本发明属于基因工程和细胞工程
技术领域：
，具体涉及母猪卵巢卵泡发育过程中，转录因子CEBPα作为Kiss1启动子区的转录因子的应用。
背景技术：
：卵巢卵泡的生长发育状态直接决定了母猪繁殖性能的高低，颗粒细胞功能影响着卵泡的生长与闭锁，研究发现，Kiss1在卵巢组织中可以促进卵泡的发育，影响颗粒细胞的功能。卵巢是雌性动物的生殖器官，可以为雌性动物提供性激素，为卵子的成熟提供场所，研究表明，下丘脑-垂体-性腺轴分泌的FSH和LH可以作用于卵巢，促进卵巢卵泡和卵母细胞的发育，FSH能够促进卵巢的生长，增加卵巢的质量，LH能够促进卵泡和卵母细胞的发育，促进排卵；两者还能促进卵巢分泌孕酮和雌二醇，从而促使卵巢周期性排卵，通过负反馈调节抑制GnRH、FSH和LH的释放，使GnRH、FSH和LH随着卵巢内雌激素的水平变化而呈现周期性的变化，从而维持和调节生殖发育。而在卵巢卵泡的发育过程中，扁平状的卵巢颗粒细胞会变成逐渐立方形，标志着原始卵泡开始发育为初级卵泡，随着卵巢颗粒细胞的层数的增多，颗粒细胞开始分化，这些变化在原始卵泡的休眠与激活，卵子的成熟，卵泡的闭锁，卵母细胞的生长等过程中都起着重要的作用。研究发现，Kiss1的等位基因突变，大鼠的卵泡数量明显减少，卵巢卵泡发育减慢，在卵巢卵泡发育的晚期，随着雌激素的增加，在猪和羊的下丘脑检测到Kiss1的mRNA也随之增加，但是早于GnRH的增加，有关小鼠的研究表明，kisspeptin可能直接作用于卵巢，参与卵巢早衰的形成，研究发现，Kiss1的突变或缺失可以导致人类或者小鼠出现低促性腺激素性性腺功能衰退，具体表现为雌性小鼠卵巢体积很小，卵泡发育不正常，雄性小鼠睾丸小，精子发育不良。CEBPs(CCAATenhancer-bindingproteins，CEBPs)是一类转录因子家族CCAAT增强子结合蛋白，可以特异性结合到DNA的增强子区域，广泛参与到细胞的增殖、胚胎发育、机体能量代谢、细胞凋亡和免疫反应等，其由CEBPα、CEBPβ、CEBPγ、CEBPδ、CEBPε和CEBPζ六个成员组成。当CEBPs作为负调节因子发挥作用的时候，必须存在以下三个功能区，一、稳定区(SR)，位于N末端，使蛋白结构更加稳定；二、激活区(AD)，有AD1和AD2两个区域，彼此相互独立，相互促进；三、位于C末端的DNA结一、稳定区(SR)，位于N末端，使蛋白结构更加稳定；二、激活区(AD)，有AD1和AD2两个区域，彼此相互独立，相互促进；三、位于C末端的DNA结合区，含有bZIL蛋白结构，这个结构域可以与亮氨酸拉链区紧密相连，可以特异性的结合DNA序列，含有N-末端含有酸性激活区，可以直接与DNA结合，也可以识别顺式作用元件。CEBPα对主要通过两种方式调控基因的表达：激活抑制基因的转录，在细胞的信号传导、细胞分化、细胞增殖、应激反应、能量代谢及肿瘤生成等方面发挥着很重要的作用。研究表明，敲除小鼠的CEBPα基因，小鼠的肺和肝的细胞都不能正常增殖，CEBPα突变小鼠显示骨髓前导子增加，小鼠肾脏或骨髓B细胞CEBPα或者CEBPβ的表达导致一些B细胞重编程为骨髓家系。技术实现要素：为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种转录因子CEBPα作为Kiss1启动子区的转录因子的应用。本发明的另一目的在于提供所述的转录因子CEBPα在抑制Kiss1基因表达中的应用。本发明的另一目的在于提供所述的转录因子CEBPα在抑制卵巢颗粒细胞中E2生成的应用。本发明的另一目的在于提供抑制转录因子CEBPα的RNA小干扰片段(siRNA)。本发明的再一目的在于提供转录因子CEBPα通过调控Kiss1影响E2的生成的应用。通过基因工程技术构建该转录因子CEBPα的超表达载体和干扰RNA，分析该转录因子CEBPα的超表达和干扰效果，研究该转录因子CEBPα在卵巢颗粒细胞中对E2的生成的影响，进而研究该转录因子CEBPα通过调控Kiss1影响E2的生成的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现：本发明提供转录因子CEBPα作为Kiss1启动子区的转录因子的应用。本发明提供所述的转录因子CEBPα在抑制Kiss1表达中的应用。过表达转录因子CEBPα可抑制Kiss1的表达，干扰转录因子CEBPα的表达后促进Kiss1的表达。本发明提供所述的转录因子CEBPα在抑制卵巢颗粒细胞中E2生成的应用。过表达转录因子CEBPα后会抑制E2的生成，干扰转录因子CEBPα的表达后能促进E2的生成。本发明提供所述的转录因子CEBPα通过调控Kiss1影响E2的生成的应用。过表达转录因子CEBPα后会抑制Kiss1对E2生成的促进作用，干扰转录因子CEBPα的表达后能促进Kiss1对E2生成的促进作用。本发明提供抑制转录因子CEBPα的siRNA，序列如下：CEBPα-siRNA-1：5′-ACGAGACGUCCAUCGACAU-3′；CEBPα-siRNA-2：5′-UCGACAUCAGCGCCUACAU-3′；CEBPα-siRNA-3：5′-CCUUCAACGACGAGUUCCU-3′；本发明的验证结果如下：1、生物信息学软件预测猪Kiss1启动子区存在转录因子CEBPα(GeneID:397307)的结合位点，阅读文献查阅转录因子CEBPα在卵巢卵泡发育过程中的作用，初步确定转录因子CEBPα为猪Kiss1启动子区的转录因子。2、ChIP分别验证Kiss1启动子区与潜在的转录因子CEBPα的结合情况，结果显示，转录因子CEBPα能够结合在Kiss1的启动子-744～-733区域。3、构建含有转录因子CEBPα的CDs区的真核表达载体pcDNA3.1-CEBPα，超表达转录因子CEBPα找出最适转染的浓度，为200ng。4、通过双荧光素酶报告分析，得出超表达转录因子CEBPα后，Kiss1的启动子活性降低，采用qRT-PCR和Westernblotting在转录水平和翻译水平验证得出：超表达转录因子CEBPα后，Kiss1的mRNA和蛋白水平表达显著降低。5、合成3对转录因子CEBPα干扰小片段/对照(CEBPα-siRNA/Scrambled-siRNA)，筛选并检测其干扰效率。转染基因干扰小片段到卵巢颗粒细胞中，通过qRT-PCR手段，最终筛选干扰效果较好的CEBPα-siRNA小片段进行后续实验。6、转录因子CEBPα干扰小片段(CEBPα-siRNA)转染颗粒细胞，采用qRT-PCR和Westernblotting在转录水平和翻译水平验证得出：干扰转录因子CEBPα的表达后，Kiss1的mRNA和蛋白水平表达显著升高。7、在猪的卵巢颗粒细胞中超表达或者干扰转录因子CEBPα，用ELISA检测卵巢颗粒细胞上清中E2的含量。8、在猪的卵巢颗粒细胞中超表达或者干扰转录因子CEBPα和Kiss1，用ELISA检测卵巢颗粒细胞上清中E2的含量。本发明以转录因子CEBPα为研究对象，采用了分子与细胞生物学方法研究其在猪卵巢颗粒细胞中对Kiss1的表达调控及功能影响。关键点在于：(1)ChIP验证转录因子CEBPα可以结合Kiss1启动子区；(2)qRT-PCR和Westernblot在转录水平和翻译水平验证转录因子CEBPα在猪卵巢颗粒细胞中对Kiss1的表达调控；(3)超表达或者干扰转录因子CEBPα，对母猪卵巢颗粒细胞中E2水平的变化；(4)超表达或者干扰转录因子CEBPα和Kiss1，对母猪卵巢颗粒细胞中E2水平的变化。研究表明，CEBPα在大鼠卵巢卵泡的发育和排卵过程中有至关重要的作用，可能通过EGFR-RAS-ERK通路调控小鼠的排卵及黄体的形成本。本发明首次证实转录因子CEBPα对Kiss1基因的表达调控和在卵巢颗粒细胞中的功能。本发明的机理是：生物信息学网站预测Kiss1基因启动子区潜在的转录因子结合位点，ChIP验证Kiss1基因启动子区与潜在的转录因子结合情况，构建含有转录因子CDs区序列的重组载体和siRNA，瞬时转染进猪的卵巢颗粒细胞，双荧光素酶报告系统、qRT-PCR、WesternBlot技术分析转录因子对Kiss1基因启动子区的活性、mRNA水平和蛋白水平的影响。并通过ELISA试剂盒检测超表达或者干扰转录因子母猪卵巢颗粒细胞上清中E2的浓度变化。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明首次通过在猪卵巢颗粒细胞中转录因子CEBPα对Kiss1基因的表达调控和在卵巢颗粒细胞中的功能进行研究。本研究实验内容丰富，结果齐全、准确。附图说明图1是ChIP验证Kiss1启动子区与潜在的转录因子CEBPα结合情况图；其中，图1A是生物信息学软件预测猪Kiss1启动子区潜在的转录因子结合位点；图1B是ChIP验证Kiss1启动子区与潜在转录因子CEBPα的结合情况。图2是超表达转录因子找出转录因子CEBPα最适转染浓度的结果图。图3是验证超表达转录因子CEBPα对Kiss1的表达调控图；其中，图3A、图3B、图3C和图3D分别表示双荧光报告基因验证、qRT-PCR和Westernblot验证。图4是qRT-PCR检测转录因子CEBPα的3对干扰小片段的干扰效率图。图5是验证干扰转录因子CEBPα对Kiss1的表达调控图；其中，图5A、图5B和图5C分别表示qRT-PCR和Westernblotting验证结果；图中CEBPα-siRNA表示CEBPα-siRNA-2。图6是检测超表达或者干扰转录因子CEBPα后卵巢颗粒细胞上清中E2(雌二酮)的水平变化图；其中，图中CEBPα-siRNA表示CEBPα-siRNA-2。图7是检测超表达或者干扰转录因子CEBPα和Kiss1后卵巢颗粒细胞上清中E2(雌二酮)的水平变化图；其中，图中pcDNA3.1-Kiss1表示构建的含有Kiss1基因CDs区的真核表达载体pcDNA3.1-Kiss1；Kiss1-siRNA表示Kiss1-siRNA-3，序列为5′-GCCACUUCCUUCAAGGAGA-3′；CEBPα-siRNA表示CEBPα-siRNA-2；Scrambled-siRNA(K)表示针对Kiss1的Scrambled-siRNA；Scrambled-siRNA(C)表示针对CEBPα的Scrambled-siRNA。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。实施例1卵巢颗粒细胞的培养(1)在屠宰场采集卵巢，用PBS或者生理盐水(含1％双抗)置于37℃保温瓶迅速运回实验室；(2)将收集的卵巢在无菌培养室用预热过的PBS(含1％双抗)清洗3遍后，迅速转入超净工作台；用1mL无菌一次性注射器浅插入卵巢有腔卵泡中吸取卵泡液；(3)吸取的卵泡液置于含有适量DMEM的15mL离心管中，1000rpm室温离心6min；(4)弃去上清，再用DMEM重悬、离心，重复清洗细胞2次；配制DMEM完全培养基：89％DMEM+10％FBS+1％双抗；(5)吸取细胞重悬液和完全培养基接种于75mL培养瓶；置于37℃，5％CO2培养箱中静置培养。所述的双抗为青霉素和链霉素。实施例2卵巢颗粒细胞的接种和转染(1)颗粒细胞长至90％左右，倒掉培养基，用预热的含1％双抗(所述的双抗为青霉素和链霉素)的PBS洗3遍；(2)加入胰蛋白酶消化，放入培养箱3min左右，显微镜下观察至大部分细胞漂起，立即加入等量终止液终止消化；(3)DMEM清洗2遍，期间1000rpm离心5min；(4)用完全培养基轻轻重悬细胞沉淀，均匀分到每个孔中，用完全培养基补充体积，轻轻摇匀，放培养箱中培养；(5)24h左右，观察颗粒细胞状态，待细胞汇合度达80％左右时准备转染；(6)转染方法按Invitrogen公司的3000试剂盒说明书进行；每组设置3个重复；(7)转染后的孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养；(8)转染后1～3天，观察细胞状态，生长良好即可收集细胞。实施例3qRT-PCR本发明中基因的qRT-PCR检测分别采用美国Thermo公司的SYBRSYBRGreenqPCRMix试剂盒。实验采用比较Ct值法检测样品基因的含量，具体计算公式如下：基因相对表达量＝2-{〈﹙实验组目的基因Ct值﹚-﹙实验组内参基因Ct值﹚〉-〈﹙对照组目的基因Ct值﹚-﹙对照组内参基因Ct值﹚〉}其中对基因检测用GAPDH做内参，本发明所用到的qRT-PCR引物为：qRT-PCR-Kiss1Forward：5′-AACCAGCATCTTCTCACCAGG-3′；Reverse：5′-CTTTCTCTCCGCACAACGC-3′；qRT-PCR-GAPDHForward：5′-TCCCGCCAACATCAAAT-3′；Reverse：5′-CACGCCCATCACAAACAT-3′；qRT-PCR-CEBPαForward：5′-CTGAGGTCTGCCAGAAGC-3′；Reverse：5′-AACAGAAGAAGGAAGGGAGT-3′；细胞的总RNA提取参照Takara公司TRIzol操作说明书，具体提取步骤如下：(1)颗粒细胞直接加入TRIzol；(2)室温下放置10min以充分裂解细胞，12000g离心5min，弃沉淀吸上清于新RNase-free管中；(3)加入0.2mL氯仿(每1mLTRIzol)剧烈震荡15～30s，室温下放置5min后4℃12000g离心15min；(4)吸取上层水相置于新RNase-freeEP管中；(5)加入0.5mL异丙醇(每1mLTRIzol)，轻轻地上下颠倒混匀后在室温放置10min，4℃12000g离心10min；(6)弃上清后置于室温，沿管壁加入1mL75％乙醇-DEPC(每1mLTRIzol)以洗涤RNA，4℃12000g离心5min后尽量弃上清；(7)真空干燥5～10min，注意避免RNA沉淀干燥过度；(8)加入DEPC水以溶解RNA沉淀。mRNA的反转录PCR采用Thermo公司的ThermoScientificRevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit。实施例4ELISA方法测定猪卵巢颗粒细胞上清样本中E2含量ELISA方法测定猪卵巢颗粒细胞上清样本中E2含量检测，参照CUSABIO公司的PigE2ELISA试剂盒，具体操作步骤如下：(1)24孔板转染48h后，吸取细胞培养液至无菌的1.5mL离心管，-20℃保存待用。(2)准备样品和试剂；(3)设置空白对照；(4)每孔加入50μL样品；(5)样品组每孔加入50μL的HRP-conjugate，对照组不加，随后每孔加入50μL抗体，混合均匀；(6)37℃孵育1h；(7)用200μL的WashBuffer洗涤三次；(8)每孔加入50μL的SubstrateA和50μL的SubstrateB，混合均匀，37℃孵育15min；(9)每孔加入50μL的StopSolution，轻轻吹打，混合均匀，10min之内测完全部样品的OD值。实施例5荧光素酶报告基因活性检测荧光素酶报告基因活性检测，参照Promega公司的Dual-LuciferaseReporterAssaySystem试剂盒，具体操作步骤如下：(1)转染48h后，吸去旧的培养基，用PBS清洗两次，每孔细胞加入100μL的GloLysisBuffer，室温轻微振摇5min，收集细胞裂解液；(2)将30μL细胞裂解液加入96孔发光板后，在其中加入75μLLuciferaseAssayReagent，混匀后在20～25℃静置15～30min。在BioTek公司Synergy2多功能酶标仪上检测发光值，对应于萤火虫荧光素酶的表达水平；(3)再加入75μLReagent试剂，混匀后在20～25℃静置15～30min。检测发光值，对应于海肾荧光素酶的表达水平；(4)萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶表达量的比值为萤火虫荧光素酶相对活性，即为对应靶基因活性(三个重复)。实施例6ChIP在每个转录因子结合位点附近设计引物，引物序列如下，随后经细胞交联，超声裂解，染色体免疫沉淀，反向交联和DNA纯化等进行ChIP验证。猪CEBPα基因ChIP引物序列如下表：交联(1)加275μL37％甲醛到10mL培养基中(甲醛终浓度1％)，室温摇床处理10min；(2)加500μL10×甘氨酸中和未反应的甲醛，室温摇床处理10min；(3)彻底吸除培养基；(4)加1mL预冷1×PBS，轻摇洗涤细胞后弃PBS；(5)细胞刮刮取细胞，富集至离心管，4℃下，1000g离心5min，弃上清；(6)加1mL预冷1×PBS，轻摇洗涤细胞后，4℃下，1000g离心5min，弃上清；(7)吸尽PBS，部分超声裂解及-80℃保存。超声裂解(1)加200μL细胞裂解液和1μL蛋白酶抑制剂，4℃下摇床处理30min；(2)加800μLChIP稀释液使终体积达到1mL；(3)自动超声波破碎仪，振幅50W，0.5son+0.5soff处理20min；(4)破碎后，4℃下10000g离心15min，将上清移至新的离心管中；(5)取50μL上清作为input，加50μL稀释液和5μL蛋白酶K，65℃孵育4h。其余-80℃保存；(6)纯化input，最终加50μLEB溶解DNA；(7)取5μLDNA用2％琼脂糖凝胶跑胶验证。染色体免疫沉淀(1)取60μL磁珠加1mL预冷的PBS洗涤；(2)将管子置于磁力架上静置2min，移除上清；(3)加1×BSA封闭磁珠，4℃5min；(4)将管子置于磁力架上静置2min，移除上清；(5)加1mLTE缓冲液洗涤磁珠，轻柔混匀后移除上清；(6)加100μLTE缓冲液和3～5μg抗体，4℃孵育2h；(7)加1mL细胞破碎液到装有磁珠的管子内，4度孵育过夜；反向交联和DNA纯化(1)加1mL预冷的洗液I，4℃摇床处理5min；(2)将管子置于磁力架上静置2min，移除上清；(3)加1mL预冷的洗液II，4℃摇床处理5min；(4)将管子置于磁力架上静置2min，移除上清；(5)加1mL预冷的洗液III，4℃摇床处理5min；(6)将管子置于磁力架上静置2min，移除上清；(7)加1mL预冷的TE缓冲液，4℃摇床处理5min；(8)将管子置于磁力架上静置2min，移除上清；(9)加200μLEB和10μL蛋白酶K，65℃孵育4h；(10)将管子置于磁力架上静置2min，移除上清；(11)纯化交联后的DNA，溶解于60～100μL的EB中，进行后需检测或-80℃保存。定性PCR(1)反应体系(20μL)：组分加入量(μL)ddH2O72×PCRPremix10ForwardPrime(10pmol/μL)0.5ReversePrimer(10pmol/μL)0.5DNA2总体积20注：反应液配制在冰上进行(2)扩增程序反应条件为：95℃3分钟，然后95℃10秒，60℃30秒，72℃，1分钟，共40循环，72℃5分钟。(3)定性PCR琼脂糖凝胶电泳天平称取1.6g琼脂糖至锥形瓶中，倒入80mLTBE(1×)缓冲液，在微波炉加热溶解1min，轻轻晃动后置室温冷却；冷却至约60℃，加入核酸染料(EB替代物)10μL，轻轻晃动混匀；倒入插有梳子的配胶板中，不能有气泡；室温放置约30min至凝胶完全凝固，从配胶板中取出凝胶至电泳槽中，备用。(4)电泳在电泳槽中加入电泳缓冲液(1×TBE)至淹没过凝胶；样本准备：取扩增的PCR产物5μL加入6×Lodingbuffer1μL，混匀；点样：用枪头吸取样品轻轻注入电泳孔中，留一孔点样为(100bp)Maker5μL；电泳条件：120V40分钟。实施例7WesternBlotting(1)单层贴壁细胞总蛋白的提取：倒掉细胞培养液，加入适量预冷的PBS洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。6孔板细胞每孔加入100～200μL蛋白裂解液和10μL100mM的PMSF，裂解细胞30min。收集细胞裂解液移至1.5mL离心管中，4℃14000rpm离心5min。取部分上清加入上样buffer，煮沸10min。缓慢恢复室温后，稍离心，放于-20℃保存；(2)SDS-PAGE电泳：BCA法蛋白样品初步定量后，每组取20μg总蛋白和5×上样缓冲液按5:1混合，煮沸5min。SDS-PAGE电泳至溴酚蓝刚出胶底部止；(3)蛋白质转移：PVDF膜甲醇预处理3～5s，放至转印液浸润30min。取出凝胶，将其放至滤纸上，形成凝胶转印堆积层“三明治”结构。此操作必须将气泡完全去除。100V恒压60～120min；(4)免疫印记：取出杂交膜，TBST漂洗5min，重复三次。5％脱脂奶粉溶液室温封闭90min，TBST漂洗5min，重复三次。加入PIK3R2和TSC1一抗(PIK3R2一抗：PIK3R2/p85Beta，购自LSBio公司；TSC1一抗：Hamartin，购自biorbyt公司)(1:2000)4℃孵育过夜，TBST洗膜5min，三次。加入二抗稀释液(二抗：辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，购自碧云天公司)(1:10000)室温孵育1h，TBST洗膜5min，三次。蒸馏水漂洗膜2min，三次。擦干PVDF膜上的液体，加入化学发光剂放于一胶片上，放入X射线暗盒置于暗房。在暗房内打开暗盒，放入胶片，5min后打开暗盒，拿出胶片。采用ImagePlus软件分析胶片中的蛋白条带。结果分析：1、生物信息学软件预测猪Kiss1启动子区潜在的转录因子结合位点，预测结果如图1A；验证Kiss1启动子区与潜在转录因子CEBPα的结合情况，仅有-744～-733区域的引物扩增到了预期大小的DNA片段，结果如图1B所示，证明转录因子CEBPα可以结合在Kiss1启动子-744～-733区域。2、构建含有转录因子CEBPαCDs区序列的真核表达载体，qRT-PCR检测转录因子CEBPα的超表达效果，结果如图2所示，证明转录因子CEBPα的超表达效果显著。3、通过双荧光素酶报告分析，结果如图3A所示，发现超表达转录因子CEBPα后，Kiss1启动子活性降低。使用qRT-PCR和Westernblot在转录水平和翻译水平验证转录因子CEBPα调控Kiss1基因(GeneID：100145896)的表达，发现超表达转录因子CEBPα后，Kiss1的mRNA和蛋白水平表达显著降低，结果如图3B、图3C和图3D所示。4、合成3对转录因子CEBPα干扰小片段(CEBPα-siRNA)，筛选并检测其干扰效率。结果如图4所示。转染基因干扰小片段到颗粒细胞中，通过qRT-PCR手段，最终筛选干扰效果较好的CEBPα-siRNA小片段进行后续实验。CEBPα-siRNA-1：5′-ACGAGACGUCCAUCGACAU-3′；CEBPα-siRNA-2：5′-UCGACAUCAGCGCCUACAU-3′；CEBPα-siRNA-3：5′-CCUUCAACGACGAGUUCCU-3′；上述干扰小片段由广州市锐博生物科技有限公司合成；对照Scrambled-siRNA来自广州市锐博生物科技有限公司。5、转录因子CEBPα干扰小片段(CEBPα-siRNA-2)转染颗粒细胞，研究转录因子CEBPα干扰小片段(CEBPα-siRNA-2)对猪Kiss1表达调控的影响。通过qRT-PCR和Westernblotting在转录水平和翻译水平验证转录因子CEBPα干扰小片段调控Kiss1基因的表达，结果如图5A、图5B和图5C所示。6、使用ELISA试剂盒检测超表达和干扰转录因子CEBPα(CEBPα-siRNA-2)后，卵巢颗粒细胞培养液里E2的浓度变化，超表达转录因子CEBPα后，抑制E2的生成，结果如图6A所示；干扰转录因子CEBPα后，促进E2的生成，结果如图6B所示。7、使用ELISA试剂盒检测超表达和干扰转录因子CEBPα后，超表达CEBPα后，可以抑制Kiss1对颗粒细胞分泌E2的促进作用，结果如图7A所示；干扰CEBPα的表达后，可以促进Kiss1对颗粒细胞分泌E2的促进作用，果如图7B所示。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>华南农业大学<120>转录因子CEBPα作为Kiss1启动子区的转录因子的应用<160>14<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>19<212>RNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>CEBPα-siRNA-1<400>1acgagacguccaucgacau19<210>2<211>19<212>RNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>CEBPα-siRNA-2<400>2ucgacaucagcgccuacau19<210>3<211>19<212>RNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>CEBPα-siRNA-3<400>3ccuucaacgacgaguuccu19<210>4<211>19<212>RNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>Kiss1-siRNA-3<400>4gccacuuccuucaaggaga19<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>qRT-PCR-Kiss1Forward<400>5aaccagcatcttctcaccagg21<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>qRT-PCR-Kiss1Reverse<400>6ctttctctccgcacaacgc19<210>7<211>17<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>qRT-PCR-GAPDHForward<400>7tcccgccaacatcaaat17<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>qRT-PCR-GAPDHReverse<400>8cacgcccatcacaaacat18<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>qRT-PCR-CEBPαForward<400>9ctgaggtctgccagaagc18<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>qRT-PCR-CEBPαReverse<400>10aacagaagaaggaagggagt20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>ChIP-CEBPαF<400>11cactgtgcaagtggtctcgg20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>ChIP-CEBPαR<400>12cccgttagaatgtgccttcc20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>ChIP-GAPDHF<400>13gatgtcctgagcccctacag20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>ChIP-GAPDHR<400>14ggtaggtgatggggactgag20当前第1页1 2 3