本发明涉及技术领域，尤其涉及。
背景技术：
大鲵(giant)，又被叫做娃娃鱼，属两栖纲有尾目，隐鳃鲵科大鲵属，是世界上最大的两栖动物，是一种处于水生到陆生之间的过渡物种大鲵几乎是和恐龙同一个时代的物种，进化十分原始，被称为“活化石”。
大鲵在我国分布地域也比较广泛，主要栖息于长江、黄河及珠江中上游的各支流中，是我国特有的珍稀野生动物，野生的大鲵被列为国家二级保护动物，不得捕杀，但人工饲养的子二代大鲵可作为一种食用性水产。我国已经开始人工繁殖和驯养大鲵，如今大大鲵数量已经有了大量的增加，并且人工养殖的子二代大鲵是允许食用的。由于各项保护措施和技术的改进，大鲵资源如今处在快速的增长阶段，这给大鲵资源今后的发展利用提供了强有力的保障。
胶原蛋白(collagen)是一种具有三条肽链结构的细胞外蛋白，在生物体内分布广泛，在动物体内所有的蛋白质当中胶原蛋白的含量最高，达到了粗蛋白含量的80％以上，是动物体生命活动的重要参与者。在生物体内，胶原蛋白不仅在含量上有很大的比重，种类也各有不同，目前发现的就有28种之多。胶原蛋白的应用非常广泛，在医学上，可作为生物医学材料。胶原蛋白对皮肤有着及其强的附着性和平滑性，在医学上被用作伤口愈合的缝合线，而且胶原蛋白具有良好的平滑性，使得其在医疗缝合的结头不易松散，这样可以是的伤口在短时间内愈合。医学界还在积极地研究胶原蛋白药物，这些药物大多是在青光眼治疗和眼科中抗感染等方面，也有多用在创伤中的局部治疗及控制伤口的感染，以及妇科的宫颈发育异常和外科的局部麻醉等。在组织工程上，胶原蛋白和细胞外的其他物质构成了成组织细胞外基质，因此是生物体内的一种天然外支架材料。在食品上，胶原蛋白可以用于肉类的烹饪以提高肉质硬度；可以作为天然的肠衣制品；而且胶原蛋白具有固定化酶的功能，具有抗氧化性，这对肉制品的风味和质量都有极大的改善作用。另外，胶原蛋白在化妆品、营养添加剂等领域也有大量应用。
胶原蛋白提取的基本原理是根据胶原蛋白的特性改变蛋白质所在的外界环境，从而把胶原蛋白从其他蛋白质中分离出来。提取方法依据提取介质的不同主要可以分为4种：即热水提取、酸法提取、碱法提取和酶法提取。此外，还有酸、碱结合热水提取，酸酶结合提取等。
在从大鲵来源的材料中提取胶原蛋白时，一般认为热水法由于提取温度较高，得到的胶原蛋白大多变性为明胶；碱法迅速且彻底，但含羟基和巯基的氨基酸全部被破坏且产生消旋作用(结构变异)；酸法得率太低，且提取时间较长，而且色氨酸对酸不稳定。因此，一般多用酶法或者包括酶解步骤的提取方法提取以获得高得率。
例如，cn201710501842.9公开了一种从大鲵中提取胶原蛋白的方法，该方法包括以下步骤：(1)杀菌处理、搅拌制浆、酸浸、水洗、碱浸、二次水洗、盐浸、酶解、纯化等步骤。该专利申请披露，即使采用酸法再结合碱浸、盐浸、酶解中的一种，提取率为40％左右。
又例如，cn201410630235.9公开了一种利用大鲵的蜕皮提取胶原蛋白的方法，该方法包括如下步骤：预处理、酶解粗提、过滤、浓缩、喷雾干燥等步骤，最后得到胶原蛋白，其分子量在3000道尔顿以下。
然而，采用酶法提取同样存在不足。例如，水解不够彻底，由于蛋白酶切除了胶原蛋白的非螺旋端肽，可能会引起胶原蛋白结构部分发生变化。另外，对提取条件例如ph要求比较苛刻，并且使用比较昂贵的酶，对于大规模提取而言，提取方法的成本比较昂贵。
本发明采用提供了一种优化的酸法来从大鲵皮中提取胶原蛋白，该方法能够以高提取率以及全氨基酸从大鲵皮中得到胶原蛋白。
技术实现要素：
为了解决本领域中是上述问题，本发明在第一方面提供了一种从大鲵皮提取胶原蛋白的方法，其中，所述方法包括如下步骤：(1)获取大鲵皮；(2)使用异丙醇浸泡大鲵皮以去除大鲵皮中的脂肪，获得无脂肪大鲵皮；(3)使用碱液浸泡无脂肪大鲵皮以去除大鲵皮中的色素，获得无色素大鲵皮；(4)使用第一酸液浸提无色素大鲵皮，然后进行固液分离，获得包含胶原蛋白的粗提液；(5)向所述粗提液中加入第一盐液使胶原蛋白析出并进行固液分离，获得一次析出胶原蛋白；(6)使用第二酸液将胶原蛋白完全溶解，再加入第二盐液使胶原蛋白析出并进行固液分离，获得二次析出胶原蛋白；(7)将二次析出胶原蛋白进行透析，然后进行冷冻干燥，得到胶原蛋白粉末产品。
本发明在第二方面提供了一种由本发明第一方面所述的方法制得的大鲵胶原蛋白产品。
本发明具有如下技术效果：
(1)高得率。采用本发明的方法可以以高达20％的得率从大鲵皮中提取得到胶原蛋白。
(2)工艺简单。由于无需采用酶解步骤，因此不需要苛刻的反应条件，使得操作工艺简单得到。
(3)氨基酸全面，营养价值高。很多酸法提供从大鲵皮中根本无法提取得到含量少的丙氨酸和对酸不稳定的色氨酸，然而采用本发明可以得到含有高达0.4mg/g的色氨酸和5.0mg/g的丙氨酸。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明具体实施方式对本发明的技术方案进行更清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施实施方式。基于本发明中的实施实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
如上所述，本发明在第一方面提供了一种从大鲵皮提取胶原蛋白的方法，其中，所述方法包括如下步骤：(1)获取大鲵皮；(2)使用异丙醇浸泡大鲵皮以去除大鲵皮中的脂肪，获得无脂肪大鲵皮；(3)使用碱液浸泡无脂肪大鲵皮以去除大鲵皮中的色素，获得无色素大鲵皮；(4)使用第一酸液浸提无色素大鲵皮，然后进行固液分离，获得包含胶原蛋白的粗提液；(5)向所述粗提液中加入第一盐液使胶原蛋白析出并进行固液分离，获得一次析出胶原蛋白；(6)使用第二酸液将胶原蛋白完全溶解，再加入第二盐液使胶原蛋白析出并进行固液分离，获得二次析出胶原蛋白；(7)将二次析出胶原蛋白进行透析，然后进行冷冻干燥，得到胶原蛋白粉末产品。
优选的是，在步骤(1)中，大鲵皮为0.4-0.5cmx0.4-0.6cm的小片。在一些优选的实施方式中，所有步骤均在2-4℃优选为4℃的环境中完成。
优选的是，在步骤(2)中，异丙醇为8重量％至12重量％的异丙醇水溶液中，料液比为1:10，浸泡24小时，每6小时换液一次，浸泡结束后，用水漂洗至中性ph，获得无脂肪大鲵皮。
优选的是，步骤(3)中，所述碱液为0.08-0.12m(即克/升，下同)(例如为0.09、0.10或0.11m)的氢氧化钠水溶液，料液比为1:20，浸泡时间为24小时，每6小时换一次碱液，浸泡结束后，用水漂洗至中性ph，获得无色素大鲵皮。
优选的是，在步骤(4)中，所述第一酸液为0.1-0.5m(例如0.2、0.3或0.4m)的柠檬酸水溶液，浸提时间为6-24小时(例如6、12、18或24小时)；固液分离通过如下方式进行：用纱布粗过滤，然后将滤液于5000r/min离心20分钟，获得粗提液。
在一些优选的实施方式中，柠檬酸水溶液的浓度为0.1-0.4m(例如为0.1、0.2、0.3m或0.4m)并且浸提时间为6-18小时(例如6、12或18小时)；更优选的是，柠檬酸水溶液的浓度为0.1-0.3m(例如为0.1、0.2或0.3m)并且浸提时间为12小时，或者柠檬酸水溶液的浓度为0.1-0.4m(例如为0.1、0.2、0.3m或0.4m)并且浸提时间为18小时；最优选的是，柠檬酸水溶液的浓度为0.3m并且浸提时间为18小时。
优选的是，在步骤(5)中，第一碱液为4.0-6.0m优选为0.5m的nacl水溶液，加入至粗提液中后使得体系的nacl浓度为0.9m，静置24小时分层，然后于6000r/min离心20分钟，获得一次析出胶原蛋白。在一些优选的实施方式中，在步骤(6)中，第二酸液为0.4-0.6m的醋酸水溶液，第二盐液与第一盐液相同，并且加入量同样使得体系的nacl浓度为0.9m，获得二次析出胶原蛋白。
优选的是，在步骤(7)中，透析使用的透析袋的mw＝500，透析液为蒸馏水，透析时间为2-4天，透析液更换频率为8-12小时/次。
在一些具体的实施方式中，本发明方法包括如下步骤：
(1)通过如下方式获取大鲵皮：将大鲵皮去除残存肉后，切成0.5cm*0.5cm大小，放入4℃冷库备用；(2)脂肪去除：去除残肉后切小的大鲵皮先放入10体积％的异丙醇水溶液当中(料液比为1:10)，浸泡24小时，每6小时换液一次，泡完之后首先用自来水漂洗5次，再用蒸馏水漂洗5次，获得无脂肪大鲵皮；(3)去除色素：已经去除脂肪的大鲵皮放入浓度为0.1m的naoh谁溶液中浸泡，料液比为1:20，浸泡时间为24小时，每6小时换液一次，浸泡完之后首先用自来水漂洗5次，再用蒸馏水漂洗5次，获得无色素大鲵皮；(4)提取：将已经去除色素的大鲵皮放入浓度为0.1m的柠檬酸溶液中，6小时后取出，用纱布粗过滤，滤液于5000r/min离心20分钟，离心完后获得粗提液；(5)一次析出：上清液中加入5m的nacl，使nacl浓度约为0.9m，静置24小时分层，以6000r/min离心20分钟，获得一次析出胶原蛋白；(6)二次析出：向一次析出胶原蛋白中加入0.5m的醋酸使其溶解，取上清液加入5m的nacl，使nacl浓度约为0.9m，获得二次析出胶原蛋白；(7)透析(mw＝500)，在蒸馏水中透析3d，每12小时换液一次；(8)真空冷冻干燥；(9)收集干粉；(10)包装。
本发明在第二方面提供了一种由本发明第一方面所述的方法制得的大鲵胶原蛋白产品。
在一些优选的实施方式中，所述大鲵胶原蛋白产品包含0.4mg/g以上的色氨酸和/或5.0mg/g以上的丙氨酸。
由本发明方法制得的大鲵胶原蛋白产品为高纯速溶粉，在一些实施方式中，由于采用纯低温条件，因此最大程度地保存了大鲵的营养保健成分，其产品具有食用方便，同时便于作为化妆品及其他产品的添加剂。
实施例
下文将以实施例的形式对本发明的技术方案进行举例说明，但是本发明的保护范围不限于这些实施例。
材料与方法
本申请实施例所用的试剂如下表1所示。
表1主要试剂及其来源。
本申请实施例中使用到的主要仪器或设备如下表2所示。
表2.主要仪器或设备及其来源。
本实施例中使用到的材料的采集。本申请实施例所采用的大鲵皮为贵阳学院生物资源利用及控制实验室饲养的实验研究子二代大鲵宰杀后取皮，去除皮上的残肉后将其切成约为0.5cm×0.5cm大小，放入冰箱中备用。提取方法的步骤如下：
(1)通过如下方式获取大鲵皮：将大鲵皮去除残存肉后，切成0.5cm*0.5cm大小，放入4℃冷库备用；
(2)脂肪去除：去除残肉后切小的大鲵皮先放入10体积％的异丙醇水溶液当中(料液比为1:10)，浸泡24小时，每6小时换液一次，泡完之后首先用自来水漂洗5次，再用蒸馏水漂洗5次，获得无脂肪大鲵皮；
(3)去除色素：已经去除脂肪的大鲵皮放入浓度为0.1m的naoh水溶液中浸泡，料液比为1:20，浸泡时间为24小时，每6小时换液一次，浸泡完之后首先用自来水漂洗5次，再用蒸馏水漂洗5次，获得无色素大鲵皮；
(4)提取：将已经去除色素的大鲵皮放入浓度为0.1m的柠檬酸水溶液(即第一酸液)中，6小时后取出，用纱布粗过滤，滤液于5000r/min离心20分钟，离心完后获得粗提液；
(5)一次析出：上清液中加入5m的nacl水溶液(第一盐液)，使nacl浓度约为0.9m，静置24小时分层，以6000r/min离心20分钟，获得一次析出胶原蛋白；
(6)二次析出：向一次析出胶原蛋白中加入0.5m的醋酸水溶液(第二酸液)使其溶解，取上清液加入5m的nacl水溶液(第二盐液)，使nacl浓度约为0.9m，获得二次析出胶原蛋白；
(7)透析(mw＝500)，在蒸馏水中透析3天，每12小时换液一次；
(8)真空冷冻干燥；
(9)收集干粉，并称量所得干粉的重量(w)；
实验重复三次，数据为三次独立实验的平均值。经计算，胶原蛋白的得率为17.93％。
实施例2至20
除了表3所述内容之外，以与实施例1基本相同的方式提取胶原蛋白。
对比例1
取与实施例1所用的相同大鲵皮碎片，加入含有3％的胃蛋白酶的0.5m的乙酸水溶液(料液比为1:20)当中，于4℃下浸提18小时，浸提结束后，移到5℃以6000rpm离心20分钟，取上清液，向上清液当中加入nacl水溶液使得溶液中的nacl浓度为0.9m后静置24小时，分层之后于5℃以8000rpm离心20分钟后取出回收絮状物，将絮状物透析7天(隔天换液)取出冷冻干燥，获得胶原蛋白干粉。实验重复三次，数据为三次独立实验的平均值。经计算，胶原蛋白的得率为17.70％。
对比例2
在4℃，加入浓度为0.1m的naoh水溶液浸泡24小时(1:20，重量比)以除去非胶原成分，水洗至中性后加入浓度为0.5m的醋酸溶液(1:20，重量比)匀浆，4℃磁力搅拌萃取2天，10000rpm离心30分钟，上清液即为酸溶性胶原蛋白。在上清液中加入nacl至最终浓度为0.9m，离心，收集沉淀溶于0.5m醋酸水溶液中，用0.1m醋酸水溶液透析1天，再用蒸馏水透析2天，冻干得到胶原蛋白。实验重复三次，数据为三次独立实验的平均值。
对比例3
以与实施例1基本相同的步骤进行，不同之处在于，将步骤(2)和步骤(3)以相反的顺序进行，即先进行实施例1中的步骤(3)然后在进行步骤(2)。实验重复三次，数据为三次独立实验的平均值。
表3.不同实施例所采用的柠檬酸浓度和提取时间以及所得胶原蛋白相对于酶法所得胶原蛋白的百分比(％)。
相对百分比＝各实施例所得胶原蛋白/对比例1所得胶原蛋白x100％。
得率＝各实施例所得胶原蛋白/大鲵皮样品重量x100％。
丙氨酸和色氨酸采用lc-20at高效液相色谱仪进行测定。环境条件：温度18℃、相对湿度78％，依据gb/t16631-2008高效液相色谱法检测样品中丙氨酸和色氨酸的含量。
从表3的结果可以看出，采用本发明的可以得到相当或超过酶法的胶原蛋白得率，并且在一些优选的实施方式中，还可以提取得到一定量的色氨酸(该氨基酸被认为对酸不稳定而无法提取得到)以含量极少的丙氨酸(该氨基酸在很多提取方法中根本没有提取得到)。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。