本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体、其编码基因及其表达和应用。
背景技术：
近年来，真菌感染性疾病的发病率不断增高，其中白色念珠菌(candidaalbicans)是主要病原体之一。使用抗真菌药物是控制真菌感染的主要手段，但随着耐药菌株的不断增加，抗真菌药物种类较少及抗真菌药物的毒副作用等问题的出现，寻找新药源、研发新型安全有效的抗真菌感染治疗药物已经成为医学科研工作者迫切需要解决的问题。
抗菌肽(antimicrobialpeptides，amps)是生物体内具有抑杀细菌、真菌、病毒以及肿瘤细胞等生物活性的小分子肽类物质。由于amps具有抗菌谱广、低毒、不易产生耐药性等特点，因此受到广泛关注。家蝇抗菌肽maf-1a(muscadomesticaantifungalpeptide-1a)为家蝇抗真菌肽maf-1c端第128位～153位功能结构域肽段，是来源于家蝇幼虫由26个氨基酸残基组成的线性小分子抗菌肽，分子量3022.5da，其氨基酸序列如seqidno：3所示。发明人前期研究发现，maf-1a为是一阳离子多肽，n端富含赖氨酸(lys)，其二级结构主要为α-螺旋结构，具有较好的双亲性，且具有一定耐热性，maf-1a可通过多靶点作用方式对白念珠菌药物敏感株及耐药菌株产生较强的抑杀作用，具有新型抗真菌药物的开发潜力(wangt,xiuj,zhangy,etal.transcriptionalresponsesofcandidaalbicanstoantimicrobialpeptidemaf-1a[j].frontmicrobiol,2017,8:894.doi:10.3389/fmicb.2017.00894)(罗振华，吴建伟，付萍，等。人工合成家蝇抗真菌肽maf-1a对白色念珠菌致病性的影响[j]。第三军医大学学报，2013，35(20)：2203～2207)。
尽管maf-1a显示了作为新型肽类抗真菌药物的开发前景，但天然maf-1a在虫体内含量极微，而且分离纯化困难，难以满足后续研究及产业化需求。目前，获得高纯度的amps途径主要包括化学合成以及重组表达,采用化学合成费用昂贵，而重组表达amps的生产成本低，提取工艺简单，产量高，能更好的满足研究和产业化需求(klintjk,senffs,saeznj,etal.productionofrecombinantdisulfide-richvenompeptidesforstructuralandfunctionalanalysisviaexpressionintheperiplasmofe.coli[j].plosone.2013,8(5):e63865.doi:10.1371/journal.pone.0063865)。然而，小分子多肽的克隆表达、分离、纯化、鉴定都相对复杂，在表达宿主菌体内很容易降解(祁丽，姜宁，张爱忠，等。抗菌肽研发现状及其改造策略[j]。中国畜牧兽医，2016，43(2)：450～456)，因此作为由26个氨基酸残基构成的多肽maf-1a，由于其相对分子量较小，也不适合直接在重组表达宿主中表达。
技术实现要素：
为解决现有技术的不足，本发明采用基因工程技术生产maf-1a，并且采用串联表达方式，以增加小分子多肽的表达量和稳定性、提高目的多肽的得率、保持多肽活性。
本发明首先提供了一种家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体，其氨基酸序列如seqidno：1所示，分子量为23kd。前述肽聚体是以maf-1a氨基酸序列(如seqidno：3所示)为单体进行串联；设计该肽聚体基因时，根据大肠杆菌密码子偏嗜性优化该肽聚体编码序列，在5个maf-1a单体核苷酸序列(如seqidno：4所示)间设计肠激酶(ek)酶切位点；在序列的5’和3’端分别引入bamhi和hindiii酶切位点，3’端引入6×his标签，化学合成串联基因序列5×maf-1a-6×his，即：家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体氨基酸序列seqidno：1中：1～2位glyser为bamhi酶切位点，29～33位、60～64位、91～95位和122～126位aspaspaspasplys为肠激酶酶切位点；153～158位hishishishishishis为6×his标签，159～160位lysleu为hindiii酶切位点；编码家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体的基因序列seqidno：2中：1～6位ggatcc为编码bamhi酶切位点的基因序列，85～99位、181～195位、277～291位和373～387位的gacgacgacgacaag为编码肠激酶酶切位点的基因序列，469～486位的caccaccaccaccaccac为编码6×his标签的基因序列，487～492位的aagctt为编码hindiii酶切位点的基因序列。
本发明还提供了编码前述家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体(氨基酸序列如seqidno：1)的基因，优选该基因的序列如seqidno：2所示。
本发明提供了包含前述家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体基因的重组载体，优选为大肠杆菌重组载体，其制作方法是将本发明的家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体基因插入到表达载体中合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为制作重组载体的一个优选的实施方案，具体的重组载体的制作方法是将前述家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体基因插入到克隆载体puc19，得到重组质粒puc19-5×maf-1a，扩增重组质粒puc19-5×maf-1a，然后采用限制性核酸内切酶bamhi和hindiii双酶切扩增所得的重组质粒puc19-5×maf-1a，并将酶切得到的5×maf-1a基因克隆到pet-28a(+)表达载体，使该核苷酸序列位于t7启动子下游并受其调控，得到重组载体pet-28a(+)-5×maf-1a。本发明还提供了包含前述家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体基因的重组菌株，优选重组菌株是大肠杆菌roseeta(de3)(e.coliroseeta(de3))。
本发明还提供了一种高效表达前述家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体的方法，包括如下步骤：(1)用权利要求5或6所述的重组载体转化大肠杆菌，得到重组菌株；(2)使用步骤(1)中得到的重组菌株在摇瓶或发酵罐中进行发酵，诱导家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体的表达；(3)发酵结束后，回收并纯化所表达的家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体，即得。诱导前述重组菌株表达家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体的条件优选为iptg诱导浓度为0.2～1.0mmol/l，温度为18～36℃，时间为2～24小时；进一步的，最优条件为iptg诱导浓度为0.8mmol/l，温度为28℃，时间为12小时。在最优条件下表达的家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体经ni-nta纯化及酶切后，nanodrop2000检测maf-1a单体的浓度为2.0mg/ml，表明该系统能够较好的表达家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体。另外，再对前述经纯化的家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体以抗重组蛋白兔血清为一抗、羊抗兔igg(h+l)作为二抗进行westernblot鉴定，检测结果如图1所示，m为分子量标记，1为纯化后的肽聚体与抗重组蛋白兔血清的免疫印迹反应，2为阴性对照，显示5×maf-1a肽聚体能与多抗血清反应，在23kd处出现单一的特异性条带，表明maf-1a肽聚体得到很好纯化。
本发明所获得的前述纯化后的家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体在经ek酶切后获得maf-1a单体，经k-b纸片琼脂扩散法检测酶切获得的maf-1a单体对白色念珠菌(c.albicans)的抗菌活性，检测结果如图2所示，其中3、4为maf-1单体，5为阴性对照，结果显示maf-1a单体对c.albicans具有抑杀活性；另外，采用微量稀释法检测maf-1a单体对c.albicans的mic值和mbc值分别为0.5mg/ml、1.0mg/ml，表明可以通过构建的串联表达系统有效获取具有抗菌活性的maf-1a。
本发明的有益之处在于：本发明采用串联设计以表达出大分子肽聚体，肽聚体通过酶切释放多个肽单体，这不仅解决了小分子多肽单体不易分离、鉴定的问题，也提高了表达效率。同时，家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体能够较好的分离纯化，另外通过对maf-1a单体的抗菌活性的检测，说明通过本发明所得到的maf-1a在抗真菌药中具有较大的应用潜力。
附图说明
图1为家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体westernblot鉴定结果。
图2为maf-1a单体的对白念珠菌抗菌活性检测结果。
图3为sds-page电泳检测不同iptg浓度对重组蛋白表达的影响的检测结果。
图4为sds-page电泳检测不同培养温度对重组蛋白表达的影响的检测结果。
图5为sds-page电泳检测不同培养时间对重组蛋白表达的影响的检测结果。
图6为sds-page电泳鉴定蛋白表达、纯化与酶切情况结果。
附图中的标记为：1-纯化后的肽聚体与抗重组蛋白兔血清的免疫印迹反应，2-阴性对照，3、4-maf-1单体，5-阴性对照，6-空载体转化对照组，7-未诱导对照组，8～12-iptg诱导浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/l，13-空载体转化对照组，14-未诱导对照组，15～24诱导温度为18、20、22、24、26、28、30、32、34、36℃，25-空载体转化对照组，26-未诱导对照组，27～38-诱导时间为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24小时，39-诱导表达的重组菌超声后沉淀，40-诱导表达的重组菌超声后上清，41-被诱导表达的重组菌全菌蛋白，42-maf-1a肽聚体，43-maf-1a单体。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行进一步的介绍。
主要实验材料、试剂及仪器：
1.菌株与载体：质粒和菌株原核表达载体pet-28a(+)购自宝生物工程(大连)有限公司；大肠杆菌roseeta(de3)购自北京全式金生物技术有限公司；克隆载体puc19购自生工生物工程(上海)股份有限公司；白念珠菌(candidaalbicans，atcc10231)由贵州医科大学微生物学教研室保存。
2、主要试剂：
表1主要试剂
3、主要实验仪器：
表2主要实验仪器
其余未做说明试剂和仪器均可从商业途径获取。
实施例1：家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体基因的克隆
根据大肠杆菌密码子的偏嗜性进行密码子优化来设计家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体基因：在5个maf-1a单体核苷酸序列(如seqidno：4所示)间设计肠激酶(ek)酶切位点；在序列的5’和3’端分别引入bamhi和hindiii酶切位点，3’端引入6×his标签，按常规方法化学合成串联基因序列5×maf-1a-6×his，对5×maf-1a-6×his基因进行pcr扩增，然后将5×maf-1a-6×his序列导入克隆载体puc19中，即得到puc19-5×maf-1a重组质粒。
实施例2：包含家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体基因的表达载体的构建
提取实施例1中所得的puc19-5×maf-1a重组质粒，经扩增后，采用限制性核酸内切酶bamhi和hindiii双酶切puc19-5×maf-1a重组质粒，将酶切获得的5×maf-1a基因克隆到pet-28a(+)表达载体，得到重组表达载体pet-28a(+)-5×maf-1a，采用pet-28a(+)-5×maf-1a转化大肠杆菌roseeta(de3)感受态细胞，挑取可疑阳性菌落按常规方法进行pcr鉴定及测序，经测序确认pet-28a(+)-5×maf-1a重组载体构建成功。
实施例3：包含家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体基因的大肠杆菌工程菌的构建
将实施例2所得的包含家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体基因的重组表达载体pet-28a(+)-5×maf-1a转化大肠杆菌roseeta(de3)感受态细胞，lb平板(含卡那霉素100μg/ml)筛选阳性转化子，将培养后的菌液按常规方法进行测序鉴定，经测序确认含有pet-28a(+)-5×maf-1a的大肠杆菌roseeta(de3)构建成功。
实施例4：家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体的表达和纯化
取实施例3所得的鉴定结果正确的单菌落再继续接种于液体培养基(含卡那霉素100μg/ml)中，37℃振摇培养12h后，以1:100接种于新鲜lb液体培养基(含卡那霉素100μg/ml)中，37℃振摇培养至od600值为1.0，然后分别以0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mmol/l浓度的iptg培养5小时。iptg浓度为0.8mmol/l条件下于37℃分别培养2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24小时。iptg浓度为0.8mmol/l时分别于18、20、22、24、26、28、30、32、34、36℃温度下分别培养12小时。表达完毕后，取各培养物在4℃，12000r/min离心10min，收集菌体，用pbs重悬，与上样缓冲液5×loadingbuffer按4:1比例混合均匀，沸水浴15min，15％sds-page电泳检测目的蛋白的表达结果，如图3～图5所示，从结果可知，iptg终浓度为0.8mmol/l时蛋白的表达量较其他浓度高；在28℃、0.8mmol/liptg诱导条件下蛋白主要以可溶性状态存在，在该条件下诱导12小时，蛋白表达量达高峰，即最佳诱导条件为在28℃、0.8mmol/liptg培养12小时；并且sds-page电泳结果中，即图3～图5所示，目的条带在23kd，家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体的表达成功。
超声破碎诱导表达完毕的菌体，取上清与沉淀分别进行15％sds-page电泳。按照his标签纯化试剂盒说明书，采用ni-nta纯化重组蛋白，15％sds-page电泳鉴定目的蛋白。如图6sds-page电泳鉴定蛋白表达与纯化情况结果所示，经ni-nta纯化后的重组蛋白(图6中标记42：纯化后maf-1a肽聚体)与未纯化时相比，条带较为单一，表明大部分杂蛋白被去除，最后得到的家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体纯度较高。
纯化重组蛋白的westernblot鉴定：
1、重组蛋白的兔多抗血清制备：
取含有400μg化学合成重组蛋白的溶液与等体积完全弗氏佐剂进行乳化，将乳化的重组蛋白于新西兰兔背部皮下多点注射；第14d及第28d，各取含有100μg化学合成重组蛋白的溶液与等体积不完全弗氏佐剂进行乳化，于新西兰兔背部皮下多点注射进行加强免疫；加强免疫后第14d耳缘静脉采血测定抗体效价，然后采血并分离血清存于-80℃备用。
2、纯化重组蛋白的westernblot鉴定：
将纯化的重组蛋白经15％sds-page电泳分离后电转移至硝酸纤维素膜(pvdf)上，用5％脱脂奶粉室温封闭2h；用tbst洗涤3次；将pvdf与1:2000稀释5×maf-1a兔多抗血清孵育4℃过夜，tbst洗涤3次；再将pvdf与1:15000稀释的羊抗兔igg(h+l)于37℃孵育1h，tbst洗涤3次；ecl化学发光显色，同时作阴性对照，检测结果如图1所示，m为分子量标记，1为纯化后的肽聚体与抗重组蛋白兔血清的免疫印迹反应，2为阴性对照，显示5×maf-1a肽聚体能与多抗血清反应，在23kd处出现单一的特异性条带，表明重组蛋白得到很好纯化。
实施例5：家蝇抗菌肽maf-1a单体的获取及抗菌活性
用ek对纯化的重组蛋白即实施例4获得的纯化后的家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体进行酶切，按说明书操作。使用sds-page电泳检测maf-1a肽聚体及maf-1a单体，结果如图6所示：39：诱导表达的重组菌超声后沉淀；40：诱导表达的重组菌超声后上清；41：被诱导表达的重组菌全菌蛋白；42：纯化后maf-1a肽聚体；43：maf-1a单体，采用nanodrop2000检测maf-1a单体浓度(2.0mg/ml)。
酶切产物的抗菌活性检测采用k-b纸片琼脂扩散法(kusmiatik,priadid,rahayurkb.antibacterialactivitytest,evaluationofpharmacognosyandphytochemicalscreeningofsomeextractsofglobeamaranth(gomphrenaglobosa)[j].journalofpure&appliedchemistryresearch,2017,6(1):27-33.doi:10.21776/ub.jpacr.2017.006.01.288)检测酶切产物对c.albicans的体外抗菌活性，如图2所示；同时参考美国临床实验室标准化协会(clsi)推荐的m27-a3方法(johnhr,borbarada,davida,etal.referencemethodforbrothdilutionantifungalsusceptibilitytestingofyeasts；approvedstandard-thirdedition[m].clinicalandlaboratorystandardsinstitutedocumentm27-a3，2008，28(14):1-40),检测酶切产物对c.albicans的最低抑菌浓度(mic)和最低杀菌浓度(mbc)，其对c.albicansmic和mbc值分别为0.5mg/ml、1.0mg/ml，表明可以通过构建的大肠杆菌重组表达系统pet28a-5×maf-1a-e.coliroseeta(de3)可以高效获取具有抗菌活性的maf-1a单体，说明通过本发明所得到的maf-1a在抗真菌药的中具有较大的应用潜力。
序列表
<110>贵州医科大学
<120>一种家蝇抗菌肽maf-1a肽聚体、其编码基因及其表达和应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>160
<212>prt
<213>人工序列(未知)
<400>1
glyserlyslysphelysgluthralaasplysleuilegluserala
151015
lysglnglnleugluserleualalysglumetlysaspaspaspasp
202530
lyslyslysphelysgluthralaasplysleuilegluseralalys
354045
glnglnleugluserleualalysglumetlysaspaspaspasplys
505560
lyslysphelysgluthralaasplysleuilegluseralalysgln
65707580
glnleugluserleualalysglumetlysaspaspaspasplyslys
859095
lysphelysgluthralaasplysleuilegluseralalysglngln
100105110
leugluserleualalysglumetlysaspaspaspasplyslyslys
115120125
phelysgluthralaasplysleuilegluseralalysglnglnleu
130135140
gluserleualalysglumetlyshishishishishishislysleu
145150155160
<210>2
<211>492
<212>dna
<213>人工序列(未知)
<400>2
ggatccaagaaatttaaagaaaccgcagataaactgattgaaagcgcaaaacagcagctg60
gaaagcctggcaaaagaaatgaaagacgacgacgacaagaagaagaaatttaaagaaacc120
gcagataaactgattgaaagcgcaaaacagcagctggaaagcctggcaaaagaaatgaaa180
gacgacgacgacaagaagaagaaatttaaagaaaccgcagataaactgattgaaagcgca240
aaacagcagctggaaagcctggcaaaagaaatgaaagacgacgacgacaagaagaagaaa300
tttaaagaaaccgcagataaactgattgaaagcgcaaaacagcagctggaaagcctggca360
aaagaaatgaaagacgacgacgacaagaagaagaaatttaaagaaaccgcagataaactg420
attgaaagcgcaaaacagcagctggaaagcctggcaaaagaaatgaaacaccaccaccac480
caccacaagctt492
<210>3
<211>26
<212>prt
<213>家蝇(muscadomestica)
<400>3
lyslysphelysgluthralaasplysleuilegluseralalysgln
151015
glnleugluserleualalysglumetlys
2025
<210>4
<211>78
<212>dna
<213>家蝇(muscadomestica)
<400>4
aagaaatttaaagaaaccgcagataaactgattgaaagcgcaaaacagcagctggaaagc60
ctggcaaaagaaatgaaa78