本发明属于基因工程及临床医学领域，涉及检测和/或预测人类巨大儿的miRNA标志物或其组合及其应用。
背景技术：
：在儿童生长发育指标中，出生体重是新生儿健康状态的重要指标，是影响其生存质量的重要因素。新生儿出生体重异常不仅对婴儿近期健康会造成不良影响，而且会影响其成年后的健康状况。流行病学调查发现，近十年来，世界各地(加拿大、瑞典、美国、中国)低出生体重儿的发生率总体呈下降趋势，而高出生体重儿的发生率逐渐上升，全球正面临新生儿高出生体重带来的健康风险。高出生体重中，出生体重超过4000克的新生儿被称为巨大儿，国外发生率为15.1％，国内发生率为7％左右。大量的研究表明，巨大儿可导致难产和产伤的发生率增加，同样增加了如肥胖、2型糖尿病、高血压等远期并发症的发生率，而且乳腺癌和其他癌症的风险也随着出生体重的增加而增加。巨大儿带来的健康风险已经成为影响我国人口质量、造成严重社会与经济负担的重要医学难题，如何将成年疾病的预防提前是当今公共卫生领域研究的热点。因此，寻求巨大儿的早期预测和论断，并进行有效干预，对提高母婴健康水平具有重要意义。巨大儿的发生是多种因素共同作用的结果，与遗传、孕期营养、内分泌和胎盘的功能等因素有关。近年来已有大量临床观察发现，即使在营养及母体因素相似或几乎相同的情况下，新生儿的出生体重也可能出现较大差异。这是因为胎儿生长发育所需的一切营养物质都是由母体通过胎盘供应，而且胎盘中某些因子的表达(IGF-I、IGF-II、瘦素等)调控着营养物质的转运，进而影响胎儿的生长。巨大儿不仅增加孕妇的负担，且可对胎儿成年健康产生不利影响，因此我们需要在亚临床或更早、甚至孕前就采取相关的干预措施来避免或减少本病的发生、减慢病程，减轻母儿的不良结局。为此我们迫切需要寻找本病特异标志物与治疗靶点，从而尽早预测发病风险、尽早启动预防与干预措施，对减少本病的发生、改善母儿预后具有极其重要的意义！近年来越来越多的研究发现表观遗传变异在疾病发生发展中起着重要的作用，微小核糖核酸(microRNA，即miRNA)作为表观遗传的重要小分子，它是一类长约19-23个核苷酸的单链RNA分子，多位于基因组非编码区，进化上高度保守，可在转录后水平对基因表达进行调节，并与动物的许多正常生理活动密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。预测发现miRNA至少能调控数千个人类基因，占所有基因的30％以上。在动物细胞中，这些小分子RNA是从60-200nt的具有发夹状结构的前体中被切割出来而成熟，miRNA的转录初产物(pri-miRNA)很快被一种核糖核酸酶IIIDrosha加工成miRNA前体(pre-miRNA)，然后由细胞核转运至细胞质中，经另一种核糖核酸酶IIIDicer识别剪切为成熟miRNA。miRNA不编码蛋白质，而是以单链形式与辅酶因子TRBP及PACT形成RNA诱导沉默复合物，再与mRNA的3’端非编码区(3’UTR)结合，从而发挥其调控mRNA转录与蛋白翻译的总开关作用。多数的miRNA与一个特定的mRNA不是完全互补的，一个miRNA可以与同一个mRNA的不同位点靶向互补或与许多不同的mRNAs靶向互补；另外，不同的miRNAs也可以靶向调控相同的mRNA，并且有相似的生物学功能。即一个miRNA能调控多个信号通路中有关的mRNA，而多个miRNA也能调控同一种mRNA。近年来的文献报道了miRNAs在胚胎干细胞、胚胎发育早期阶段、异常妊娠结局及妊娠合并症等方面的表达，自参与调控线虫时序发育的lin-4与let-7被发现以来，miRNA已逐渐成为调控mRNA稳定性和蛋白翻译的研究热点，分别在2002年和2003年两度入选Science杂志年度十大科技突破。随着研究的深入，越来越多的miRNA被发现。目前，miRNA与肿瘤的关系已成为研究的重点，已发现若干miRNA通过负调控基因的表达与慢性淋巴细胞性白血病、肺癌、乳腺癌、结肠癌高度相关，血浆miRNA可做为多种肿瘤发生与预后的生物标志物。然而，近年来的研究结果提示，血浆miRNA有可能作为巨大儿发生的生物学标志物，用于巨大儿发生的早期预测。最新的研究成果发现血浆中存在上百种的miRNA，性质稳定、含量丰富、易于定量检测，且存在显著的疾病特异性，在肺癌、结肠癌中已经证实血浆miRNA的表达谱可作为早期诊断的潜在生物标志物。这一发现令人振奋，血浆miRNA作为一类非编码调节性的小分子RNA有可能取代传统的特异蛋白为代表的生物标志物，开拓了生物标志物的新境界。然而血浆中miRNA在巨大儿早期预测监测中的应用还未得到相应的关注，若能发现稳定的与巨大儿发生相关的特异血浆miRNA作为生物标志物，并研发相应疾病的早期预测、监测试剂盒，不仅在该领域处于国际领先地位，可创造令人瞩目的经济效益，对我国妊娠高血压的防治也将是一次强有力的推动。参考文献：1.KochL.Reproductiveendocrinology:macrosomiaindevelopingcountries.NatRevEndocrinol.2013；9(3):130.2.MaccaniMA,PadburyJF,MarsitCJ.miR-16andmiR-21expressionintheplacentaisassociatedwithfetalgrowth.PLoSOne.2011；6(6):e21210.3.ShiWW,MichaelSK.SeculartrendsoffetalgrowthinCanada,1981to1997.PaediatricandPerinatalEpidemiology,2003；17:347-354.4.YehJ,SheltonJ.Reasonsforincreasingtrendsinlargeforgestationalagebirths.ObstetGynecol.2005；105(2):444；authorreply444-5.5.BarchittaM,MaugeriA,QuattrocchiA,AgrifoglioO,AgodiA.TheRoleofmiRNAsasBiomarkersforPregnancyOutcomes:AComprehensiveReview.IntJGenomics.2017；2017:8067972.doi:10.1155/2017/8067972.6.JiangH,WenY,HuL,MiaoT,ZhangM,DongJ.SerumMicroRNAsasDiagnosticBiomarkersforMacrosomia.ReprodSci.2015；22(6):664-71.技术实现要素：本发明是通过筛查孕妇血浆中的miRNAs的特异性变化，筛选出在孕有巨大儿患者和正常健康胎儿的孕妇中表达差异显著的miRNA，通过检测这些miRNA，可评估是否孕有巨大儿患者的特异性和敏感性，本发明提供的miRNA标志物或其组合、可用于临床特别是早期人类巨大儿诊断、监测的分子标记物，具有很高的特异性和灵敏性。本发明的目的是提供与人类巨大儿发生相关的血浆microRNA标志物。本发明的另一个目的是提供上述血浆microRNA标志物的引物。本发明还有一个目的是提供含有上述血浆microRNA标志物或其引物的应用。本发明再有一个目的是提供含有上述血浆microRNA标志物或其引物的用于人类巨大儿早期预测或监测的试剂盒。本发明的目的是通过下列技术方案实现的：本发明提供一种与人类巨大儿相关的miRNA标志物或其组合，选自hsa-miR-195-5p、hsa-miR-155-5p或hsa-miR-221-3p中的一种或多种。hsa-miR-195-5p的序列为uagcagcacagaaauauuggc(SEQIDNo.1)，hsa-miR-155-5p的序列为uuaaugcuaaucgugauaggggu(SEQIDNo.2)，hsa-miR-221-3p的序列为agcuacauugucugcuggguuuc(SEQIDNo.3)。本发明所述的miRNA标志物或其组合，优选hsa-miR-195-5p、hsa-miR-155-5p或hsa-miR-221-3p中的多种，更优选包括hsa-miR-195-5p、hsa-miR-155-5p和hsa-miR-221-3p。本发明还提供所述的miRNA标志物或其组合的引物。本发明还提供具体的引物对序列：其中序列为SEQIDNo.1的标志物hsa-miR-195-5p的上游引物为SEQIDNo.4，下游引物为SEQIDNo.5；序列为SEQIDNo.2的标志物hsa-miR-155-5p的上游引物为SEQIDNo.6，下游引物为SEQIDNo.7；序列为SEQIDNo.3的标志物hsa-miR-221-3p的上游引物为SEQIDNo.8，下游引物为SEQIDNo.9。本发明所述的miRNA标志物或其组合在制备检测和/或预测人类巨大儿试剂中的应用，特别是在制备早期检测和/或预测人类巨大儿试剂中的应用。所述试剂是能够测定这些血浆microRNA标志物在血浆中表达量的试剂。检测本发明所述miRNA标志物或其组合的探针或引物在制备检测和/或预测人类巨大儿试剂中的应用，特别是在制备早期检测和/或预测人类巨大儿试剂中的应用。本发明还提供一种用于检测和/或预测人类巨大儿的试剂盒，该试剂盒含有本发明所述miRNA标志物或其组合的引物。所述的试剂盒，优选的该试剂盒含有引物对SEQIDNo.4/SEQIDNo.5，SEQIDNo.6/SEQIDNo.7或SEQIDNo.8、SEQIDNo.9中的多对。所述的试剂盒，更优选的该试剂盒含有下列3对引物：SEQIDNo.4、SEQIDNo.5，SEQIDNo.6、SEQIDNo.7和SEQIDNo.8、SEQIDNo.9。试剂盒中除引物外的其他试剂可采用现有技术中相应检测技术的常用试剂。本发明还提供所述试剂盒在检测和/或预测人类巨大儿中的应用，特别是在早期检测和/或预测人类巨大儿中的应用。本发明所述的“人类巨大儿”指新生儿出生后1小时内体重等于或大于4000克者。本发明的有益效果：本发明人通过分离和比较正常对照和巨大儿患者血浆中的miRNAs，发现本发明所述的标记物或组合可用于评估是否患有巨大儿患者的特异性和敏感性，并通过实验证明具有较好的灵敏度，巨大儿患者均被正确检测识别，因而提出了巨大儿患者的血浆miRNA标志物及其组合，以及该血浆miRNA标志物或其引物在制备巨大儿诊断或监测试剂中的应用，研制出可用于临床应用的巨大儿诊断、监测试剂盒。采用本发明血浆miRNA作为巨大儿评价的标志物的优越性在于：(1)血浆miRNA是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高巨大儿诊断的敏感性和特异性，该类小分子RNA生物标志物的成功开发是对以蛋白为主的传统生物标志物的颠覆，将为妊娠合并综合症的防治开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。(2)本发明提供的血浆miRNA标志物可用于巨大儿诊断标志物，可避免侵入性诊断，并可在早期通过微创方式获得巨大儿的患病风险，从而为临床医生进一步深入检查提供依据，为快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时采取更具个性化的防治方案提供支持，延缓和阻止疾病进展。(3)本发明通过符合巨大儿和健康对照人群的样本进行比较，证明这几种标志物表达量存在显著性差异并具有稳定性，说明本发明所述标志物或其组合具有特异性，可作为标志物使用。(4)本发明采用严密、多阶段的验证和评价体系，初期通过预实验筛选多种血浆miRNAs，应用Real-timePCR等方法进行二次验证和独立人群验证，采用分层评分系统对诊断结果进行标化，并在另一组独立人群中对血浆miRNA标志物和诊断试剂盒进行盲法评价，证明了该血浆miRNA生物标志物和诊断试剂盒的可靠性。附图说明图1以hsa-miR-195-5p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-221-3p作为标志物对健康对照和巨大儿组进行区分。图2个体血浆miRNAs表达水平波动性分析。图3正常对照组和巨大儿组之间的ROC曲线。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明的保护范围之内。下面实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。实施例1研究对象选择和分组依据本发明人于2010年7月到2012年10月间从南京医科大学附属淮安第一人民医院等医院搜集符合要求的巨大儿患者及健康对照孕妇血液样品，通过对样品资料的整理，从中选择了符合要求的80例健康对照、80例巨大儿作为Real-timePCR检测miRNA表达的实验对象。具体的样品归类标准如下：A组：健康对照组(n＝80，20人芯片筛选，30人一期验证，30人独立人群验证)：1.无其他全身性重大疾病。B组：巨大儿组(n＝80，20人芯片筛选，30人一期验证，30人独立人群验证)：1.经临床诊断为巨大儿；2.无其他全身性重大疾病。实施例2TaqManmiRNAarray筛选制备cDNA样品：a)取100μl血浆；b)加入900μlTRIzol，振荡混匀，4℃，12000rpm离心15分钟，弃下层废液；c)加入上清1.5倍体积的无水乙醇震荡混匀，转至离心柱，12000rpm离心15秒，弃下层废液；d)在离心柱上加入700μlRWT缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层废液；e)在离心柱上加入500μlRPE缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层液；f)重复e；g)将离心柱加入一个新的2ml的管子，10000rpm离心1分钟，用于去除RPE缓冲液；h)在柱子上加入50μlDEPC处理水12000rpm离心收集RNA；i)然后通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括4μl5×AMV缓冲液、2μl10mMdNTP混合液(Takara公司)、0.5μlRNA酶抑制剂(Takara公司)、1μlAMV(Takara公司)以及1.5μl单一miRNA对应的反向引物。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟。(若针对不同miRNA则采用对应的miRNA反向引物按上述步骤进行)逆转录之后的cDNA按下表1反应体系配制进行预扩增：表1反应体系预扩增的反应条件如下表2所示：表2反应条件将预扩增产物简短离心后，加入0.1×TE(pH8.0)75μl，颠倒混匀后再做简短离心。预扩增产物可以直接用于下面的实时荧光定量PCR(qPCR)。预扩增产物进行qPCR按下表3所示配制反应体系：表3反应体系考虑到吸液损失而放量12.5％。检测并比较健康对照、巨大儿血浆样本中miRNAs表达谱的差异，筛选出有4倍差异以上的miRNAs。经生物信息学分析和动物实验结果，选定其中3条成为候选并进行进一步验证，具体为：hsa-miR-195-5p(SEQIDNo.1)、hsa-miR-155-5p(SEQIDNo.2)、hsa-miR-221-3p(SEQIDNo.3)。实施例3Real-timePCR方法测量血浆miRNA表达量设计引物(表1)分别对80例健康对照、80例巨大儿患者的血浆进行各miRNAs的定量Real-timePCR检测。(1)制备cDNA样品：a)取100μl血浆；b)加入900μlTRIzol，振荡混匀，4℃，12000rpm离心15分钟，弃下层废液；c)加入上清1.5倍体积的无水乙醇震荡混匀，转至离心柱，12000rpm离心15秒，弃下层废液；d)在离心柱上加入700μlRWT缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层废液；e)在离心柱上加入500μlRPE缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层液；f)重复e；g)将离心柱加入一个新的2ml的管子，10000rpm离心1分钟，用于去除RPE缓冲液；h)在柱子上加入50μlDEPC处理水12000rpm离心收集RNA；i)然后通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括4μl5×AMV缓冲液、2μl10mMdNTP混合液(Takara公司)、0.5μlRNA酶抑制剂(Takara公司)、1μlAMV(Takara公司)以及1.5μl单一miRNA对应的反向引物。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟；(2)Real-timePCR：染料法：取1μlcDNA，将cDNA倍比稀释，加入0.3μlTaq酶(Takara公司)，1μl20×EVAGREEN，0.25μl10μM上述单一miRNA对应的正向引物，0.25μl10μM通用反向引物(URP)，1.2μl25mMMgCl2，1.6μl2.5mMdNTP混合液(Takara公司)，2μl10×PCR缓冲液，12.4μl纯水，20μl体系进行荧光定量PCR。10μlTaqManuniversalPCRmasterMix，6.6μlH2O，20μl体系进行q-PCR。仪器使用的都是ABIPrism7900荧光定量PCR仪，PCR的反应条件都是：95℃、5分钟进行1个循环→95℃、15秒，60℃、1分钟进行40个循环。检测并比较健康对照组、巨大儿组血浆样本中miRNA表达量的变化，各组样品血浆miRNA的表达量比值可用方程2–△G表示，其中△G＝CTmiRNA–CTU6。为保证各次实验间的可比性，我们在每板上都设置了U6，以其表达量作为内参调整计算表达量。从结果分析得出，hsa-miR-195-5p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-221-3p这三条miRNA在各组间均有显著差别(图1)。非参数的趋势性检验也显示了相同的差异。表4miRNAs的引物序列引物名称对应miRNA引物序列hsa-miR-195-5p-FACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACAGAAAThsa-miR-195-5p-RCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCCAATAThsa-miR-155-5p-FACACTCCAGCTGGGTTAATGCTAATCGTGAThsa-miR-155-5p-RCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACCCCTAThsa-miR-221-3p-FACACTCCAGCTGGGAGCTACATTGTCTGCTGhsa-miR-221-3p-RCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGAAACCCAU6-FCTCGCTTCGGCAGCACA(SEQIDNo.10)U6-RAACGCTTCACGAATTTGCGT(SEQIDNo.11)URPTGGTGTCGTGGAGTCG(SEQIDNo.12)实施例4个体血浆miRNA表达量的稳定性分析采用实施例3的方法对8名孕妇的血浆miRNA水平的稳定性进行评价。和实施例1同样的采集方法采集研究对象连续三次血浆(间隔时间为1周，间隔期内无疾病)。结果显示，血浆中hsa-miR-195-5p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-221-3p这三个miRNA表达水平较稳定(图2)。这些都提示了个体血浆miRNA的表达量较为稳定，具备作为诊断/监测标志物的特性。实施例5miRNA组合对HSCR的判断根据上述Real-timePCR方法，本发明人通过对病例和对照组血浆样品的miRNAs表达水平的分析，以健康对照组miRNAs表达量的五分位数为阈值，对hsa-miR-195-5p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-221-3p进行评分，进一步求得总得分，以此绘制ROC曲线来评估预测的灵敏性和特异性，进而评估这三个miRNAs低表达或高表达对巨大儿的评估能力。ROC分析结果显示，hsa-miR-195-5p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-221-3p以91.2％的AUC(ROC曲线下面积)将正常对照组和巨大儿组分开(图3)。在上述一系列研究结果的基础上，本发明人证明了采用hsa-miR-195-5p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-221-3p能够很好地将巨大儿患者和健康对照分开。实施例6miRNA分层评分和独立人群盲法验证当对hsa-miR-195-5p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-221-3p这三个标志物的表达水平进行分层评分时(五分位数分层后累加)，能够对是否患有巨大儿进行评估，表述为积分越高，确认为巨大儿的风险越高。表5三个miRNAs五分位数得分并求和注：每个miRNA按表达量的五分位数分为五个等级0、1、2、3、4，最低的0分，最高的4分，3条miRNA综合可以得分为0～12分，而巨大儿组绝大多数得分很低(表达量低，积分按反向计算)，而正常对照组绝大多数得分很高。举例来说，如有一个样本评分为12分(最高的分值组)，则其不可能为巨大儿病例，而应为正常对照。针对得出的评估分值(即根据具体得分判断其分组，得高分的归入对照组，得低分的归入巨大儿组；比较而言，≥9算高分，≤3算低分)，对另一组独立采集的人群进行盲法首诊，即采用双盲试验，对独立人群(另一医院采集的40例孕妇)同时进行常规诊断分析和血浆样品的miRNA检测，结果显示通过3个miRNA检测评分，可以将巨大儿及对照孕妇很好的区分开(40例随机选择样本中有8例评分较低(≤3分)，其中达到0分(最高分)的有4例，这4例经诊断均为巨大儿，其余评分较高(≥9分)的均为非巨大儿)，提示这几种miRNA可作为评估巨大儿的标志物。实施例7用于巨大儿诊断和监测的miRNA诊断试剂盒的制作该miRNA试剂盒的制作工艺和操作流程主要基于RT-PCR、Real-timePCR技术。首先通过测序的方法和Real-timePCR方法确定正常人和巨大儿患者血浆中有一个以上拷贝的miRNA。然后通过定量PCR等技术筛选与巨大儿相关的一类血浆miRNA，作为预测是否发生巨大儿以及诊断的指标。最后筛选出对应的血浆miRNA的数量控制在几条，这是在预实验的基础上做出的最优化的精简。此试剂盒包括一批血浆miRNA引物，其中miRNA的引物包括hsa-miR-195-5p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-221-3p、U6的正反向引物(见表4)。还可以有相关PCR技术常用的试剂，如Taq酶、PCR缓冲液、MgCl2、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液、染料等试剂，这些试剂也可采用相应的市售产品。此试剂盒的价值在于只需要一次抽出少量(2ml)血液，即可检测血浆miRNA标志物的变化趋势，再通过该变化趋势预测巨大儿发生可能性或诊断巨大儿，并易于进行动态监测和观察治疗效果。具体试剂盒组成如下：引物也可以是以下三对引物中的二对或三对：SEQIDNO.4和SEQIDNO.5，SEQIDNO.6和SEQIDNO.7，SEQIDNO.8和SEQIDNO.9，各10μM0.25μl。试剂盒中还可以含有0.3μlTaq酶，1μl20×EVAGREEN，1.2μl25mMMgCl2，1.6μl2.5mMdNTP混合液，2μl10×PCR缓冲液，12.4μl纯水。试剂盒中还可以含有内参U6的正反向引物一对(表1)。或者试剂盒中除正向引物外还含有1μl10μM通用反向引物，10μlTaqMan通用PCR混合液，6.6μlH2O。试剂盒中的组分除引物外的试剂可以采用现有技术中用于miRNA含量检测的相应试剂。序列表<110>南京医科大学<120>检测和/或预测人类巨大儿的miRNA标志物或其组合及其应用<160>12<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>21<212>RNA<213>人血浆(human)<400>1uagcagcacagaaauauuggc21<210>2<211>23<212>RNA<213>人血浆(human)<400>2uuaaugcuaaucgugauaggggu23<210>3<211>23<212>RNA<213>人血浆(human)<400>3agcuacauugucugcuggguuuc23<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>4acactccagctgggtagcagcacagaaat29<210>5<211>44<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>5ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgaggccaatat44<210>6<211>31<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>6acactccagctgggttaatgctaatcgtgat31<210>7<211>44<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>7ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagacccctat44<210>8<211>31<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>8acactccagctgggatctacattgtctgctg31<210>9<211>44<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>9ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgaggaaaccca44<210>10<211>17<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>10ctcgcttcggcagcaca17<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>11aacgcttcacgaatttgcgt20<210>12<211>16<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>12tggtgtcgtggagtcg16当前第1页1 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