本发明属于植物病害生物防治技术领域。具体而言，本发明涉及一株甲基营养型芽孢杆菌及其在防治白蜡褐斑病中的应用，以及采用该甲基营养型芽孢杆菌制备的生物防治制剂。
背景技术：
白蜡因其具有较强的适应能力，且生长快、抗性强、材质好、经济价值高，并具有耐干旱、耐盐碱、耐瘠薄等特点，而成为我国沿海湿地用材林、防护林、风景林等造林的优良树种。近年来，随着城市绿化广泛推广使用，地区间树种苗木的调运，环境条件的恶化等诸多因素造成白蜡树病害的增多，其中白蜡褐斑病(cercosporafraxinitesell.etev.)是白蜡常见病害之一。白蜡褐斑病由梣假尾孢菌(cercosporafraxinitesell.etev.)引起，危害白蜡叶片，6～7月爆发。白蜡褐斑病的发生可使白蜡在早期出现落叶现象，导致白蜡树的生长量下降，严重影响着园林绿化美化效果。
目前生产上常采用化学药剂防治白蜡褐斑病。化学防治极易造成农药残留，污染环境，并且化学农药的长期使用，使得病原菌产生抗药性，导致防治效果下降甚至失败。生物防治，对人畜安全、环境兼容性好且病原菌不易产生抗药性，具有化学杀菌剂不具有的优势，正逐步成为代替化学杀菌剂的最佳方式。而获得高效拮抗菌是生物防治的基础。
甲基营养型芽孢杆菌是一类嗜温、好氧、产芽孢的杆状细菌，该菌广泛存在于自然界及植物根茎等内部器官中，安全无毒，且具有广谱的抗菌活性和极强的抗逆能力。近年来，国内学者对甲基营养型芽孢杆菌在植物生防、促生等方面应用研究较多。已有研究指出，该菌对水稻青枯病、香蕉枯萎病等具有较强的抑制作用，并能促进作物生长。可见，甲基营养型芽孢杆菌在防治病害发生和促进作物生长等方面显示出广阔的应用前景。也正因如此，甲基营养型芽孢杆菌被越来越多的企业看中，作为生产生物菌剂的功能菌所用。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种用于高效防治白蜡褐斑病的新的微生物——甲基营养型芽孢杆菌菌株tj2。本发明的甲基营养型芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产量大、抗逆性强，在植物(尤其是白蜡)表面能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：本发明所提供的菌株为甲基营养型芽孢杆菌(bacillusmethylotrophicus)菌株tj2，是从烟台市莱州湾海泥中分离获得的，已于2017年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为cgmccno.14675。其具有以下生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或lb(luria-bertani)培养基上该菌株形状为杆状，鞭毛特征明显，单菌落为圆形，污白色、不透明、中央隆起、边缘整齐，后期有褶皱；在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。
本发明甲基营养型芽孢杆菌(b.methylotrophicus)菌株tj2的培养方法或繁殖方法包括：
(1)普通培养保存采用lb培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml，ph调至7.0～7.2。
(2)实验室液体培养采用lb液体培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，ph调至7.0～7.2。
(3)固体培养基配方：包括固料和无机盐，所述固料和无机盐的质量比为98.5∶0.5；所述固料按质量比计为，稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝53∶27∶15∶5；所述无机盐的组分及质量比为：磷酸二氢钾16％，硫酸镁5％，硫酸铵10％，轻质碳酸钙69％。
(4)大量发酵培养配方：同(3)中固体培养基配方。
本发明还提供一种用于防治白蜡褐斑病的生物防治制剂，所述生物防治制剂包括所述的甲基营养型芽孢杆菌(b.methylotrophicus)菌株tj2。
并且，本发明还提供了一种用于防治白蜡褐斑病的生物防治方法，所述生物防治方法包括向具有褐斑病的白蜡植株施用上述甲基营养型芽孢杆菌(b.methylotrophicus)菌株tj2或者上述生物防治制剂。
本发明也提供了上述甲基营养型芽孢杆菌菌株或者上述生物防治制剂在防治白蜡褐斑病中的用途。
本发明所述的生物防治制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备所述甲基营养型芽孢杆菌菌株tj2的种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，28～30℃下恒温培养；
(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水混合，用灭菌纱布过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28～30℃、相对湿度85％以上的发酵室中进行发酵培养。
在本发明的一个具体实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将所述甲基营养型芽孢杆菌菌株tj2的孢子移植到lb液体培养基，28～30℃摇床振荡培养3～5d得到种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比10％的比例接种到固体培养基中，28～30℃下振荡培养3～5d；
(3)将步骤(2)培养的培养物用无菌水按质量比1∶15的比例混合，用灭菌纱布过滤，将滤液按体积比1∶6的比例接种至大量发酵培养基，室温28～30℃、相对湿度85％以上的发酵室中发酵培养8～9d。
其中，步骤(1)中的lb液体培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，ph调至7.0～7.2。
步骤(2)中的固体培养基包括固料和无机盐，所述固料和无机盐的质量比为98.5∶0.5；所述固料按质量比计为，稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝53∶27∶15∶5；所述无机盐的组分及质量比为：磷酸二氢钾16％，硫酸镁5％，硫酸铵10％，轻质碳酸钙69％。
步骤(3)中的大量发酵培养基同步骤(2)的固体培养基。
实验表明，本发明的甲基营养型芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产量大、抗逆性强，在植物表面(尤其是白蜡)能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该甲基营养型芽孢杆菌制备的生物防治制剂，不仅能够高效的防治白蜡褐斑病害，还能促进白蜡生长，是一种极具应用前景的生物防治制剂。该微生物制剂可以作为生物农药或生物肥料，防治白蜡褐斑病。试验结果表明：甲基营养型芽孢杆菌(b.methylotrophicus)菌株tj2固体发酵培养物防治白蜡褐斑病效果显著，防治效果达到75.93％，且白蜡长势良好，无药害产生。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均在本发明的保护范围内。
实施例1
1、甲基营养型芽孢杆菌(b.methylotrophicus)tj2的分离与纯化
本发明的甲基营养型芽孢杆菌(b.methylotrophicus)tj2是从海泥中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为：
(1)芽孢杆菌菌株的分离
海泥样品是于2013年11月2日取自烟台市莱州湾。称取1g海泥于100ml无菌水中，置于30℃摇床中150rpm震荡10min，然后置于60℃水浴锅中孵育30min，取100μl10-2、10-3、10-4稀释液涂布于lb培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，在30℃培养2d后挑取lb培养基上的不同形态的微生物菌落于lb培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化芽孢杆菌菌株，并编号保存。
(2)白蜡褐斑病高效拮抗芽孢杆菌菌株的筛选
①初筛：采用对峙培养法，制备pda(potatodextroseagar)平板，用打孔器在芽孢杆菌、白蜡褐斑病病原菌边缘取直径为5mm的菌饼，分别移植在平板相对的两侧中央，25℃恒温培养，逐日观察芽孢杆菌对病原菌的抑制作用。
②复筛：将筛选到的具有高效拮抗活性的芽孢杆菌菌株进行复筛，主要是经过耐温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的菌株，进行盆栽防治试验和田间试验，并对筛选得到的菌株tj2进行鉴定。
本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效防治白蜡褐斑病的甲基营养型芽孢杆菌(b.methylotrophicus)tj2。实验证明，该甲基营养型芽孢杆菌固体发酵培养物在防治白蜡褐斑病中显示出非常高效的防治效果，使得白蜡长势良好。因而，本发明的甲基营养型芽孢杆菌是具有广泛应用前景的甲基营养型芽孢杆菌新菌株，可以用于制备防治白蜡褐斑病的生物防治制剂。
2、菌株鉴定
(1)微生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或lb培养基上该菌株形状为杆状，鞭毛特征明显，单菌落为圆形，污白色、不透明、中央隆起、边缘整齐，后期有褶皱；在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。
(2)分子生物学特性
该菌株的16srdna基因序列测定结果如下(seq-1)：
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该菌株tj2鉴定为甲基营养型芽孢杆菌bacillusmethylotrophicus，已于2017年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为cgmccno.14675。
实施例2
1、甲基营养型芽孢杆菌菌种发酵过程
lb液体培养基配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，ph调至7.0～7.2。
固体培养基：固料、无机盐和水，所述固料和无机盐的质量比为98.5∶0.5；所述固料按质量比计为，稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝53∶27∶15∶5；所述无机盐的组分及质量比为：磷酸二氢钾16％，硫酸镁5％，硫酸铵10％，轻质碳酸钙69％。配制方法：加入适量的水(10-15倍质量)溶解无机盐，得到无机盐溶液；无机盐溶液与固料混合，并加入水最终调整固体培养基的含水量为40-60％，以将固体培养基攥在手中，指缝中有水但不会滴落为宜。
大量发酵培养基同固体培养基。
甲基营养型芽孢杆菌(b.methylotrophicus)菌株tj2大量固体发酵过程：
①菌种种子液培养
将甲基营养型芽孢杆菌菌株(b.methylotrophicus)tj2从试管斜面中挑取少量孢子，移至lb液体培养基中，30℃摇床振荡培养3～5d，此为种子液。
②固体生产菌种的培养
将种子液按10％的质量比接种到固体培养基(500ml三角瓶)中，30℃恒温培养3～5d，中间多次振荡。
③大量固体发酵
将②中固体培养的培养物用无菌水按1∶15比例稀释，并用灭菌纱布过滤，除去粗渣，即为生产菌液，按体积比1∶6接种于大量发酵培养基。将接种的原料置于发酵室(30℃和相对湿度85％以上)中发酵培养8～9d；活性菌可达到20亿/克。
为了明确甲基营养型芽孢杆菌(b.methylotrophicus)菌株tj2固体发酵培养物对白蜡褐斑病的防治效果，为其推广应用提供依据。我们于2016年5月～7月在山东省寿光市进行试验，现将试验结果报告如下：
1供试材料及方法
1.1供试药剂
按本发明实施例2发酵方法生产的甲基营养型芽孢杆菌(b.methylotrophicus)菌株tj2固体发酵培养物(20亿/g)；65％代森锌可湿性粉剂(山东信邦生物化学有限公司生产，市售)。
1.2试验材料与防治对象
试验材料为白蜡；防治对象为白蜡褐斑病(cercosporafraxinitesell.etev.)。
1.3试验地情况
试验地设在山东省林业科学研究院盐碱地造林试验站。试验土壤类型为盐化潮土，有机质含量为0.52％，ph值为7.3，所有试验小区栽培条件及管理措施一致，施药时白蜡褐斑病处于发病初期。
1.4试验设计及安排
本试验共3个处理，分别为甲基营养型芽孢杆菌(b.methylotrophicus)菌株tj2固体发酵培养物10倍液、65％代森锌可湿性粉剂600倍液、不施药清水作对照，每个处理4次重复，每个处理60株。于2016年5月16日、6月16日和7月11日各喷洒一次，喷药器械为工农—16型喷雾器。
1.5试验调查及计算方法
1.5.1气象条件
第1次施药(5月16日)当日晴，风力3级，最高气温为27℃，最低气温为16℃，相对湿度为42％。第2次施药(6月16日)，当日晴，风力3级，最高气温为33℃，最低气温为22℃，相对湿度为44％；第3次施药(7月11日)当日多云，风力3级，最高气温为35℃，最低气温为24℃，相对湿度为64％。
1.5.2药效及安全性调查
药效调查：最后一次施药后14d进行调查。每个处理调查50株，调查植株叶片，调查发病率，记录病情级数并计算病情指数。
安全性调查：于第一次施药后7d和14d观察白蜡的安全性，如有药害发生，详细描述药害症状并按药害程度分级标准确定药害程度。
白蜡褐斑病分级标准：
0级：叶片无病斑。
1级：病斑面积占叶面积的1/4以下。
2级：病斑面积占叶面积的1/4～1/2。
3级：病斑面积占叶面积的1/2～3/4。
4级：病斑面积占叶面积的3/4以上或引起落叶。
1.5.3药效计算方法
防治效果按式(1)、(2)计算：
式中：ck0——空白对照区施药前病情指数；
ck1——空白对照区施药后病情指数；
pt0————药剂处理前施药前病情指数；
pt1————药剂处理后施药后病情指数。
1.5.4对白蜡的直接影响
观察药剂对白蜡有无药害，记录药害的类型和程度。此外，也要记录对白蜡长势的影响。
用下列方式记录药害：
(a)如果药害能被测量或计算，要用绝对值表示，例如株高。
(b)在其他情况下，可以按下列两种方法估计药害程度和频率：
①按照药害分级方法记录每小区的药害程度，以—、+、++、+++、++++表示。
药害分级方法：
—：无药害；
+：轻度药害，不影响植物生长；
++：中度药害，可复原，不会降低植物生物量；
+++：中度药害，影响植物正常生长，对植物生物量造成一定程度的降低；
++++：严重药害，植物生长受阻，植物生物量降低严重。
②将药剂处理区与空白对照区比较，评价其药害百分率。同时，要准确描述植物的药害症状(矮化、褪绿、畸形等)。
2结果
2.1供试药剂对白蜡褐斑病的防治效果
供试药剂对白蜡褐斑病的防治效果如表1-2所示。表2结果显示，甲基营养型芽孢杆菌(b.methylotrophicus)菌株tj2固体发酵培养物和65％代森锌可湿性粉剂对白蜡褐斑病均具有较好的防治效果，其中前者的防治效果达到75％以上。
从白蜡褐斑病田间试验的病情指数来看(表2)，最后一次施药后14d，甲基营养型芽孢杆菌(b.methylotrophicus)tj2防治效果为75.93％，明显高于65％代森锌可湿性粉剂58.78％的防治效果。
表1三种药剂处理前白蜡褐斑病病害情况
表2三种药剂处理对白蜡褐斑病的防治效果
2.2白蜡安全性调查
经施药7d和14d观察，各药剂处理区与对照区相比，白蜡生长正常，无药害产生，说明甲基营养型芽孢杆菌固体发酵培养物供试浓度对白蜡安全。
3小结
3.1从病情指数和防治效果来看，甲基营养型芽孢杆菌(b.methylotrophicus)菌株tj2对白蜡褐斑病具有较好的防治效果，最后一次施药后14d其防治效果达到75％以上。
3.2从白蜡长势看，甲基营养型芽孢杆菌(b.methylotrophicus)菌株tj2对白蜡具有促进生长效果，没有药害，安全可靠。
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