本发明涉及核酸合成技术领域，且特别涉及一种核酸合成固相载体、制备方法及含有该载体的核酸合成装置、核酸合成方法。
背景技术
核酸片段的人工化学合成始于50年代初期，1980年，全自动的固相核酸合成仪面市后，使得快速、高效合成核酸片段成为可能，这大大地推动了生物工程技术的蓬勃发展。现有技术中，dna通过固相亚磷酰胺三酯法合成：溶液中的采用β-乙腈亚磷酰胺化学合成核酸片段，核酸链的合成时从3'→5'方向进行，通常3'端的第一个碱基结合在控孔玻璃珠(controlledporeglass，cpg)上。cpg装配在两端有筛板的塑料合成柱中间，通过反应液通过合成柱完成一系列脱保护、缩合、封闭、氧化步骤，循环操作，最终通过氨解将目标核酸序列从cpg上解离下来纯化得到成品。
发明人研究发现，采用现有的塑料合成柱完成核酸合成时，塑料合成柱的规格是固定的，在同一设备上只能实现固定规模的核酸片段的合成，例如50nmol、100nmol、200nmol等，合成操作不方便。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种核酸合成固相载体，此固相载体为磁控孔玻璃珠，可以替换现有的cpg塑料合成柱，提高制备量的适应性，减少试剂的使用和塑料污染的产生。
本发明的另一目的在于提供一种核酸合成固相载体的制备方法，制备方法简单、易于操作，各项参数容易控制，适用于工业化大规模生产。
本发明的第三个目的在于提供含有上述核酸合成固相载体的核酸合成装置，结构简单，取代现有加液枪和塑料合成柱体系，生产方便。
本发明的第四个目的在于提供一种核酸合成方法，取代现有的核酸制备中反应、分离、洗涤的方式，合成方便、快捷、成本低、污染少。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提出一种核酸合成固相载体的制备方法，包括以下步骤：
s1，获取水基磁流体；
s2，将所述水基磁流体加入到含软磁材料粉末的硅溶胶前驱体中，静置至产生凝胶；
s3，将所述凝胶在保护气氛下600～900℃热处理1～3h获得磁控孔玻璃珠。
本发明还提出一种核酸合成固相载体，其根据上述的制备方法制得。
本发明还提出一种核酸合成装置，包括：
上述的磁控孔玻璃珠；
电磁棒：包括壳体、嵌设在所述壳体内的电磁铁，所述电磁铁连接至外部电源，通电时所述电磁棒的外壁吸附所述磁控孔玻璃珠，断电时释放所述磁控孔玻璃珠；
反应板：具有多个用于容置试剂的反应孔，吸附有磁控孔玻璃珠的所述电磁棒能进入所述反应孔中使所述磁控孔玻璃珠与所述反应孔内的试剂反应。
本发明还提出一种核酸合成方法，应用上述的核酸合成装置，且所述磁控孔玻璃珠经过活化处理以链接核苷，所述电磁棒通电吸附活化的所述磁控孔玻璃珠形成反应棒，然后进行以下步骤：
脱保护：将所述反应棒插入到质量分数为1％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，控制所述电磁棒通断电23～35次，脱去所述磁控孔玻璃珠上的dmt保护基团；
缩合：将合成目标核酸序列所需的核酸单体与催化剂四氮唑混合，得到亚磷酰胺四唑活性中间体，然后插入所述反应棒进行通断电45～60次，形成一个延长一个碱基的核苷酸链；
封闭：将所述反应棒插入到乙酸酐和乙腈的混合液中进行通断电45～60次；
氧化：将所述反应棒插入到含有碘、吡啶和水的混合液中，进行通断电45～60次；
按照上述的脱保护、缩合、封闭、氧化步骤循环，直到合成目标核酸序列。
本发明实施例的核酸合成固相载体及其制备方法、核酸合成装置以及核酸合成方法的有益效果是：
通过水基磁流体和含软磁材料粉末的硅溶胶前驱体反应，制得磁控孔玻璃珠(mcpg)。mcpg不仅具有现有的cpg的功能，可以链接核酸单体，实现核酸片段的合成，而且具有软磁性，电磁铁在通断电过程中能够对mcpg进行吸附和释放。既可以将mcpg释放到试剂中，进行反应，又可以将mcpg吸附在电磁铁上，实现mcpg在不同反应孔中的转移。
通过在壳体内嵌电磁铁，形成电磁棒，配合具有多个反应孔的反应板，取代现有的加液枪和塑料合成柱体系。电磁棒通电吸附活化后的mcpg，作为核酸合成过程的反应棒。核酸合成过程中，将反应棒插入到不同的反应孔内，控制电磁棒通断电，实现mcpg的分散和聚集，完成脱保护、缩合、封闭、氧化等步骤。且在上述过程中，通过移动反应棒，实现mcpg在不同试剂中进行反应，完成核酸片段的合成。相比于现有核酸制备过程，在试剂进入到塑料合成柱中进行反应，需要进行反应、分离、洗涤、抽干等步骤，本发明的合成方法更为方便、快捷，且能够大大减少试剂的用量，避免塑料污染等。此外，通过控制mcpg的用量可以在同一套设备中实现从1-5000nmol的核酸合成规模。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例的核酸合成装置的结构示意图；
图2为本发明试验例1的hplc色谱图；
图3为本发明试验例1的质谱图；
图4为本发明试验例2的pcr扩增曲线；其中，曲线1为本发明实施例2提供的引物扩增曲线，曲线2为传统dna合成柱提供的引物扩增曲线。
图标：100-核酸合成装置；10-磁控孔玻璃珠；20-电磁棒；21-壳体；22-电磁铁；30-反应板；31-反应孔。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的核酸合成固相载体及其制备方法、核酸合成装置以及核酸合成方法进行具体说明。
本发明实施例提供一种核酸合成固相载体的制备方法，包括以下步骤：
s1，获取水基磁流体。优选地，获取水基磁流体的步骤包括：
s11，将摩尔比为1～3:1的六水合三氯化铁和四水合二氯化铁溶于水中，得到fe3+浓度为0.2-0.5mol/l的铁盐溶液。进一步地，六水合三氯化铁和四水合二氯化铁的摩尔比为2:1，铁盐溶液的浓度为0.3mol/l。
s12，在惰性气氛下，加入沉淀剂，70～90℃水浴搅拌20～40min，分离得到沉淀产物。进一步地，惰性气体选用氮气或氦气。沉淀剂选用氨水。
进一步地，在本发明较佳实施例中，该步骤中，维持ph为10～11。
s13，将所述沉淀产物分散于水中，加入稳定剂，70～90℃水浴搅拌20～40min得到水基磁流体。进一步地，稳定剂为酒石酸。进一步优选地，酒石酸的体积分数为2％。
在上述条件下，获得的水基磁流体的临界尺寸小，粒子的顺磁性临界尺寸＜5nm，磁性强。
s2，将水基磁流体加入到含软磁材料粉末的硅溶胶前驱体中，静置至产生凝胶。
进一步地，在本发明较佳实施例中，该步骤中，含软磁材料粉末的硅溶胶前驱体的制备方法为：将软磁材料粉末分散在反应液中，搅拌0.6～1.5h，形成溶胶凝胶前驱体混合物。其中，所反应液为体积比为1:0.8～1.2：0.8～1.2:0.008～0.0012的正硅酸乙酯、乙醇、水以及高氯酸，进一步地，正硅酸乙酯、乙醇、水以及高氯酸的体积比为1:1:1:0.1。
进一步地，在本发明较佳实施例中，该步骤中，软磁材料选自铁氧体、碳钢、硅钢、铁镍合金中的一种或多种。优选地，本实施例中，选用铁氧体作为软磁材料。进一步地，选用纳米级fe3o4作为软磁材料，能够在磁场下迅速被磁化，撤去磁场后无剩磁。
进一步地，软磁材料粉末与正硅酸乙酯的用量比为10mg:1ml。
进一步地，水基磁流体为与正硅酸乙酯的体积比为1:1.5～4，进一步地，体积比为1:2。加入水基磁流体混合后，静置1～2d至凝胶产生。
s3，将所述凝胶在保护气氛下600～900℃热处理1～3h获得磁控孔玻璃珠。进一步地，凝胶在氮气保护下，以25～40℃/min的升温速率升温至800℃煅烧1.5h，然后以3～8℃/min的速率降温到620℃退火20～50min得到磁控孔玻璃珠(mcpg)。通过该步骤，能够有效增大mcpg的比表面积。
进一步地，在本发明较佳实施例中，还包括对磁控孔玻璃珠进行活化的步骤：
s4，将核酸单体、苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐、溶剂混合后，加入活化剂，振荡溶解后，投入磁控孔玻璃珠，振荡反应20～50min，蒸发去除溶剂后，加入连接液，振荡反应20～50min，分离出所述磁控孔玻璃珠，干燥，即得到活化的mcpg。进一步地，分离出磁控孔玻璃珠后，水洗3次，无水乙醇清洗1次，然后在80℃烘干1h。
进一步地，在本发明较佳实施例中，活化剂为四氮唑，溶剂为乙腈，连接液为体积比为2:1：1：1的乙腈、吡啶、氮甲基咪唑、乙酸酐的混合溶液。
通过对mcpg活化，能够使得核酸单体和mcpg连接。
本发明实施例还提供一种核酸合成固相载体，根据上述的制备方法制得。
如图1所示，本发明实施例还一种核酸合成装置100，包括：
上述的磁控孔玻璃珠10；
电磁棒20：包括壳体21、嵌设在所述壳体内的电磁铁22。电磁铁22连接至外部电源。通电时电磁棒22的外壁吸附磁控孔玻璃珠10，断电时释放磁控孔玻璃珠10；以及
反应板30：具有多个用于容置试剂的反应孔31，吸附有磁控孔玻璃珠的电磁铁棒能进入反应孔中述磁控孔玻璃珠与反应孔31内的试剂反应。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，电磁棒20的外壳的材质为聚四氟乙烯，电磁铁选用吸盘式电磁铁。将吸盘式电磁铁内嵌在聚四氟乙烯外壳中，形成电磁棒，制备简单、成本低。其相当于对电磁铁形成一层保护膜，避免电磁铁直接与反应试剂接触，引入污染源，且保护电磁铁不受腐蚀。
核酸合成装置100在使用时，在不同的反应孔31内注入不同的试剂，插入吸附有mcpg的电磁棒进行反应。例如在反应孔a中进行脱保护步骤、在反应孔b中进行缩合步骤、在反应孔c中进行封闭步骤、在反应孔d中进行氧化步骤等。
需要说明的是，核酸合成装置100还可以加设移动机构，用于移动电磁棒，使电磁棒在不同的反应孔内移动。例如移动机构可以是电机和受电机驱动的机械臂，机械臂与电磁棒固定，机械臂移动带动电磁棒移动，实现自动化操作。该移动机构可以参照现有的dna合成仪中的加液枪设计，为现有技术，在此不再进行赘述。
本发明实施例还提供一种核酸合成方法，应用上述的核酸合成装置，且磁控孔玻璃珠经过活化处理(参见上述的步骤s4)。电磁棒通电吸附活化的磁控孔玻璃珠形成反应棒，然后进行以下步骤：
步骤一、脱保护：将反应棒插入到质量分数为1％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，控制电磁棒通断电23～35次，脱去磁控孔玻璃珠上的dmt保护基团；
步骤二、缩合：将合成目标核酸序列所需的核酸单体与催化剂四氮唑混合，得到亚磷酰胺四唑活性中间体，然后插入反应棒进行通断电45～60次，形成一个延长一个碱基的核苷酸链；
步骤三、封闭：将反应棒插入到乙酸酐和乙腈的混合液中进行通断电45～60次；
步骤四、氧化：将反应棒插入到含有碘、吡啶和水的混合液中，进行通断电45～60次；
按照上述的脱保护、缩合、封闭、氧化步骤循环，直到合成目标核酸序列。
进一步地，在本发明较佳实施例中，合成目标核酸序列后，还进行以下步骤：
切割：将反应棒插入到质量分数为20％的二乙胺乙腈溶液中进行通断电15～25次，再插入另一质量分数为20％的二乙胺乙腈溶液中进行通断电15～25次，然后将反应棒插入到氨解液中，然后释放磁控孔玻璃珠，经水浴加热使目标核苷酸序列从磁控孔玻璃珠上氨解下来。进一步地，氨解液为体积比为1:1的甲胺和dmso的混合液。
后处理：对目标核苷酸序列进行纯化、浓缩。例如，通过page纯化、c18柱浓缩得到成品。
可以理解的是，在本发明实施例中，控制反应棒通断电的次数，理解为：控制反应棒通电后断电1次为通断电1次，或者是控制反应棒断电后通电1次为通断电1次。通电时，磁控孔玻璃珠聚集在电磁棒上，断电时，磁控孔玻璃珠分散在试剂中，根据实际的需求进行通电和断电操作。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的一种mcpg，根据以下步骤制得：
(1)将六水合三氯化铁和四水合三氯化铁按摩尔比2：1溶于水后加到三口瓶中，使溶液中铁离子浓度在0.3mol/l。在氮气保护下，加过量氨水，形成黑色沉淀，同时剧烈搅拌，80℃恒温水浴加热，维持ph＝10-11，30min后停止搅拌。抽滤，去离子水洗涤至流下滤液为中性，得到沉淀产物。
(2)将得到的沉淀产物分散于50ml水中，加入1ml酒石酸，于70℃恒温水浴加热搅拌，30min后制得水基磁流体。
(3)将100mgfe3o4细末粒子分散在10ml正硅酸乙酯/10ml乙醇/10ml水/0.1ml高氯酸的体系中，搅拌1h，得到溶胶凝胶前驱体。
(4)在上述的溶胶凝胶前驱体加入5ml水基磁流体，然后在室温下静置1-2天，直到凝胶再产生。
(5)将凝胶加到石英管反应器，氮气保护下于800℃热处理1.5h制备得磁控孔玻璃珠mcpg。
(6)将2mg核酸单体、20mg苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐、400μl乙腈加入反应容器中，加入10mg四氮唑，振荡溶解，投入2mgmcpg，振荡反应30min，旋蒸脱溶。
(7)在步骤(6)中得到的产物中加入配比为乙腈：吡啶：氮甲基咪唑：乙酸酐＝2:1：1：1的溶液振荡反应1小时，抽干，将mcpg取出，水洗3次，无水乙醇清洗1次，放入托盘，80℃烘干1小时。
实施例2
本实施例提供的一种核酸合成方法，包括以下步骤：
(1)称取0.5mgmcpg(实施例1提供)，将吸附mcpg的电磁棒(以下简称反应棒)插入1％三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，通断电30次，使mcpg在反应液中反复分散，聚集，反应脱去5'羟基保护基团dmt。
(2)将所需核苷酸单体、四氮唑混合得到活化核苷亚磷酸中间体，插入反应棒通断电50次。
(3)将反应棒插入乙酸酐、乙腈的混合液中通断电50次；
(4)将反应棒插入碘、吡啶、水的混合液中通断电50次
(5)重复步骤(1)-(4)，直到得到所需核酸序列。
(6)将反应棒插入到20％二乙胺乙腈溶液通放电20次，再插入到另一20％二乙胺乙腈溶液种重复通放电20次。
(7)控制反应棒断电，释放出mcpg。将mcpg倒入500ml硼硅酸玻璃试剂瓶内，加入300ml体积比为1:1的甲胺/dmso溶液，拧紧瓶盖，摇匀使mcpg与溶液充分接触，60℃水浴20min，此时寡核苷酸已从mcpg上氨解下来，溶解于溶液中。
(8)室温放置一段时间使氨解液温度降至40℃左右，缓缓打开瓶盖，防止溶液喷出。
(9)用电磁棒吸附mcpg插入50％乙醇溶液中通断电20次，洗涤氨解液，将液体倒入蒸馏瓶内，加入500ml无水乙醇为消泡剂，80r/min、60℃旋转蒸发2h，水分、甲胺和无水乙醇被旋蒸去除，此时寡核苷酸溶解于dmso内。通过page纯化，c18柱浓缩，脱盐，沉淀，得到成品。
试验例1
采用实施例2提供的方法合成dna引物序列(5’to3’)atcgctggatgtgtctgcggc。对该序列进行检测：
(1)hplc检测
hplc色谱图如图2所示，色谱峰结果如表1所示：
表1
从图1和表1可以看出，合成的dna引物纯度为92.78％。
(2)esi源质谱检测
检测结果如图3所示，如图3所示，合成的目标分子量为7562.2，与实际测量得到的分子量7562.5相符。
试验例2
分别采用现有的dna合成柱和本发明实施例2提供的方法合成dna引物序列：(5’to3’)atcgctggatgtgtctgcggc。
用pcr溶解曲线法验证mcpg合成引物与传统的dna合成柱合成引物的合成情况，验证条件如下：
反应程序为：95℃预变性5min；93℃15s，62℃30s循环4次。95℃2min62℃30s95℃溶解曲线，35℃冷却40s。
验证结果如图4所示，结果表明，采用本发明实施例2提高的方法合成的引物(图4中曲线1)与传统的dna合成柱合成的引物(图4中曲线2)扩增效果一致。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。