用于检测肺炎链球菌的引物组及试剂盒的制作方法

本发明涉及体外诊断
技术领域：
，尤其涉及一种用于检测肺炎链球菌的引物组及试剂盒。
背景技术：
：肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae，sp)为革兰染色阳性球菌，多呈双排列或短链排列。有荚膜，其毒力大小与荚膜中的多糖结构及含量有关。根据荚膜多糖的抗原特性，可分为86个血清型。成人致病菌多属1-9型及12型，以第3型毒力最强，儿童则多6,14,19以及23型。机体免疫功能正常时，肺炎链球菌是寄居在口腔及鼻咽部的一种正常菌群，带菌率随年龄，季节及免状态的变化有差异。机体免疫功能受损时，有毒力的肺炎链球菌入侵人体而致病。肺炎链球菌肺炎是由肺炎链球菌感染所引起的肺炎，约占社区获得性肺炎的半数。通常急骤起病，以高热，寒战，咳嗽，血痰及胸痛为特征。sp除引起肺炎外，少数可发生菌血症或感染性休克，老年人及婴幼儿的病情尤为严重。现有技术中对肺炎链球菌的快速检测方法如下：1、传统的培养方法(国标法)，即从血液或胸腔积液培养分离获得sp仍然作为诊断的金标准；2、乳胶凝集法，该法是一种针对肺炎球菌荚膜抗原的免疫学凝集方法；3、自动化方法，目前微生物检测的自动化仪器已普通使用，对于肺炎链球菌检测常见方法有：ape20streep鉴定试条、vitekmas系统、phoenixmic/id鉴定板和micro-sanwalkaway等；4、免疫层析法(immunochromatograhy，ict—，目前广泛用于sp诊断的快速方法，其检测为sp各血清型所共有的抗原c多糖。该方法可用于检测尿液、胸腔积液、脑脊液和支气管灌洗液；5、核酸扩增技术，pcr(polymerasechainreaction，聚合酶链式反应)属于一种核酸体外扩增技术，靠寡核苷酸指导的dna合成的重复循环来实现对靶核酸序列的扩增，并采用凝胶或探针杂交检测扩增的dna。但上述的方法中仍然存在不足之处，采用传统的培养方法(国标法)、乳胶凝集法和免疫层析法检测，会出现假阳性或假阴性结果，影响实验结果的准确性；自动化方法由于自动化鉴定系统是根据数据库中所提供的背景资料鉴定细菌，数据库资料的不完整将直接影响鉴定的准确性，而且目前尚无一个能包括所有细节鉴定资料的鉴定系统；而核酸扩增技术(pcr)虽然结果好于上述4种方法，但是pcr扩增产物需要进行后处理，而pcr产物后处理存在污染，仍会导致假阳性结果，并且会对环境造成污染，对实验人员有潜在的危害。技术实现要素：本发明的目的是提供一种检测肺炎链球菌的引物组和试剂盒，具有操作快速、方法简单、检测灵敏度高、特异度强和准确度好的优点。本发明提供一种用于检测肺炎链球菌的引物组，所述引物组包括如以下核苷酸序列所示的引物及探针：上游引物：5’-ggctgctggaacatcgatac-3’下游引物：5’-acagcgctacagtcaatgtc-3’探针：5’-fam-tgtccttaacgttgtctgcaacggc-tamra-3’内标上游引物:5’-ggcatgtggaggaaggtggt-3’内标下游引物:5’-ccatggactggctctccgtt-3’内标探针:5’-hex-acgcagccctgcttcgttcgccg-tamra-3’。本发明还提供一种用于检测肺炎链球菌的试剂盒，所述试剂盒包括pcr反应液，所述pcr反应液包括如以下核苷酸序列所示的引物及探针：上游引物：5’-ggctgctggaacatcgatac-3’下游引物：5’-acagcgctacagtcaatgtc-3’探针：5’-fam-tgtccttaacgttgtctgcaacggc-tamra-3’内标上游引物:5’-ggcatgtggaggaaggtggt-3’内标下游引物:5’-ccatggactggctctccgtt-3’内标探针:5’-hex-acgcagccctgcttcgttcgccg-tamra-3’。在本发明提供的用于检测肺炎链球菌的试剂盒一较佳实施例中，所述pcr反应液中各引物的终浓度为0.4μmol/l，各探针的终浓度为0.125μmol/l。在本发明提供的用于检测肺炎链球菌的试剂盒一较佳实施例中，所述试剂盒还包括酶混合物，所述酶混合物为热启动酶和ung酶的混合液。在本发明提供的用于检测肺炎链球菌的试剂盒一较佳实施例中，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。在本发明提供的用于检测肺炎链球菌的试剂盒一较佳实施例中，所述阳性对照品为肺炎链球菌标准菌株悬液中提取的基因组dna，所述阴性对照品为生理盐水。在本发明提供的用于检测肺炎链球菌的试剂盒一较佳实施例中，所述试剂盒还包括内标，所述内标的核苷酸序列如下：tcacaagcaggagtgtgccaggagaaggccaaaccatccagtgccggtggtttgaccacgaggagtgcatcctgcacggagtcactgagctcgtgacctccacgctgctcgtcccctgcgctatcgagagggcactctctgtgtctcagctggtgccgctggcgcagagtgttttgggccccttaaagctcagcatggctggttctggagagatggaaaagagaaaggatttcccccatttgggtgcctcgggcatgtggaggaaggtggtccggcgaacgaagcagggctgcgtgaaggggatctgataacccacgtcaacggagagccagtccatgg。本发明还提供一种如上文所述的引物组在制备检测肺炎链球菌的试剂盒中的用途。相较于现有技术，本发明提供的用于检测肺炎链球菌的引物组及试剂盒有益效果在于：一、本发明提供的试剂盒操作快速、方法简单、检测灵敏度高，特异度100％，应用该试剂盒可对未知样本中的肺炎链球菌进行快速准确的检测，为诊断肺炎链球菌感染提供可靠的实验依据，特别适合在临床检验工作中普及应用。二、pcr反应液中包括针对肺炎链球菌设计的特异性引物、探针及针对内标的特异性引物及探针，基于内标具有表达稳定的优点，可以有效避免假阴性的发生，且还能较好地对目的基因表达量进行校正，从而提高本发明方法的灵敏度和重复性，使得检测结果更加准确可靠。附图说明图1为本发明提供的用于检测肺炎链球菌试剂盒中阴性对照品的pcr扩增曲线图；图2为本发明提供的用于检测肺炎链球菌试剂盒中阳性对照品的pcr扩增曲线图；图3为临床样本的pcr扩增曲线图。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1：引物和探针的设计与合成在国际权威数据库genbank核酸数据库(nucleotide)中下载streptococcuspneumoniae的参照序列(genbank:nc_003098.1,序列全长2038615bp)，并使用免费开源的kers工具jellyfish(https://github.com/gmarcais/jellyfish)对全基因组序列进行连续切割，挨个碱基划动得到的序列长度为80到250的核苷酸序列库，从中优选重复较多(>＝2)的序列比对到ncbi的nr数据库，最终得到高度保守序列spec_i29457。以此目的序列为模板，使用primerpremier3.0及methylprimerexpressv1.0软件，分别设计特异性引物及探针，针对肺炎链球菌引物的探针采用5'-fam及3'-trama标记，内标探针采用5'-hex及3'-trama标记。特异性引物及探针序列：实施例二、试剂盒的制备本发明提供一种用于检测肺炎链球菌的试剂盒，所述试剂盒包括含有实施例一提供的特异性引物及探针的pcr反应液、酶混合物、阳性对照品、阴性对照品及内标，其中：pcr反应液：所述pcr反应液中各成分及各成分的终浓度分别为：0.4μmol/l的上游引物、0.4μmol/l的下游引物、0.125μmol/l的探针、0.4μmol/l的内标上游引物、0.4μmol/l的内标下游引物、0.125μmol/l的内标探针；酶混合物：所述酶混合物为热启动酶(0.01u/μl)和ung酶(0.03u/μl)的混合液；阳性对照品：所述阳性对照品为肺炎链球菌标准菌株悬液中提取的基因组dna；阴性对照品：所述阴性对照品为生理盐水；内标：所述内标的核苷酸序列如seqidno.7所示：seqidno.7：tcacaagcaggagtgtgccaggagaaggccaaaccatccagtgccggtggtttgaccacgaggagtgcatcctgcacggagtcactgagctcgtgacctccacgctgctcgtcccctgcgctatcgagagggcactctctgtgtctcagctggtgccgctggcgcagagtgttttgggccccttaaagctcagcatggctggttctggagagatggaaaagagaaaggatttcccccatttgggtgcctcgggcatgtggaggaaggtggtccggcgaacgaagcagggctgcgtgaaggggatctgataacccacgtcaacggagagccagtccatgg。实施例3本实施例提供上述实施例2所述试剂盒用于检测样本中肺炎链球菌的操作步骤：一、生物样本取深部痰，及时送检。共收集样本197，所有临床样本均来源于深圳市儿童医院。二、样本提取：1)痰液中加4倍体积的生理盐水，用1ml的加样枪反复吹打后，置4℃冰箱过夜，使痰液充分液化；2)取液化痰液1ml至1.5ml置于离心管中，12000rpm离心5分钟；3)取内标加入到样本处理液中，加入比例为1：50；4)离心液去上清，沉淀中加入50μl样本处理液，充分混匀，100℃恒温处理10分钟；5)12,000g离心5分钟，备用。在本实施例中，从临床样本中选择了1例进行检测。三、向pcr反应管中加样向每个pcr反应管中分别加入步骤二提取的样本、阳性对照品、阴性对照品各3.5μl，pcr反应液15.7μl，酶混合物0.8μl，总体积为20μl，注意避免产生气泡，盖好管盖后充分混匀，转移至扩增区。四、荧光pcr反应1)将pcr反应管排好放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置好各pcr反应管的名称；按表1设置pcr反应参数；2)pcr反应条件如表1所示表1五、荧光通道选择选择fam通道检测样本，选择hex通道检测内标。六、结果分析及检测结果解释反应结束后，保存结果。根据pcr仪说明书及荧光曲线自动或手动调整基线和阈值。阈值设定原则以阈值刚好超过阴性对照检测荧光的最高点。设定好后，点击分析“分析(analyze)”按键，可以从报告(reports)窗口得到各样本的ct值。在满足质量控制的条件下，待测样本检验结果可能出现以下几种情况：1)如果fam通道和hex通道均没有出现s型扩增曲线，检测结果无效，可能出现了管内抑制，应重新提取样本检测。2)如果fam通道出现s型扩增曲线，则待检测样本为阳性；3)如果fam通道没有出现明显s型扩增曲线，且hex通道的ct值小于或等于35，则为阴性。具体如表2所示：表2通过对已确定的阳性对照品与阴性对照品进行检测，检测所得到的pcr扩增曲线请参考图1、图2、表3和表4，图1为本发明提供的用于检测疱疹类病毒ebv试剂盒中阴性对照品的pcr扩增曲线图；图2为本发明提供的用于检测疱疹类病毒ebv试剂盒中阳性对照品的pcr扩增曲线图；图1对应的fam和hex通道ct值如表3所示；图2对应的fam和hex通道ct值如表4所示。从图1和表3可以看出，检测阴性对照品时，fam通道没有出现s型扩增曲线，hex通道的ct小于35，从图2和表4可以看出，检测阳性对照品时，fam通道出现了明显的s型扩增曲线，试剂阴阳性对照品符合率100％。表3ctfam-hex32.72表4ctfam24.20hex31.41样本的检测结果详见图3和表5，图3为临床样本的pcr扩增曲线图；图3对应的fam和hex通道ct值如表5所示。表5本发明提供的用于检测肺炎链球菌的引物组及试剂盒有益效果在于：一、本发明提供的试剂盒操作快速、方法简单、检测灵敏度高，特异度100％，应用该试剂盒可对未知样本中的肺炎链球菌进行快速准确的检测，为诊断肺炎链球菌感染提供可靠的实验依据，特别适合在临床检验工作中普及应用。二、pcr反应液中包括针对肺炎链球菌设计的特异性引物、探针及针对内标的特异性引物及探针，基于内标具有表达稳定的优点，可以有效避免假阴性的发生，且还能较好地对目的基因表达量进行校正，从而提高本发明方法的灵敏度和重复性，使得检测结果更加准确可靠。以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的
技术领域：
，均同理包括在本发明的专利保护范围内。sequencelisting<110>深圳市儿童医院<120>用于检测肺炎链球菌的引物组及试剂盒<130>2018<160>7<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>1ggctgctggaacatcgatac20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>2acagcgctacagtcaatgtc20<210>3<211>25<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>3tgtccttaacgttgtctgcaacggc25<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>4ggcatgtggaggaaggtggt20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>5ccatggactggctctccgtt20<210>6<211>23<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>6acgcagccctgcttcgttcgccg23<210>7<211>339<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>7tcacaagcaggagtgtgccaggagaaggccaaaccatccagtgccggtggtttgaccacg60aggagtgcatcctgcacggagtcactgagctcgtgacctccacgctgctcgtcccctgcg120ctatcgagagggcactctctgtgtctcagctggtgccgctggcgcagagtgttttgggcc180ccttaaagctcagcatggctggttctggagagatggaaaagagaaaggatttcccccatt240tgggtgcctcgggcatgtggaggaaggtggtccggcgaacgaagcagggctgcgtgaagg300ggatctgataacccacgtcaacggagagccagtccatgg339当前第1页12