。实施例1：玉米耐渍基因zmereb180的获得：1)玉米耐渍基因候选基因关联分析：在368份具有广泛遗传变异的玉米关联群体中，通过转录组测序获得了525105个高质量的snp标记，并从中获得19个第七亚家族erf基因(zmerf-viis)的多态性标记，19个基因平均的多态性snp数为31.95个(表1)。结合基因型和存活率表型，利用tassel3.0软件，以q和k为协变量进行候选基因关联分析。关联分析结果设定两个阈值，分别为p<1.0e-2和p<1.0e-3(table1)。在p<1.0e-2阈值条件下，zmereb180在exp1、exp2、exp3和blup中均能检测到显著关联的位点，zmereb179在exp1、exp3和blup中能检测到显著关联的位点，zmereb7、zmereb14、zmereb102、zmereb181、zmereb182和zmereb202仅在单个环境下检测到显著关联的位点，其它基因均为检测到显著关联的位点。但是，在p<1.0e-3阈值条件下，仅zmereb180在exp1、exp2、exp3和blup中仍能够检测到显著关联的位点。因此，zmereb180很可能与玉米苗期耐淹水性相关联。在b73参考基因组中，zmereb180基因v3版本的编号为grmzm2g018984，v4版本的编号为zm00001d027925(www.maizegdb.org)。表1.zmerfviis基因在玉米多样性自然群体中的自然变异与苗期耐渍性的关联分析关联群体表型鉴定方法：为鉴定渍水处理后各自交系的存活率，于2014年5-9月，在华中农业大学温室(平均温度约为28℃)对关联群体进行了3次实验表型鉴定。盆栽试验按邱法展等(2007)描述的方法种植，苗期进行正常的水分管理。每份自交系种植3桶即3个生物学重复，每个桶淹水前间苗到10株。幼苗在2叶1心期(苗龄约7d)，开始淹水处理，水层保持2～3cm。为确保各次实验数据的相对一致性，存活率表型数据记录时以玉米自交系b73的存活率为参考，当b73的存活率为50％时，记录其它各自交系的存活率。存活率的计算是存活的株数除以总株数。利用一般线性模型，对三个环境下的表型均值进行最优线性无偏估计分析(bestlinearunbiasedprediction,blup)，获得各自交系blup表型值。候选基因关联分析方法：利用单个环境下表型均值以及blup值，根据关联群体的50万snp标记信息，将zmerf-viis基因的snp信息提取出来作为基因型，结合表型数据，利用tassel3.0软件，以q和k为协变量进行候选基因关联分析((lietal.,2013；wenetal.,2014))。2)zmereb180重测序分析为鉴定zmereb180的dna多态性位点，在368份自交系关联群体中随机挑选了248份自交系进行重测序分析。测序序列总长为3.1kb，包括zmereb180启动子区域1.1kb和基因区2kb。经序列比对分析，共鉴定到58个snps位点和29个indels(insertionanddeletion)位点。结合87个多态性标记与blup表型，选择mlm模型并以q和k为协变量，利用tassel3.0计算各位点与表型之间的显著性p值以及两两标记之间ld值。结果显示，共鉴定到7个显著关联的位点，包括4个indels(indel-241、indel-196、indel-77、indel-19和indel214)和2个snps(snp-118和snp-78)。indel-241、indel-196、indel-77、indel-19、snp-118和snp-78均位于5'-utr，indel214位于第一个外显子，为三个碱基ggc缺失，不引起氨基酸的移码突变。这些显著关联的位点具有处于完全的ld状态。根据七个显著关联位点的ld状态，将自交系分为两种不同的单倍型即hap1和hap2。hap1存活率表型显著高于hap2，表明hap1是耐渍性强的定位基因。hap1代表性自交系为jiao51和cml69，hap2代表性自交系为k12、ly042和835b。zmereb180重测序分析方法：关联群体中随机选择了280份自交系进行重测序分析。根据b73参考基因组设计基因特异引物，扩增zmereb180的2kb区段和启动子区域1.1kb区段，通过pcr产物测序获得其在关联群体中不同自交系的序列。为高效扩增和测序，将整个序列分为3段进行扩增，引物序列如下：第一段f/r：cagcaacacgaacaacacga/gtccgtttagcacgactcca第二段f/r：ccaacggcgtacaaatcgag/aagttgaccttggccttgct第三段f/r：gcccgtcttgtgtatagccc/gcatttggatcggaacgctt利用clcsequenceview软件将序列整理并进行多序列比对，利用tassel3.0软件将最小等位基因频率大于0.05的snp位点和indel抽提出来，随后利用tassel3.0软件，以q和k为协变量，采用mlm模型，结合blup表型数据进行候选区段的关联分析。zmereb180基因表达量与表型相关性分析由于zmereb180在5'-utr区域有4个indels和两个snps的变异，即存在两种单倍型材料hap1和hap2(hap1的5'-utr序列为seqidno.2所示，hap2的5'-utr区域的核苷酸序列为seqidno.3所示)的序列，所以猜测5'-utr的变异可能影响该基因的表达量。在重测序的248份自交系中，随机挑选了100份自交系材料，二叶一心期渍水处理，提取渍水处理前(control)、短期渍水处理(4h)和长期渍水处理(3d)各基因型材料根系rna，分析zmereb180的表达量。对300份rna样品进行qrt-pcr分析表明，在4h和3d渍水处理条件下，zmereb180表达量与植株存活率呈显著正相关，但是在control条件下，相关性不显著(图1中a)。这一结果表明，增强的zmereb180表达有助于玉米自交系的渍水耐性。此外，不管是否存在胁迫处理，zmereb180在hap1基因型材料中具有相对较高的表达量，在4h处理后差异更加明显(图1中b)。根据这些结果，说明5'-utr中序列的变异影响zmereb180的表达，进而导致玉米自交系对渍水胁迫抗感性差异，根据5’-utr序列特征，在变异序列的两侧开发分子标记，命名为indel59，该标记可用于遗传材料耐渍性筛选。针对indel59设计的分子标记引物如下：f：gcaaaactaagactttctctagcar：tgtgccctgtgtatttttcgaca。实施例2：玉米zmereb180基因在拟南芥耐渍中的应用：zmereb180在拟南芥中过表达分析为分析zmereb180异位表达是否会增强其渍水胁迫的抗性，利用35s组成型表达启动子，在拟南芥中过表达zmereb180，并进行耐淹水表型鉴定。通过遗传转化，共获得13个阳性转化事件(oe1-oe13)。选择表达量高的oe5和oe8进行表型实验，并以野生型(wt)为对照。zmereb180在oe5和oe8中都明显被超表达，并且淹水胁迫能够明显增强其表达(图2中a)。生长3周的拟南芥幼苗，wt与oe5和oe8间在生长势方面无明显的差异；完全淹没处理10天后，恢复生长9天，oe5和oe8能够恢复正常生长，而wt表现为弱小枯萎状(图2中b，c)，oe5和oe8地上部分鲜重显著高于wt(图2中d)。进一步分析拟南芥四个厌氧响应标记基因(atadh1，atpdc1，atsus1和atsus4)在wt、oe5和oe8中的表达模式发现，过表达zmereb180植株能够增强淹水胁迫后厌氧响应标记基因的表达。这些结果表明过表达zmereb180能够增强拟南芥耐淹水能力。过表达载体构建方法：利用同源重组法构建zmereb180拟南芥超表达载体，具体操作流程根据试剂盒clonexpressii/onestepclonekit(vazyme)进行。超表达载体启动子为35s组成型表达启动子，选择单酶切线性化质粒，酶切位点为smai(cccggg)。将zmereb180在b73中完整的cds(codingsequence)(seqidno.1所示)序列从t载体上扩增下来，并根据试剂盒说明进行重组反应，同源重组引物序列如下：f：tcgactctagaggatccccgggatgtgcggaggcgccatcr：aattcgagctcggtaccccgggtcagaaaacagaaccgtcgacg重组产物转化大肠杆菌；挑取单克隆菌斑，pcr鉴定后送公司测序；比对测序结果，选取正确的单克隆，摇菌扩繁提取质粒，即可用于拟南芥遗传转化。农杆菌双元载体的构建：1)取1μg左右的重组质粒dna加入到50μl感受态细胞中，混匀后冰浴30min；2)转入电击杯中(电击杯-20度预冷)；3)在15-20kv/cm电压，时间常数4.5-5.0ms；4)电击完毕后，加入400μllb液体培养基(不含抗生素)轻轻吹打混匀，将菌液转移至1.5ml离心管中，37℃，180rpm摇床恢复1-2h；5)离心去掉350μl上清，将菌液涂在含50μg/mlkanamycin+利福平的lb平板上，28℃培养1.5-2d到形成单菌落。花序侵染法转化拟南芥的流程：1)拟南芥种植于光照培养箱内，培养条件为：恒温22℃，昼夜时长分别为13和11小时，湿度为60％。在拟南芥盛花期花蕾较多时，通过侵染花序进行转化。种植或者移栽拟南芥之前都需要提前一天泡土，泡土过程中要加足量的水。营养土和蛭石1：1比例混合，营养土和蛭石均需灭菌处理。2)在大钵子(10cm×10cm)里种上几十颗野生型拟南芥，等它们长成小苗后移栽，每盆移栽5颗(不要等它们长大了再移栽，因为这时它们的根会缠绕在一起，很不好移栽，而且还容易伤根)。种下拟南芥后需要浇水并盖膜，盖膜的目的是为了保持水分。注意：移栽拟南芥后还需要盖3到4天的膜，因为刚移栽的苗子比较小。3)电转后检测阳性的克隆，先用2ml离心管少量摇菌，每管装1ml的lb(含50ug/ml的kan和rif)，分装2管,28℃180rpm培养过夜(时间灵活掌握，有时候需要摇更长的时间才能浑浊)。4)待浑浊后再转移到500ml三角瓶(按1：50的比例接菌)，28℃180rpm培养8-10h直到od值为1.2-1.6。5)4000rpm离心15min富集农杆菌。6)重悬于渗透缓冲液(1/2ms培养基+5％的蔗糖配置后灭菌，加终浓度0.02-0.03％的silwettl-77，震荡混匀)，以重悬渗透缓冲液作对照，调节od600＝0.8-1.0。7)在拟南芥初次开花时将花蕾剪掉，可以促进侧枝有更多的花枝的增生。适合转化植株的花卉并没有成熟，也没有产生已受精的角果。在用花序侵染法转拟南芥之前，先用剪刀剪去已经长成的角果(因为这些角果将来结的种子肯定是非转基因的，如果不剪掉的话会降低阳性率)，把100ml的5﹪的蔗糖悬浮的菌液倒入大皿内，然后把拟南芥的花序浸入进去侵染50s，侵染的过程要转动钵子，侵染后用滤纸擦干，侵染后的拟南芥要用黑色塑料袋或者薄膜覆盖，暗培养24小时。侵染后悉心照料，保持水分充足。拟南芥的盛花期较长，一般要侵染2-3次。8)角果自然开裂后就可以收种子(约30d),此时收的种子是t1种子。拟南芥阳性苗筛选：1)角果开裂后收获t1代种子，在无菌固体培养上筛选拟南芥阳性苗。配制1/2ms培养基，高温灭菌(115度15分钟)，在超净台里倒入灭菌的培养皿，一般一个培养皿内装25ml左右培养基，待充分凝固之后平放密封保存，保存在4度，150ml筛选培养基中加入25μl浓度为50mg/ml的潮霉素(hygromycinb，roche)。2)将拟南芥种子用75％的酒精洗1min，去上清；用50％的84消毒液洗2min，去上清，重复2次；无菌水清洗3～5次；用0.1％的无菌琼脂糖悬浮，将种子均匀撒播在1/2ms培养皿上，用封口膜将平皿封闭。3)将平板置于光照培养箱内培养，温度22℃，13h/11h光周期。4)大约7－10天后，拟南芥根须和芽均已长出，长到3至4片叶后将幼苗移入土中培养。营养土准备方法同上。5)在托盘中浇水，通过毛细作用由底部的孔吸收上去，保证土壤湿润。刚移植的前两天可以用基本上透明的盖子盖住盆顶。筛选培养基配方(1l)：2.2克ms；30克蔗糖；8克琼脂，利用氢氧化钠溶液将ph调至5.6～5.8之间，灭菌处理。150ml筛选培养基中加入25μl浓度为50mg/ml的潮霉素(hygromycinb，roche)。实施例3：玉米zmereb180基因在玉米耐渍中的应用：zmereb180在玉米中过表达分析在玉米优良自交系c01中利用组成型启动子ubi过表达zmereb180(seqidno.1所示)，获得20个t0阳性转化事件，并对其自交纯合。在t2代，选择两个不同转化事件来源的表达量高的过表达家系oe115和oe240进行渍水表型鉴定。c01、oe115和oe240幼苗正常生长至二叶一心期时，各基因型材料在苗高、根长、地上部分鲜重、地下部分鲜重和spad值等性状均无明显的差异，表明过表达zmereb180不影响正常条件下植株生长。表达量分析发现，oe115和oe240在正常条件下(0h)表达量约为c01的4-5倍，短时间(4h)渍水处理能够增强zmereb180在c01、oe115和oe240中的表达；但在长时间(1d和3d)渍水处理后，oe115和oe240仍维持着较高水平的表达，而c01中zmereb180表达较4h处理明显降低(图3中a)。渍水处理15天后，过表达株系oe115和oe240仅第一叶完全枯黄，而c01心叶已完全枯萎(图3中b，c)。过表达株系oe115和oe240保持着较完整的根系系统，也诱导产生了发达的不定根系统，而c01的根系系统基本被氧化，并且产生的不定根也较少(图3中c)。最长根系长度、地上部分鲜重、不定根数目、最长不定根长度以及不定根的平均长度在过表达株系oe115和oe240中均显著高于c01(图3中d-h)。这些结果表明过表达zmereb180能够增强玉米苗期耐渍性。过表达载体构建方法：利用同源重组法构建zmereb180玉米过表达载体，具体操作流程根据试剂盒clonexpressii/onestepclonekit(vazyme)进行。过表达载体启动子为ubi组成型表达启动子，选择单酶切线性化质粒pcambia3300，酶切位点为smai(cccggg)。将zmereb180在b73中完整的cds(codingsequence)序列从t载体上扩增下来，并根据试剂盒说明进行重组反应。重组产物转化大肠杆菌，挑取单克隆菌斑，pcr鉴定后送公司测序；比对测序结果，选取正确的单克隆，摇菌扩繁提取质粒，即可用于玉米遗传转化。玉米遗传转化步骤：1)将以上构建好的载体通过电击法转入农杆菌eha105中，pcr进行鉴定；2)以新鲜剥离的1mm左右的玉米幼胚为材料，将剥取的玉米胚放入含有1.8ml悬浮液的2ml塑料离心管中，30min内大约处理未成熟幼胚150个；3)吸去悬浮液，余下玉米胚在管中然后加入1.0ml农杆菌悬浮液，放置5min；4)将离心管中的幼胚悬浮后倒入共培养基上，并用移液器吸去表面多余的农杆菌菌液，于23℃黑暗共培养3天。5)共培养后，将幼胚转移到休息培养基中，于28℃黑暗培养6天后，放至含5mg/lbialaphos的筛选培养基上，开始筛选培养两周，然后转到含8mg/lbialaphos筛选培养基上筛选培养2周；6)将抗性愈伤组织转移至分化培养基1中，25℃，5000lx，光照培养1周。7)再将愈伤转移至分化培养基2中，光照培养2周；将分化生出的小苗转移至生根培养基上，25℃，5000lx，光照培养直到生根；8)将小苗转入小盆中生长，一定生长阶段后移栽于温室中，3-4个月后收获后代种子。实施例4：针对该序列设计的引物在玉米育种中的应用：利用indel59标记(f：gcaaaactaagactttctctagca，r：tgtgccctgtgtatttttcgaca)可以通过pcr扩增区分hap1(抗性)和hap2(敏感性)两种不同的基因型。在248份重测序的自交系中，hap1在渍水胁迫后的存活率高于hap2，且hap1平均的存活率约为0.55，而hap2平均的存活率约为0.40(图4)。以上结果表明，可以利用分子标记indel59对自交系进行抗感性筛选。序列表<110>华中农业大学<120>玉米基因zmereb180在植物耐渍中的应用<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1023<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1atgtgcggaggcgccatcctcgcggagctgatcccgccgacgcggcgcgtggcgtcgaag60ccggtgacagaaggccacctctggtcggcgagctccaagaaagccggcagcggcagggac120aagaggcaccagcacgaatacgccgacgatgacttcgaggccgccttcgaggacttcgac180gacgactttgacgtgcatgaagacgacgaggacggccacttcgtattctcgtccaaatcc240gccttgtccccagccctgcacgacgggcgcgcggcgagccagaagaagcagcgcgggcgc300cagttccgcggcatccggcagcggccctggggcaagtgggcggcggagatccgcgacccg360cacaagggcacccgcgtctggctcggcaccttcagcaccgccgaggacgccgcccgggcc420tacgacgtggaggcgcgccgcctccgcggcagcaaggccaaggtcaacttccccgcagcc480agcggtcgcgctcgcggtcgcgcgcgcccacgccgcggcgacgacggcaacccacgaacc540gcgccggaaacgcagcacccagcacagcccgctctgctgcctcgaggagagagagagacg600cagaggaaggaagggatcgccgccgtgaagccagaagctacggagtcgttcgacgtgggc660ggcggtctcttcttcgacatggccttccccaccttcccagcctcgccgccgccgcaggcc720gtggatacgtccttcgccggcagcaccgccacgtcggagaccgggagccccgcgaagagg780ccgagatgcgacgaagactcgtccgagggcggcagcggctccgcgctggagctcgctgac840gagctggcgttcgacccgtttgtgctgctgcagatgccctactcgggtgggtacgacgac900gactcactggacggccttttcgccgcagatgaggccgtgcagcaggacgtgggcaacggc960atggacggcgtccgcctgtggagcttcgacgagttccccgccgtcgacggttctgttttc1020tga1023<210>2<211>365<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tatattttttcctttgtctgttttcataaaatgcaaaactaagactttctctagcagatt60gtacatataacatgtaaaacatcattttacaccgtagagaacgtcacaacactgtttata120gaagatggcgagaaagcctaagaaagggaacccaatgcaacgtggctcaccacgtggcac180atcacaattcatcgtgtcatccagtaagctgcgctaggcgtgtggccatgtggcatatct240tgctagtcaccatgccaagtcatccgccaacggtcctactgtcctagctagtttataaat300ctcctctctccgccggcaaccttattggtatcaagaaaaacttgtcgaaaaatacacagg360gcaca365<210>3<211>410<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tatattttttcctttgtctgttttcataaaatgcaaaactaagactttctctagcagatt60gtacatataacatgtaaaacatcattttacaccgtagagaacgtcacaacactgtttata120gaaggggatcgtatccagtgcacggcgtggcccttgtacactggatacgatcccttatag180aagatggcgagaaagcctaagaaagggaacccaacgtggctcaccacgtggcacatcaca240attcatcgtgtcgtccagtaagctgcgctaggcgtgtggccatgtggcatattttgctag300tcaccatgccaagtcatccgccaacggtcctatcttgtttataaatctcctctctccgcc360ggcaaccttattggtatcaagaaaaacttgtcaaaaatacacagggcaca410<210>4<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gcaaaactaagactttctctagca24<210>5<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tgtgccctgtgtatttttcgaca23当前第1页12当前第1页12