本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种巴氯芬药物相关基因GABBR1基因多态性检测的引物组合物、试剂盒和方法。
背景技术：
：巴氯芬(baclofen)是解痉药，为γ-氨基丁酸(GABA)的衍生物，具骨骼肌松弛作用。其作用机制为通过刺激GABA受体，抑制兴奋性氨基酸的释放，抑制脊髓内单突触和多突触传递，而起到缓解骨骼肌痉挛状态、降低肌张力、改善使肌力等作用。在临床上用于多发性硬化症引起的骨骼肌痉挛，感染性、退行性、外伤性、肿瘤或原因不明的脊髓疾病引起的痉挛状态，脑源性肌痉挛等。GARBB1是GABA的其中一种受体，定位于人类染色体6p21.3，含22个外显子，研究发现GARRB1rs29220可以预测巴氯芬的治疗效果，该位点杂合子基因的携带者使用巴氯芬的治疗效果显著下降，纯合子与野生型基因的携带者对巴氯芬的疗效无明显差异。因此，通过检出GARRB1rs29220突变可以有效帮助医生对个体在巴氯芬疗效抵抗性上的了解，进而帮助用药指导。但是，目前仍缺乏快速准确检出GARRB1rs29220突变情况的行之有效的方法。技术实现要素：本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种巴氯芬药物相关基因GABBR1基因多态性检测的引物组合物、试剂盒和方法。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：本发明的目的之一在于提出了一种巴氯芬药物相关基因GABBR1基因多态性检测的引物组合物，包括多态性检测引物和内控基因检测引物，其中，所述多态性检测引物包括序列如下的引物组分：多态性检测引物一：5′-GGATGGGAAATCAAAGCAG-3′；多态性检测引物二：5′-GATGGGAAATCAAAGCGC-3′；多态性检测引物三：5′-CAGATCCAACTCCACCT-3′；所述内控基因检测引物包括序列如下的引物组分：内控引物一：5’-AGCAAGCAGGAGTATGACG-3'；内控引物二：5'-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3'。优选的，引物组合物的检测对象为新鲜血液等样本的GABBR1基因。本发明的目的之二在于提出了一种巴氯芬药物相关基因GABBR1基因多态性检测试剂盒，其特征在于，包括装有多态性检测引物和内控基因检测引物的试管，其中，所述多态性检测引物包括序列如下的引物组分：多态性检测引物一：5′-GGATGGGAAATCAAAGCAG-3′；多态性检测引物二：5′-GATGGGAAATCAAAGCGC-3′；多态性检测引物三：5′-CAGATCCAACTCCACCT-3′；所述内控基因检测引物包括序列如下的引物组分：内控引物一：5’-AGCAAGCAGGAGTATGACG-3'；内控引物二：5'-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3'。在一种优选的实施方式中，所述的试剂盒还包括分别采用试管分装的蒸馏水、PCR反应预混液、阳性质控GABBR1基因rs29220突变质粒和阳性质控GABBR1基因rs29220野生质粒。在一种更优选的实施方式中，所述的阳性质控GABBR1基因rs29220突变质粒通过以下方法获得：采用PCR技术，获取GABBR1基因rs29220位点的突变型片段，然后，将突变型片段与pEASY-BluntCloningKit载体连接，转化，再转入大肠杆菌感受态细胞培养，最后，提取质粒，即得到。在一种更优选的实施方式中，所述的阳性质控GABBR1基因rs29220野生质粒通过以下方法获得：采用PCR技术，获取GABBR1基因rs29220位点的野生型片段，然后，将野生型片段与pEASY-BluntCloningKit载体连接，转化，再转入大肠杆菌感受态细胞培养，最后，提取质粒，即得到。在一种更优选的实施方式中，所述的试剂盒采用挡板分隔为两个独立腔体，每个腔体中安装有海绵，在海绵上还加工有用于放置试管的容器孔，所述试剂盒的两个腔体中，其中一个腔体中放置装有蒸馏水与PCR反应预混液的试管，另一个腔体中放置装有各阳性质控质粒、多态性检测引物和内控基因检测引物的试管。在一种更进一步优选的实施方式中，所述的容器孔在试剂盒内平行排列布置。本发明在具体检测过程中，即利用ARMS-PCR方法，如果引物的3′端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计引物(见引物设计)，其3′端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。本发明的目的之三在于提出了一种巴氯芬药物相关基因GABBR1基因多态性检测的方法，具体涉及GABBR1基因rs29220点突变的检出，具体步骤为：(1)样本处理和核酸提取利用商品化的DNA提取试剂盒处理样本，所提DNA需用紫外分光光度计测定浓度和纯度，其DNAOD260/OD280的值应在1.8～2.0，浓度应在5～50ng/μL之间，样本DNA质量不合格者不得用于检测，建议低于5ng/μL者重新进行核酸提取，高于50ng/μL者予以适当稀释至规定的浓度范围，提取完的DNA建议立即进行检测，否则请于-20℃以下保存，保存时间不要超过6个月。试剂盒质控品使用前室温融化，涡旋振荡10秒，2000rpm离心15秒待用。(2)PCR反应体系的构建：提前30分钟将各试剂取出，室温融化，涡旋振荡10s，2000rpm离心15秒待用，然后，将PCR反应预混液、对应引物和水混合均匀后配制得到对应检测位点的反应混合液，然后将其置于PCR反应管中。(3)然后将已处理样本、阳性质控品和阴性质控品加入PCR反应管中，盖紧管盖(避免气泡产生)，离心后将管壁上液体全部甩至管底，然后立即进行PCR扩增反应。(4)设置PCR扩增反应程序，其依次分为预变性、变性和退火、信号采集三个阶段，其中，预变性阶段的温度设置为95℃，处理时间为15min，循环次数为1次，变性阶段为在95℃下处理10s，退火、信号采集阶段则在60℃下保持30s，且变性与信号采集阶段循环40次。(5)利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列，通过SYBRGreen染料和扩增产物的杂交，检测反应体系的SYBR荧光强度来判定检测结果。SYBR为检测信号，以SYBR信号达到设定的阈值所需的的循环次数Ct值作为判断标准，Ct值小于32为阳性，Ct值大于35为阴性，Ct值介于32到35之间为弱阳性。与现有技术相比，本发明具有以下特点：(1)本发明提出了一种用于检测新鲜血液等样本中GABBR1基因突变的具有特异性的引物组合物，其在检测GABBR1基因RS29220突变时具有敏感性高、特异性强、耗时短等优点。(2)本发明的试剂盒结构设计简单，使用方便，分区设计使得检测过程不易受污染，检测结果更为精确。(3)检测方法耗时短，敏感性高、特异性强。附图说明图1为本发明的试剂盒的结构示意图；图2为本发明的检测结果图；图中标记说明：1-盒体，2-海绵，3-挡板，4-装有蒸馏水的试管，5-装有PCR反应预混液的试管，6-装有阳性质控GABBR1基因RS29220突变质粒的试管，7-装有阳性质控GABBR1基因RS29220野生质粒的试管，8-装有内控基因检测引物的试管，9-装有GABBR1基因检测引物的试管，10-容器孔。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。1、各多态性检测引物与内控基因检测引物均是由公司技术人员设计，再采用常见生工技术合成并保存；2、PCR反应预混液采用天根生化科技(北京)有限公司售出的产品；3、阳性质控GABBR1基因RS29220突变质粒和野生质粒的构建方法分别为：利用PCR技术，获得GABBR1基因RS29220位点的野生型和突变型片段，片段长度为200-300bp。将该片段与pEASY-BluntCloningKit载体连接(全世金CB101)后，通过常用的转化技术，转入大肠杆菌感受态细胞Trans5αChemicallyCompetentCell(全世金CD201-01)培养，利用天根生化科技有限公司质粒提取试剂盒(天根，DP105)提取质粒，质粒浓度为(50-100ng/ul)。4、以下实施例中所采用的样本类型为血液。实施例1一种巴氯芬药物相关基因GABBR1基因多态性检测的引物组合物，包括分别如表1和表2所示的多态性检测引物与内控基因检测引物。表1GABBR1基因多态性检测引物引物名称碱基序列(5′→3′方向)P1-FW(多态性检测引物一)5′-GGATGGGAAATCAAAGCAG-3′P1-FS(多态性检测引物二)5′-GATGGGAAATCAAAGCGC-3′P1-R(多态性检测引物三)5′-CAGATCCAACTCCACCT-3′表2内控基因检测引物引物名称碱基序列(5′→3′方向)CF(内控引物一)5’-AGCAAGCAGGAGTATGACG-3'CR(内控引物二)5'-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3'实施例2如图1所示，一种装有实施例所述多态性检测引物与内控基因检测引物的试剂盒，包括：带盒盖的盒体1、挡板3、两个海绵2、两个装有蒸馏水的试管4、两个装有PCR反应预混液的试管5、一个装有阳性质控GABBR1基因RS29220突变质粒试管6、一个装有阳性质控GABBR1基因RS29220野生质粒试管7、两个装有内控基因检测引物的试管8、三个装有GABBR1基因检测引物的试管9。其中，挡板3置于盒体1内，将盒体1分成两个部分，两个海绵2分别置于挡板3两侧的盒体1内，在海绵2上打有容器孔10，两个装有蒸馏水的试管4、两个装有PCR反应预混液的试管5置于挡板3一侧海绵2的容器孔10内，一个装有阳性质控GABBR1基因RS29220突变质粒试管6、一个装有阳性质控GABBR1基因RS29220野生质粒试管7、两个装有内控基因检测引物的试管8和三个装有GABBR1基因检测引物的试管9置于挡板3另一侧海绵2的容器孔10内。本实施例中，GABBR1基因检测引物即指多态性检测引物。此外，海绵2上的容器孔10可以采用平行排列布置，每排可以任意布置两到四个。实施例3上述实施例2中的试剂盒的操作方法为：(1)样本处理和核酸提取利用商品化的DNA提取试剂盒处理样本，所提DNA需用紫外分光光度计测定浓度和纯度，其DNAOD260/OD280的值应在1.8～2.0，浓度应在5～50ng/μL之间，样本DNA质量不合格者不得用于检测，建议低于5ng/μL者重新进行核酸提取，高于50ng/μL者予以适当稀释至规定的浓度范围，提取完的DNA建议立即进行检测，否则请于-20℃以下保存，保存时间不要超过6个月。试剂盒质控品(即各种质粒)使用前室温融化，涡旋振荡10秒，2000rpm离心15秒待用。(2)试剂配置(2.1)配置说明：检测反应设置内控检测、阴性质控品检测和阳性质控品检测，其中，内控的作用是：检测样本合格与否，此位点为保守位点，作为内控，检测样本合格与否；阳性质控：此位点为突变、野生质粒，检测反应条件合格与否，合格情况下，阳性质控显示存在表达；阴性：检测反应有无污染。(2.2)配置过程提前30分钟将试剂取出，室温融化，涡旋振荡10秒，2000rpm离心15秒待用。确定每个检测位点反应数N和内控检测数M，N＝待检样本数(n)+质控品数(2)+1，M＝待检样本数(n)+1。计算加到反应混合物中的各个试剂的量，计算如下表3。表3PCR反应体系配制表试剂检测位点PCR反应液P引物混合液纯化水反应液1(μL)GABBR1-C12.5*N2.0*N8.5*N反应液2(μL)GABBR1-G12.5*N2.0*N8.5*N反应液3(μL)内控12.5*M2.0*M8.5*M各引物的用量相等，其浓度为300nM。取3个灭菌离心管配置上述3个反应体系，试剂全部加入后涡旋振荡10秒，2000rpm离心15秒。然后将上述混合反应液以23μL/管分装至各PCR反应管中(无菌和RNase-Free)。(3)加样表4样品及质控品上样表名称成分加样量待检样本样本DNA2μLSTD1阳性质控品P1(即突变质粒)2μLSTD2阳性质控品P2(即野生质粒)2μLNTC阴性质控品P3(即水)2μL注：STD代表阳性质控品；NTC代表阴性质控品。根据表4提示的上样比例，将已处理样本、阳性质控品P1、阳性质控品P2和阴性质控品P3加入反应管中，内控引物只需检测样本DNA即可，盖紧管盖(避免气泡产生)，2000rpm离心15秒将管壁上的液体全部甩至管底，然后立即进行PCR扩增反应。(4)PCR扩增程序设置表5PCR反应程序的设定(5)检验结果的解读利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列，通过SYBRGreen染料和扩增产物的杂交，检测反应体系的SYBR荧光强度来判定检测结果(所得结果参见图2所示)。SYBR为检测信号，以SYBR信号达到设定的阈值所需的的循环次数Ct值作为判断标准，Ct值小于32为阳性，Ct值大于35为阴性，Ct值介于32到35之间为弱阳性。SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBRGreenI发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBRGreenI的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量，进而可以判断位点的突变情况。(具体可参见天根公司生产的快速荧光定量PCR预混试剂的使用方法)实施例4将已知基因GARRB1rs29220突变的样本按照实施例3的方法流程进行检测，所得结果如图2所示。可见，本发明所提供的试剂盒具有较好的检出rs29220突变的能力。上述的对实施例的描述是为便于该
技术领域：
的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3