本发明涉及基因和蛋白质工程领域，具体涉及一种复合多表位表达盒、其组成的重组病毒及应用，尤其涉及一种新城疫病毒插入IBV表位盒嵌合重组病毒和采用这个病毒制备的疫苗。
背景技术：
ND(防治新城疫，Newcastle disease)是一种急性高度致死性的禽类疫病，世界动物卫生组织(OIE)要求必须上报的传染性。ND的病原为新城疫病毒(New castle disease virus，NDV)，为副黏病毒科(Paramyxoviridae)、禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)成员。NDV为单股负链RNA病毒，基因组全长约15.8kb，包括6个开放阅读框架，分别编码核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素－神经氨酸酶(HN)和大聚合酶蛋白(L)。
根据毒力差异，NDV可分为强毒株(Velogenic)、中等毒力株(Mesogenic)和弱毒株(Lentogenic)。强毒株可引起禽的急性、致死性感染，具有较高的死亡率。弱毒株仅引起轻度的呼吸道感染或肠道感染，因而被广泛地运用于新城疫活疫苗的生产。在众多NDV活疫苗中，以LaSota株、Clone30株等为代表的低毒力活疫苗以其使用方便和毒副作用小在中国应用较为广泛。La Sota株在上世纪70年代早期就被批准在欧洲作为疫苗株使用，此后用该毒株生产的新城疫病毒疫苗在世界范围内广泛使用。但低毒力活疫苗耐热性能较差和冷藏条件要求高，因疫苗保存或使用不当而导致免疫失败时有发生。
目前已经批准生产的用于防治新城疫(Newcastle disease，ND)及鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)的疫苗多为二联灭活疫苗或者单苗，CN104548088A公开了一种鸡新城疫病毒La Sota株和鸡传染性支气管炎病毒N-S多表位蛋白为抗原的二联疫苗制备方法，该抗体可同时预防鸡新城疫、鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒感染，但其在临床生产中存在大量不足之处：其不能诱导机体产生细胞免疫，使用剂量大且需要佐剂的配合，制备过程较复杂，制作成本较高，即使是全病毒的灭活苗也需要两次以上的加强免疫才能有效引发中和抗体的产生。此外，鸡传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis virus，IB IBV)的血清型众多，并且不同血清型之间交叉保护性差，使用单一血清型的弱毒疫苗或灭活疫苗只能保护同一种血清型病毒感染的宿主，对其他不同血清型IBV的保护作用较低或无保护。
从1999年欧洲学者建立了第一个NDV的反向遗传操作技术(Reverse genetic system，RGS)至今，该技术已经成功应用于NDV的致病性、复制调控机理、疫苗载体等方面的研究。尤其是NDV弱毒疫苗株作为疫苗载体，可在其基因组的不同位点插入并表达免疫源性基因，经细胞或鸡胚连续高代次传代仍保持高度的遗传和表达稳定性。已有许多禽类病原的免疫源性基因，例如禽流感病毒的HA基因、鸡传染性法氏囊病毒的VP2基因和鸡传染性支气管炎的S2基因等，在NDV载体内实现了高效表达，并取得了较好的免疫保护效果。但是，目前大部分的NDV RGS研究仅限于非耐热毒株，关于耐热毒株RGS的建立鲜有报道。
IB是OIE及我国规定的家禽B/二类传染病之一。该病是由IBV引起的一种急性、高度传染性并具有重大经济意义的病毒病。IBV属于冠状病毒科，是冠状病毒的代表株。S蛋白是构成冠状病毒最表层纤突的主要成分，由S1和S2两部分构成，IBV主要的细胞表位存在S1蛋白中，S1蛋白是决定IBV血清特异性抗原决定簇的主要蛋白。由于IBV血清型众多，S1是IBV变异程度最大的基因，不同毒株S1基因核苷酸变化幅度可高达50％以上，在同一血清毒株的S1基因中有25％-50％的氨基酸差异。这些差异导致各毒株之间交叉免疫保护性弱，因此局限于某一特定亚型的IBV疫苗可能无法提供完全保护，而使用多种IBV亚型制备二联苗或多联苗因多种抗原出现自身抗原交叉反应干扰效果并不理想。IBV发生于所有养禽国家，且病原存在多个临床表型，包括肾型、呼吸型和腺胃型等，并且常与NDV、AIV等病毒造成混合感染，给该病的防控带来较大困难。目前我国养鸡场这3种亚型传染性支气管炎病毒均有发现。
市场上使用的IBV疫苗主要是活病毒疫苗和灭活病毒油佐剂疫苗，活病毒疫苗主要用于雏鸡的早期的保护或者是初次免疫使用，灭活疫苗一般用于加强免疫使用。由于IBV十分容易失活，经常导致田间实验因疫苗的效力不足而失败。且常规疫苗仅能保护单一亚型IBV，无法产生交叉免疫保护作用。因此，研制能够保护多亚型IBV通用疫苗十分迫切且必要。
随着对病原体抗原表位的深入研究，基于表位为基础的疫苗开始显示出良好的应用前景。多表位疫苗最关键是获得保护性抗原基因，抗原基因由若干个抗原决定簇，又称抗原表位(antigen epitope)组成。抗原表位是真正具有刺激免疫细胞产生免疫应答的成分。根据抗原受体结合的细胞不同，抗原表位分为T细胞表位和B细胞表位，T细胞表位主要通过在抗原提呈细胞(APC)中与MHC分子结合后提呈于细胞表面与TCR结合后激活T细胞免疫应答。MHC I类分子主要结合8-10个氨基酸的多肽，而MHC II类分子主要结合12-25个氨基酸多肽，B细胞表位在结构上与T细胞不同，其包括两种形式，非连续的构像表位和连续的线性表位，两者均无MHC限制性，B细胞表位相对较长，范围从10多个氨基酸到100多个氨基酸不等，通过结合BCR激活B淋巴细胞分泌抗体发挥抗病毒作用。通过对潜在抗原表位进行筛选，选择具有保护性抗原表位，以此为基础构建的单价或多价疫苗，是提高疫苗免疫保护效果的一种确实方法。筛选出的功能表位疫苗不但能够避免抑制性表位诱导的免疫抑制作用，还可以使保护性表位诱导的免疫反应处于主导地位。
鸡的MHC位于16号染色体上，由B和Y位点两个基因区域组成，B区域包括3个基因群：B-F，B-L和B-G，其中B-F和B-L所编码的抗原在结构和功能上分别等同于哺乳动物MHC的Ⅰ类和Ⅱ类分子。B-F基因又分为B-F1和B-F2两类，鸡的B-F2基因主要负责提呈内源性抗原肽，提供给CD8+T细胞识别，诱导细胞免疫应答。MHC I分子单倍型相当于一个特定的型具有一个特定多肽氨基酸锚定位点，只有对应的型才能识别特定的多肽氨基酸序列。而这个多肽序列与特定的MHC I类分子单倍型结合后形成多肽-MHC I分子复合体提呈到细胞表面供T细胞受体(TCR)识别，识别后才能激活杀伤性T淋巴细胞，产生细胞杀伤作用，具备细胞免疫答应。
目前关于IBV的B细胞抗原表位研究较多的主要集中在N蛋白和M蛋白上，S蛋白的B细胞抗原表位报道相对较少。不同类型传染性支气管炎病毒S蛋白的氨基酸差异主要集中在S1蛋白区域，推断高变区域可能是S1蛋白的B细胞抗原表位区。研究表明，大多数IBV的B细胞抗原表位位于S1蛋白的N端，不同毒株S蛋白的氨基酸差异也都集中在S1的3个区域上，分别是：N端第37-83氨基酸处，内含有两个亲水区；第117-160氨基酸处，为疏水区；第269-298氨基酸处，为强亲水区。推断这些区域都可能是S1蛋白上抗原表位，其次氨基酸第294-316位，第532-537位以及第548-566位对保护也可能有作用。与B细胞表位不同，鸡的T细胞表位受到严格的种属MHC限制，主要与鸡的B-F2单倍型结合基序关系紧密。
目前对于IBV的T细胞表位研究较少，基于以上分析，如何找到一种热稳定性好，病毒滴度高，遗传稳定性好，免疫原性强，免疫保护期长等特点的是重组NDV一个亟待解决的问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种复合多表位、其组成的重组病毒及应用，该病毒和疫苗能够引起鸡产生高水平的细胞免疫和体液应答反应，能够对致死剂量的鸡传染性支气管炎病毒攻毒产生完全保护。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种复合多表位表达盒，所述表达盒包含有：
(a)来源于鸡传染性支气管炎病毒Holte株和鸡传染性支气管炎病毒QX样株的S1蛋白的T细胞表位；
(b)来源于鸡传染性支气管炎病毒澳大利亚T株的S1蛋白的B细胞表位。
本发明中，发明人根据鸡B-F2*04(BF04)，B-F2*12(BF12)，B-F2*15(BF15)和B-F2*19(BF19)单倍型的MHC I类分子的结合基序对IBV M41株、澳大利亚T株以及QX样ck/CH/TS/201012株的S1基因氨基酸进行比对，筛选出符合结合基序列IBV S1蛋白的CD8+T细胞表位，筛选出的功能表位疫苗不但能够避免抑制性表位诱导的免疫抑制作用，还可以使保护性表位诱导的免疫反应处于主导地位，通过构建的重组IBV多表位嵌合S-T/B基因的rNDV-IBV-T/B株，能够同时保护NDV以及多种亚型IB，重组NDV依赖于鸡胚扩增，病毒滴度高，遗传稳定性好，免疫原性强，免疫保护期长等特点，并且具有热稳定性好，更加适宜运输及贮存。
不仅如此，发明人还发现，通过将T细胞表位和B细胞表位同时插入到一个重组病毒上，相比于单独含有T细胞表位或B细胞表位的重组病毒，T细胞表位和B细胞表位能够协同增效，使得病毒免疫时间更早，免疫反应更全面。
根据本发明，所述T细胞表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-4所示，具体序列如下：
所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列如下：GAYAVVNV；
所述SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列如下：SRIQTATQP；
所述SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列如下：SRIQTATDP；
所述SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列如下：SRNATGSQP.
根据本发明，所述B细胞表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.5-7所示，具体序列如下：
所述SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列如下：NYVYYYQSAFRPSGGWHLHGGAYAVVNVSQETSNAGS；
所述SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列如下：RIAAMKQGGNGPSDLFY；
所述SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列如下：QTYQTQTAQSGYYNFNFSFLSGFVYKEFNFMYGSYHPKCNFRPENINNGLWFNSLSVSLAYGPLQGGCKQSVFHGRATCCYAYSYLGPRLCKGVYSGELTQQFECGL.
本发明中，对T细胞表位和B细胞表位中的细胞表位的顺序不作限定，发明人发现顺序的调整不会对病毒的效果产生太大的影响，所以，无论T细胞表位和B细胞表位的顺序发生调整也在本申请的范围内，本领域技术人员可以根据需要进行调整T细胞表位和B细胞表位的顺序。
根据本发明，所述T细胞表位和B细胞表位中的不同表位采用柔性小分子linker连接。
根据本发明，所述柔性小分子linker为KAA、AAY、AAA、GAAA、KAAA，其核苷酸序列如8-12所示，具体序列如下：
所述KAA(SEQ ID NO.8)所示的氨基酸序列如下：AAAGCTGCT；
所述AAY(SEQ ID NO.9)所示的氨基酸序列如下：GCCGCATAC；
所述AAA(SEQ ID NO.10)所示的氨基酸序列如下：GCTGCCGCC；
所述GAAA(SEQ ID NO.11)所示的氨基酸序列如下：GGCGCAGCAGCC；
所述KAAA(SEQ ID NO.12)所示的氨基酸序列如下：AAAGCAGCCGCA.
本发明中，所述T细胞表位和B细胞表位中采用的柔性小分子linker可以根据需要进行选择，这些柔性小分子linker的连接顺序或是选择不会对重组病毒本身产生太大的影响，本领域技术人员可以根据需要选择柔性小分子linker将T细胞表位和B细胞表位进行相连，在此不作特殊的限定。
根据本发明，所述表达盒前后还包含酶切位点，所述酶切位点为Spe I、XhoI、BamH I、EcoR I、Nde I、Pst I或Xho I中的任意一种，优选为Spe I和Xho I。
根据本发明，所述表达盒前的酶切位点之后还包含KOZAK序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，具体序列如下：GCCACCATG.
本发明中，无论是插入了柔性小分子linker、酶切位点还是KOZAK序列都不会影响病毒的稳定性和致病性。
根据本发明，所述表达盒的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，具体序列如下：
MGNYVYYYQSAFRPSGGWHLHGGAYAVVNVSQETSNAGSGGGGSGGGGSGGGGSRIAAMKQGGNGPSDLFYGGGGSGGGGSGGGGSQTYQTQTAQSGYYNFNFSFLSGFVYKEFNFMYGSYHPKCNFRPENINNGLWFNSLSVSLAYGPLQGGCKQSVFHGRATCCYAYSYLGPRLCKGVYSGELTQQFECGLTSNFDLLKLAGDVESNPGPFFFMQVQIQSLFLLLLWVPGSRGKAAGAYAVVNVAAASRIQTATQPAAYSRNETDSQPGAAASRNATGSQPKAAGAYAVVNVAAASRIQTATQPAAYSRNETDSQPGAAASRNATGSQP；
根据本发明，所述表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，具体序列如下：
ACGGGTAGAAAGCTTGCCACCATGGGAAATTACGTTTACTACTACCAAAGTGCCTTCAGACCATCAGGTGGTTGGCATTTACATGGAGGTGCTTATGCAGTAGTAAATGTTTCGCAAGAAACCAGTAATGCAGGAAGCGGAGGCGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGCGGAGGGTCTCGTATTGCTGCCATGAAGCAAGGCGGTAATGGGCCTAGTGATTTATTTTATGGAGGCGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGCGGAGGGTCTCAAACTTATCAAACACAAACAGCTCAGAGTGGTTATTATAATTTTAACTTCTCATTTCTGAGTGGTTTTGTGTATAAGGAGTTTAATTTTATGTATGGTTCTTATCACCCAAAGTGTAATTTTAGACCAGAAAACATTAATAATGGCCTCTGGTTTAATTCACTTTCAGTTTCGCTTGCGTATGGCCCTCTTCAAGGCGGCTGCAAGCAATCTGTCTTTCATGGTAGAGCAACTTGCTGTTATGCCTACTCCTATTTAGGTCCTAGGTTATGTAAAGGTGTTTATAGTGGTGAGTTAACACAGCAGTTTGAATGTGGACTGACTAGTAACTTTGACCTGCTCAAGTTGGCAGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGGCCTTTCTTCTTCATGCAGGTGCAGATCCAGAGCCTGTTTCTGCTCCTCCTGTGGGTGCCCGGCTCCAGAGGAAAAGCTGCTGGTGCATATGCAGTCGTCAACGTTGCTGCCGCCAGTAGGATTCAGACGGCTACTCAGCCGGCCGCATACAGTAGAAATGAGACCGATAGTCAGCCGGGCGCAGCAGCCAGTAGAAACGCTACTGGTAGTCAACCGAAAGCTGCTGGTGCATATGCAGTCGTCAACGTTGCTGCCGCCAGTAGGATTCAGACGGCTACTCAGCCGGCCGCATACAGTAGAAATGAGACCGATAGTCAGCCGGGCGCAGCAGCCAGTAGAAACGCTACTGGTAGTCAACCGTAATAATTAAGAAAAAAT.
第二方面，本发明提供一种复合多表位，所述复合多表位包含第一方面所述的复合多表位表达盒。
根据本发明，所述复合多表位以新城疫病毒LaSota株为骨架。
根据本发明，所述复合多表位表达盒插入新城疫病毒LaSota株的M基因和F基因之间。
根据本发明，所述新城疫病毒LaSota株中的HN基因替换为新城疫病毒TS09-C株中的HN基因。
为了提高NDV(New castle disease virus，NDV)病毒载体活疫苗的热稳定性，本发明将LaSota株的血凝素神经氨酸酶(HN)基因替换成TS09-C耐热弱毒株的HN基因，结果发现，重组病毒的热稳定性得到显著增强，此外，重组NDV载体还可以插入外源表达基因，而不会增强亲本病毒株的毒力且病毒滴度稳定。
根据本发明，所述新城疫病毒TS09-C株中的HN基因的氨基酸序列如SEQID NO.16所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，具体序列如下：
所述SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列如下：
MDRAVSQVALENDEREAKNTWRLVFRIAILLSTVVTLAISAAALAYSMEASTPSDLVGIPTAISRAEEKITSALGSNQDVVDRIYKQVALESPLALLNTESTIMNAITSLSYQISGAASSSGCGAPIHDPDYIGGIGKELIVDDASDVTSYYPSAFQEHLNFIPAPTTGSGCTRMPSFDMSATHYCYTHNVILSGCRDHSHSHQYLALGVLRTSATGRVFFSTLRSINLDDTQNRKSCSVSATPLGCDMLCSKVTETEEEDYNSAIPTSMVHGRLGFDGQYHEKDLDVTTLFEDWVANYPGVGGGSFIDNRVWFPVYGGLKPNSPSDTAQEGKYVIYKRYNDTCPDEQDYQIQMAKSSYKPGRFGGKRVQQAVLSIKVSTSLGEDPVLTVPPNTVTLMGAEGRVLTVGTSHFLYQRGSSYFSPALLYPMIVSNKTATLHSPYTFNAFTRPGSVPCQASARCPNSCVTGVYTDPYPLVFYRNHTLRGVFGTMLDDKQARLNPVSAVFDSISRSRITRVSSSSTKAAYTTSTCFKVVKTNKTYCLSIAEISNTLFGEFRIVPLLVEILKDDGVREARSSRLSQLREGWKDDIVSPIFCDAKNQTEYRHELESYAASWP；
所述SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列如下：
ACGGGTAGAACGGTCGGGGAGGCCGTCCCTCAATCGGGAGCCGGGCCTCACAACATCCGTTCTACCGCATCACCAATAGCAGTTTTCAGTCATGGACCGCGCAGTTAGCCAAGTTGCGCTAGAGAATGATGAAAGAGAGGCAAAGAATACATGGCGCTTGGTATTCCGGATCGCAATCCTACTCTCAACGGTGGTGACCTTAGCCATCTCTGCAGCCGCCCTTGCATATAGCATGGAGGCCAGCACACCTAGCGATCTTGTAGGCATACCGACTGCGATCTCTAGAGCAGAGGAAAAGATTACATCTGCACTCGGTTCCAATCAAGATGTAGTAGATAGGATATATAAGCAGGTGGCCCTCGAATCTCCACTGGCATTGCTAAACACCGAATCTACAATTATGAACGCAATAACGTCTCTCTCTTATCAAATCAGTGGGGCCGCAAGTAGCAGCGGATGTGGAGCACCCATTCATGATCCAGATTATATTGGAGGAATAGGTAAAGAACTTATTGTAGATGATGCTAGCGACGTCACATCATACTATCCCTCTGCGTTCCAAGAACACCTGAACTTTATCCCGGCGCCTACTACAGGATCAGGTTGCACTCGGATGCCCTCATTTGACATGAGCGCTACCCACTACTGTTATACTCACAATGTGATATTATCTGGCTGCAGAGATCACTCGCACTCACATCAATATTTAGCACTTGGTGTGCTTCGGACATCTGCAACAGGGAGGGTATTCTTTTCCACTCTGCGTTCCATCAATCTGGATGACACCCAAAATCGGAAGTCTTGCAGTGTGAGTGCAACCCCCTTGGGTTGTGATATGCTGTGCTCTAAAGTCACAGAGACTGAAGAAGAGGATTATAACTCAGCTATCCCCACGTCGATGGTACATGGAAGGTTAGGGTTCGACGGCCAATACCACGAGAAGGACCTAGATGTCACAACACTATTCGAGGACTGGGTGGCAAACTACCCAGGAGTAGGAGGCGGGTCTTTTATTGACAACCGCGTATGGTTCCCAGTTTACGGAGGGCTAAAACCCAATTCGCCCAGTGACACCGCACAAGAAGGGAAATATGTAATATACAAGCGATACAATGACACATGTCCAGATGAGCAAGATTATCAGATTCAAATGGCTAAGTCTTCATATAAGCCTGGGCGGTTTGGAGGGAAACGCGTACAGCAGGCCGTCTTATCTATCAAAGTGTCAACATCCTTGGGCGAGGACCCGGTGCTGACTGTACCGCCCAACACAGTAACACTCATGGGGGCCGAAGGCAGAGTTCTCACAGTAGGGACATCTCATTTCCTTTATCAGCGAGGGTCATCATACTTCTCCCCTGCCCTACTATATCCTATGATAGTCAGCAACAAAACAGCCACTCTTCATAGTCCTTATACATTCAATGCCTTCACTCGACCAGGTAGTGTCCCTTGCCAGGCTTCAGCAAGATGCCCTAACTCATGTGTTACCGGAGTCTATACTGATCCATATCCCTTGGTCTTCTATAGGAACCACACCTTGCGAGGGGTATTCGGGACGATGCTTGATGATAAACAAGCAAGACTCAACCCTGTATCTGCAGTATTTGACAGCATATCCCGCAGTCGCATAACCCGGGTGAGTTCAAGCAGCACCAAGGCAGCATACACAACATCAACATGTTTTAAAGTTGTAAAGACCAATAAAACCTATTGTCTCAGCATTGCCGAAATATCCAATACCCTCTTCGGGGAATTCAGAATCGTCCCTTTACTAGTTGAGATTCTCAAGGATGATGGGGTTAGAGAAGCCAGGTCTAGCCGGTTGAGTCAACTGCGAGAGGGTTGGAAAGATGACATTGTATCACCTATCTTTTGCGACGCCAAGAATCAAACTGAATACCGGCACGAGCTCGAGTCCTACGCTGCCAGTTGGCCATAATCAGCTAGTGCTAATGTGATTAGATTAAGTCTTGTCGGTAGTCACTTGATTAAGAAAAAA.
第三方面，本发明提供编码如第一方面所述复合多表位表达盒或第二方面所述复合多表位的基因。
第四方面，本发明提供一种重组病毒，其包括第三方面所述的基因。
第五方面，本发明提供一种复合多表位疫苗，其包括第四方面所述的重组病毒。
本发明中，NDV弱毒疫苗可同时诱导全身性体液免疫、局部黏膜免疫及细胞免疫的形成，能够提供给机体更加全面、确实的保护；NDV可在体内增殖并长期表达抗原基因，因此可以诱导持久的保护作用；NDV疫苗可通过饮水、喷雾、滴鼻、点眼或注射多种方式给苗，使用极为方便；NDV弱毒具有高滴度的鸡胚生长特性，生产成本低廉；NDV遗传相对稳定，仅有一个血清型，毒株间发生重组及毒力返强可能性很小；复制过程在胞浆内完成，从RNA到RNA，不存在DNA阶段，无整合到宿主细胞DNA的可能，没有人工转基因的风险；NDV不能在人的正常细胞中复制，对人一般没有感染性；NDV尤其是弱毒株对人类是安全的，在动物食品安全方面十分可靠。
第六方面，本发明提供如第三方面所述的基因、如第四方面所述的重组病毒或如第五方面所述的复合多表位疫苗用于制备治疗新城疫和/或鸡传染性支气管炎的药物。
第七方面，本发明提供如第三方面所述的基因、如第四方面所述的重组病毒或如第五方面所述的复合多表位疫苗用于治疗新城疫和/或鸡传染性支气管炎。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明将鸡传染性支气管炎病毒的多表位嵌合S-T/B基因插入至LaSota株的骨架中，使得LaSota株可以表达S1-T/B蛋白，可达到同时预防ND和IB两种疫病的目的，且T细胞表位和B细胞表位协同增效，使得病毒免疫时间更早，免疫反应更全面；
(2)本发明将TS09-C弱毒株的HN基因替换至LaSota疫苗株，增加了LaSota株的热稳定性，没有增加其致病性，降低了疫苗保存条件和延长保存期限的目的；
(3)本发明疫苗生产成本较灭活疫苗降低30％，免疫途径为滴鼻、点眼，相对于灭活疫苗省时省力，按每年免疫接种10亿羽鸡只计算，表达IBV S1蛋白T/B细胞多表位的重组NDV载体活疫苗(rNDV-IBV-T/B)株与ND及IB单苗相比，可减少了免疫次数2次以上，并能够有效地控制这两种呼吸道传染病的流行与发生，由此节约疫苗使用带来的直接经济效益大约8000万元-1亿元/年；
附图说明
图1为本发明病毒感染性克隆构建示意图，其中，目的基因1为TS09-C株HN基因；目的基因2为IBV S1基因T/B细胞多表位基因盒；T7RNA聚合酶启动子序列；IRL：内部长重复序列；TRL：末端长重复序列；TRS：末端短重复序列；IRS：内部短重复序列；
图2(A)为NP(核蛋白)表达质粒的酶切鉴定；图2(B)为P(磷蛋白)表达质粒的酶切鉴定；图2(C)为L(大聚合酶蛋白)表达质粒的酶切鉴定；
图3为本发明重组新城疫病毒插入IBV-T/B表位盒基因的PCR鉴定结果；
图4为重组病毒rNDV-IBV-T/B电镜照片；
图5(A)和图5(B)为重组病毒rNDV-IBV-T/B传代25次表位盒基因PCR鉴定结果；
图6为免疫后ELISA检测NDV特异性IgG抗体；
图7为CD8+T细胞增殖分析；
图8为鸡传染性支气管炎病毒攻毒保护效率实验结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1替换TS09-C株HN基因以及插入IBV S1-T/B多表位重组质粒的构建及病毒拯救
根据TS09-C株已定的全基因组序列(GenBank登录号：JX110635.1)，设计3对引物SEQ ID NO.18-23，其中设计引物时在5′端非编码区下游引入了丁型肝炎病毒核酶序列和T7RNA聚合酶终止子序列，在3′端非编码区上游引入了T7RNA聚合酶启动子序列，具体如下表1所示：
表1
从感染有LaSota株病毒的尿囊液中扩增出3个相互重叠的全基因组cDNA片段，分别为1-4616nt,4517-8417nt,8318-15186nt，将3个cDNA片段再逐步连接至克隆载体质粒pBR322，获得全长cDNA克隆pBR-LS；
采用RT-PCR方法，从感染有TS09-C株病毒的尿囊液中扩增出HN基因，通过融合PCR方法将TS09-C株HN基因整合并替换pLS中HN基因获得质粒pBR-LS-THN，同样方法将鸡传染性支气管炎病毒的多表位嵌合S-T/B基因插入至LaSota株的M和F基因之间，获得质粒pNDV-IBV-T/B，质粒图谱如图1所示；
以pLS质粒为PCR模板，采用RT-PCR方法分别扩增出NDV LaSota株的NP、P和L基因的全序列，并连接至pVAX1真核表达质粒，获得了能够分别表达NDV NP、P和L蛋白的辅助质粒，即pVAX-NP、pVAX-P和pVAX-L。
采用磷酸钙方法进行质粒共转染，按照操作说明将4个质粒pNDV-IBV-T/B、pVAX-NP、pVAX-P和pVAX-L(质量比例为4:2:1:1)共转染至预先感染vTF7-3的BHK-21细胞，转染6h后，洗涤细胞2次，加入含1％双抗和0.2μg/mL TPCK-胰酶的DMEM营养液继续孵育3d后，反复冻融3次，收获细胞培养物，在以0.22μm孔径滤器过滤除去痘病毒vTF7-3后，在9～11日龄SPF鸡胚内连续传代3次，收获尿囊液并进行病毒检测；
含有热稳定性TS09-C株HN基因的LaSota株全长cDNA骨架中在P和M基因之间插入传染性支气管炎病毒S1蛋白T、B细胞表位盒IBV-T/B，获得重组质粒pNDV-IBV-T/B。辅助质粒pVAX-P酶切鉴定后电泳出现5.5kb和1.2kb大小的目的片段，pVAX-NP经Xho I和Xba I酶切后电泳出现5.5kb和1.5kb大小的两条目的片段，pVAX-L经EcoR I酶切出现8.2kb、2.9kb、1.0kb大小的三条目的片段，酶切验证图谱如图2(A)-图2(C)所示；
将pNDV-IBV-T/B与三个辅助质粒pVAX-NP，pVAX-P和pVAX-L(质量比例为4:2:1:1)共转染至预先感染vTF7-3的BHK-21细胞后培养72h，收获细胞上清，过滤后接种SPF鸡胚，收集尿囊液，提取RNA后反转录成cDNA，以位于P基因的上游引物和位于M基因的下游引物进行RT-PCR扩增，得到1365bp长的S-T/B PCR产物，PCR鉴定结果如图3所示，测序结果与预期序列100％匹配。
表明传染性支气管炎病毒T/B表位序列在NDV的正确位置插入，获得了预期的重组病毒。
实施例2重组rNDV-IBV-T/B的鉴定及纯化
(I)病毒滴度及生长动力学
通过HA试验，0.2μg/ml TPCK-胰蛋白酶存在条件下BHK-21细胞上的50％组织培养感染剂量(TCID50)测定以及10日龄SPF鸡胚中50％卵感染剂量(EID50)测定重组新城疫载体活疫苗的病毒滴度；
为了测定重组病毒的生长动力学，将BHK-21细胞的单层细胞用0.1MOI的重组新城疫载体活疫苗感染1.5小时，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤三次，并用含有2％胎牛血清(FBS)的培养基覆盖，在指定的时间点收集来自感染细胞培养基上清，并使用TCID50测定法进行来自培养基的病毒滴定；
根据替换HN基因及插入S1-T/B表位盒序列位置设计以下引物：SEQ IDNO.24-25针对TS09-C HN基因，SEQ ID NO.26-27针对S1-T/B表位盒，具体序列如表2所示：
表2
具体的PCR体系如下表3所示，具体如下：
表3
具体的PCR条件如下表4所示，具体如下：
表4
扩增得到HN片段以及S1-T/B基因片段。
II)重组病毒的纯化
选择鉴定为阳性且为单个蚀斑的病毒株纯化，将该病毒孔的细胞消化后，吸取一半稀释100倍，最后用2％FBS DMEM培养基定容到10ml，将10ml病毒混合液分装于96孔板，每孔100μl，在37℃，5％CO2培养5天后，观察96孔板，选择单个的蚀斑孔进行鉴定，并保存。
III)热稳定性试验
将1.0ml未稀释的重组新城疫病毒尿囊液在无菌的小瓶中密封，将小瓶浸入56℃的水浴中，并在指定的时间点转移到冰水中以停止热灭活，分别通过在BHK-21细胞进行TCID50测定以及标准HA测定中来滴定热灭活重组新城疫病毒的感染性和HA活性；通过监测不同时间点的重组新城疫病毒和亲本株LaSota，并根据时间和病毒感染性和HA活性绘制回归线，对于HA活性，耐热性病毒的时间点分别为30，60，90和120分钟。
为验证拯救出的重组病毒rNDV-IBV-T/B是否具有与亲本TS09-C株相似的耐热特性，开展了rTS09-C的耐热特性测定试验：将感染的鸡胚尿囊液56℃水浴，分别在热处理30、60、90和120min后取出，立即冰浴，为判定耐热处理后的病毒是否仍具有感染性，将热处理后的尿囊液接种SPF鸡胚(5枚/样品)，感染5d后收获尿囊液，测定HA活性，结果如下表5所示：
表5
注：+表示有鸡胚感染性；－表示无鸡胚感染性。
从表5可以看出，TS09-C株经56℃热处理60min时，仍具有感染性，rNDV-IBV-T/B株则略长，可达90min，而La Sota株经热处理30min后，无感染性，表明重组rNDV-IBV-T/B株具有耐热特性。
IV)电镜观测
在9～11日龄SPF鸡胚内对重组病毒进行大量增殖，将收获的尿囊液以2000r/min离心20min，收取上清液并以28 000r/min离心2h，弃上清液，沉淀用PBS重悬，将重悬后的样品加到20％、40％、60％的不连续蔗糖密度梯度的上层，28000r/min离心2.5h，收集40-60％中间的蛋白层，将收取的蛋白层以PBS稀释混匀，28000r/min离心2h，沉淀用PBS重悬，取1～2滴加至铜网上，经磷酸钨负染后，，用负染法染色后在电镜下进行观察，放大倍数为10000倍，结果如图4所示；
从图4可以看出，该病毒粒子的形态呈现不规则形状，大小不完全一致，直径约为200～300nm，并可清晰地观察到位于病毒表层的囊膜，与NDV的形态相符，上述结果充分证明了重组病毒rNDV-IBV-T/B拯救成功。
实施例3重组rNDV-IBV-T/B的生物学特性测定
将以上每一代收集的尿囊液按OIE标准进行重组病毒的生物学特性测定，包括最小致死剂量的平均致死时间(MDT/MLD)、脑内接种致病指数(ICPI)毒力指数和血凝试验(HA test)。
(I)MDT测定
取10日龄的鸡胚，将疫苗按10的倍数进行递增稀释，接种10-7，10-8，10-9，10-10，10-11五个稀释度，SPF鸡胚尿囊腔内接种，每个稀释度接种5枚鸡胚，每胚接种0.1ml，置37.5℃孵化器内孵化，每日照蛋两次，连续观察7天，记录各个鸡胚的死亡时间，最小致死量是指所有用此稀释度接种的鸡胚死亡的最大稀释度，MDT是最小致死量引起所有鸡胚死亡的平均时间(h)；
时间判断标准：速发型(急性/强毒)<60h，中发型(亚急性、中等毒力)为61-90h，缓发型(低毒力)为大于90h，结果如表6-7所示：
表6最小致死剂量的测定
表7平均死亡时间的测定
从表6可以看出，重组新城疫rNDV-IBV-T/B以及其亲本株LaSota的最小致死剂量为10-8，从表7可以看出，重组新城疫病毒鸡胚最低致死剂量的平均致死时间为161小时，与亲本株无显著差异。
(II)ICPI测定
重组NDV鸡胚尿囊液毒，分别用灭菌生理盐水作1:10稀释，每个毒株均用微量注射器(0.25ml)接种8只出壳后24-36小时的易感雏鸡，每只脑内接种0.05ml，同时设立对照组4只，每只接种灭菌生理盐水0.05ml，隔离饲养；每天在与接种相对应的时间观察鸡群的健康状况，并对试验鸡进行评定：正常的记0分，发病的记1分，死亡的记2分，连续观察8天，最后按公式求出ICPI，具体结果如表8所示：
表8 1日龄雏鸡脑内接种致病指数测定
从表8可以看出，组病毒的1日龄SPF鸡脑内致病指数为0.00。
综合表6-表8的结果，很明显，重组新城疫病毒为弱毒株，具有较高的安全性。
(III)HA测定
使用的红细胞为按常规方法新鲜制备的1％鸡红细胞，HA实验中均以LaSota母本毒株作为阳性对照做同样检测，HA检测为阳性的尿囊液样品用0.9％灭菌生理盐水做1:100、1:500和1:1000不同倍数稀释后继续接种SPF鸡胚，每隔稀释度接种3枚，0.2mL/枚，按上述方法培养后收集尿囊液同样做HA检测，HA检测为阳性的尿囊液均适当稀释后继续进行鸡胚传代。
重组新城疫病毒在SPF鸡胚中连续传25代，并利用RT-PCR方法以及DNA测序检测IBV-T/B表位盒的核苷酸序列突变情况，结果如图5(A)-图5(B)所示。
从图5(A)-图5(B)可以看出，多次传代后IBV-T/B表位盒基因仍然稳定存在且及其碱基没有突变，基因遗传稳定性良好。
实施例4重组rNDV-IBV-T/B的免疫保护效力
将60只SPF鸡随机分成4组，每组15只，具体分组如表9所示，7日龄首免，21龄分别攻毒，剂量为5*105ELD50NDV和IBV，具体如下：
表9实验分组及免疫程序
(I)ELISA检测特异性鸡传染性支气管炎病毒IgG抗体
首免前及免疫后7d、14d、21d每组随机抽取3只鸡翅下静脉采血并分离血清，用间接ELISA方法检测抗体效价，具体方法为：将NDV和IBV病毒液用包被液10倍稀释后，加入酶标板中，100ul/孔，4℃过夜；弃掉液体，用PBST洗板3次，300μl/孔，每次3min，每孔加入200μl 10％胎牛血清封闭，置于37℃作用2h，PBST洗板3次；加入提前用PBS稀释20倍的待测血清，100ul/孔，置于37℃作用2h，PBST洗板3次；加入兔抗鸡酶标抗体IgG(PBS稀释1:5000)100μl/孔，37℃作用1h，洗板3次，加入TMB底物溶液100ul/孔，避光室温作用20min；加入2N H2SO4 100μl/孔终止反应，于波长450nm下测定各孔OD值，结果如图6所示。
从图6可以看出，显示疫苗组在首免后7天抗体水平即快速上升，并且在14d到达高峰随后下降并保持较高水平，疫苗免疫组均显著高于PBS对照组(p<0.05)。
(II)CD8+T淋巴细胞增殖分析
每组随机选择三只鸡安乐死，无菌条件下分离脾脏并制备淋巴细胞悬液，淋巴细胞用预热的1ml含有2.5μM CFSE的PBS在37℃水浴培养10分钟染色，处理后用0.2mL FBS终止，利用RPMI 1640培养基将细胞密度定为106细胞/ml，将染色的淋巴细胞分为两组，并分别以106个细胞/孔接种于24孔板中，分别利用鉴定的功能性T细胞表位多肽(P8SRIQTATDP，P9SRNATGSQP，P18GAYAVVNV和P19SRIQTATQP)以及鸡传染性支气管炎病毒刺激淋巴细胞，淋巴细胞在37℃，5％CO2温箱内培养5天，利用PE标记小鼠抗鸡CD8T细胞单克隆抗体对培养后淋巴细胞染色，使用流式细胞术检测CD8+T细胞增殖比例，并利用CXP软件测定增殖率；利用流式细胞术确定PBS对照组免疫后CD8+T细胞增殖率，将其作为标准化设定为100％并与其他免疫组增殖率进行比较，结果如图7所示。
从图7可以看出，IBV刺激时，rNDV-IBV-T/B组中CD8+T细胞增殖率为133.5±1.8％，显着高于PBS组(100.5±0.6％)(p<0.05)；混合T细胞表位刺激诱导T细胞增殖率最高的也是rNDV-IBV-T/B(131.1±0.7％)，显著高于PBS对照组pV-S1B(100.7±2.1％)有统计学差异(P<0.05)；结果显示重组多表位活疫苗rNDV-IBV-T/B能够诱导鸡产生显著的T淋巴细胞增殖。
实施例5重组rNDV-IBV-T/B的攻毒保护实验
实验方法；加强免疫后第7天攻毒。用IBV Australia T株经滴鼻途径进行攻毒，106ELD50/只，攻毒后观察各组鸡发病情况，连续观察10天，结果如图8所示。
从图8可以看出，攻毒后第4天PBS组鸡只开始出现死亡，其死亡率达100％，剖检病变主要在呼吸道和肾脏，具体表现为上呼吸道充满黏液，喉头肿胀，气管有出血点，肾脏肿大，呈典型的花斑肾，疫苗rNDV-IBV-T/B免疫后，提供的NDV和IBV的保护效力分别为100％、90％；可见，提供的rNDV-IBV-T/B活疫苗免疫SPF鸡后能够有效抵抗NDV强毒以及IBV强毒的攻击，保护率分别为100％和90％，证明该疫苗安全有效。
综上所述，本发明将鸡传染性支气管炎病毒的多表位嵌合S-T/B基因插入至LaSota株的骨架中，使得LaSota株可以表达S1-T/B蛋白，可达到同时预防ND和IB两种疫病的目的，且T细胞表位和B细胞表位协同增效，使得病毒免疫时间更早，免疫反应更全面；不仅如此，本发明将TS09-C弱毒株的HN基因替换至LaSota疫苗株，增加了LaSota株的热稳定性，没有增加其致病性，降低了疫苗保存条件和延长保存期限的目的。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心)
<120> 一种复合多表位表达盒、其组成的重组病毒及应用
<130> 2018
<160> 27
<170> PatentIn version 3.3
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Tyr
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<400> 14
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Leu Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Arg Gly Lys Ala Ala Gly Ala
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Tyr Ala Val Val Asn Val Ala Ala Ala Ser Arg Ile Gln Thr Ala Thr
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Gln Pro Ala Ala Tyr Ser Arg Asn Glu Thr Asp Ser Gln Pro Gly Ala
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Ala Ala Ser Arg Asn Ala Thr Gly Ser Gln Pro Lys Ala Ala Gly Ala
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Tyr Ala Val Val Asn Val Ala Ala Ala Ser Arg Ile Gln Thr Ala Thr
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ccatcaggtg gttggcattt acatggaggt gcttatgcag tagtaaatgt ttcgcaagaa 120
accagtaatg caggaagcgg aggcggaggc tccggaggag gaggctccgg aggcggaggg 180
tctcgtattg ctgccatgaa gcaaggcggt aatgggccta gtgatttatt ttatggaggc 240
ggaggctccg gaggaggagg ctccggaggc ggagggtctc aaacttatca aacacaaaca 300
gctcagagtg gttattataa ttttaacttc tcatttctga gtggttttgt gtataaggag 360
tttaatttta tgtatggttc ttatcaccca aagtgtaatt ttagaccaga aaacattaat 420
aatggcctct ggtttaattc actttcagtt tcgcttgcgt atggccctct tcaaggcggc 480
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cctaggttat gtaaaggtgt ttatagtggt gagttaacac agcagtttga atgtggactg 600
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ttaagaaaaa at 1032
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Thr Val Val Thr Leu Ala Ile Ser Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Ser Met
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Leu Ser Gly Cys Arg Asp His Ser His Ser His Gln Tyr Leu Ala Leu
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Arg Ser Ile Asn Leu Asp Asp Thr Gln Asn Arg Lys Ser Cys Ser Val
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Ser Ala Thr Pro Leu Gly Cys Asp Met Leu Cys Ser Lys Val Thr Glu
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Gly Arg Leu Gly Phe Asp Gly Gln Tyr His Glu Lys Asp Leu Asp Val
275 280 285
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Gly Ser Phe Ile Asp Asn Arg Val Trp Phe Pro Val Tyr Gly Gly Leu
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<213> 人工合成序列
<400> 18
taatacgact cactataggg agaaccaaac agagaatctg tgagttac 48
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 19
aactcagtgc caacatgact cggac 25
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 20
tcccggtcgg cgccttcaag gtgca 25
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 21
tctgatgctc cgccctctcg ggacc 25
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 22
aaaaatgtgg gtggtagcgg gatat 25
<210> 23
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 23
accaaacaaa gatttggtga atgacaataa ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg 60
gtcttgatgg ccggcatggt cccagcctcc tcgctggcgc cggctgggca aca 113
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 24
atggaccgcg cagttagcca agttg 25
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 25
ttatggccaa ctggcagcgt aggac 25
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 26
cactcggcat cacacggaat c 21
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 27
gtccacaagt caaggcgctg 20