一种南美白对虾病毒DNA提取方法与流程

本发明涉及dna提取技术领域，具体为一种南美白对虾病毒dna提取方法。

背景技术：

南美白对虾，学名东方南美白对虾，又称中国南美白对虾、斑节虾。节肢动物门，软甲纲，十足目，南美白对虾科，南美白对虾属。南美白对虾属个体大，通称大虾。

南美白对虾的雌性成长个体体长一般16-22厘米，重约50-80克，最大的可达30厘米，重250克;雄性较小，体长13-18厘米，重30-50克。南美白对虾为广温广盐性海产动物。牤牛岛南美白对虾体呈长筒形，左右侧扁，身体分为头、胸和腹部，由20个体节组成。腹部较长，肌肉发达，分节明显；南美白对虾可分定居型(如日本南美白对虾、宽沟南美白对虾、欧洲南美白对虾、渤海南美白对虾等)和洄游型(如中国南美白对虾、墨吉南美白对虾、长毛南美白对虾)，前一类栖于沿岸浅海，白昼常潜入沙底内，不作大范围的移动;后一类栖于河口沿岸混浊海域，常作大范围的移动和洄游。南美白对虾主要以底栖无脊椎动物为食，如多毛类、小型甲壳类和双壳类软体动物等，有时也捕浮游动物。

dna病毒是生物病毒的一种，属于一级病毒。dna病毒广泛存在于人、脊椎动物、昆虫体内以及多种传代细胞系中，每种病毒只能感染一种动物(个别例外)，仅少数致病。

dna病毒的繁殖方式是复制，繁殖过程是吸附(病毒粒子借衣壳上的受体与宿主细胞"粘附"在一起，否则，病毒粒子将不能侵入宿主细胞。

目前，南美白对虾中病毒dna提取步骤复杂，操作繁琐，成本高，而且提取精度低，因此有必要进行改进。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种南美白对虾病毒dna提取方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种南美白对虾病毒dna提取方法,包括以下步骤：

a、样品前处理；

b、dna提取；

c、dna沉淀：取200μl上清液移至一新灭菌ep管中，加入100微升10mol/l乙酸铵，混匀后，加入600μl预冷无水乙醇混匀，-20℃放置20min。12000rpm，4℃离心15min，弃上清液；

d、dna纯化：用75%乙醇洗涤沉淀2次，每次12000rpm离心1min，小心弃去上清液，最后沉淀于室温晾干10min；

e、dna溶解与保存：沉淀晾干后加入100微升te缓冲液溶解dna用于pcr扩增或者保存于-20℃备用。

优选的，所述步骤a中样品前处理步骤如下：

a、将50mg-100mg的样品装入ep管中，用一次性研磨棒研碎后加入1ml75%酒精，12000rpm，4℃离心5min，弃去上清液；

b、重复步骤a一次；

c、在ep管中加入1mlte缓冲液，振荡混匀后，12000rpm，4℃离心5min，弃去上清液；

d、重复步骤c一次。

优选的，所述步骤b包括以下步骤：

a、细胞裂解：

a、处理后的样品中加入抽提缓冲液500μl，85℃温浴10min;

b、加入2.5微升20mg/ml蛋白酶k，至终浓度100微克/ml，混匀后55℃水浴1h，不时旋动;

b、dna分离：

a、将溶液冷却至室温，加入500μl酚/氯仿/异戊醇，颠倒混合2min，于1200rpm,4℃离心5min；

b、取离心后的上层水相300μl于1新的ep管中，加入200微升te缓冲液和500μl酚/氯仿/异戊醇混合液，混合颠倒2min，于1200rpm,4℃离心2min；

c、取离心后的上层水相300μl，加入200微升te缓冲液和500μl氯仿/异戊醇，颠倒混合2min，于1200rpm,4℃离心2min。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.本发明采用的提取方法操作简单，成本低，提取精度高，提取纯度高；其中，本发明采用的样品前处理步骤，能够有效的清除样品中的杂质离子，避免了杂质对提取精度的影响；采用的dna提取步骤中采用细胞裂解和dna分离，能够进一步提高了提取效率。

2.对于开展南美白对虾dna病毒的基础性研究、dna疾病的发病机理和预防具有重要作用。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供如下技术方案：一种南美白对虾病毒dna提取方法,包括以下步骤：

a、样品前处理；

b、dna提取；

c、dna沉淀：取200μl上清液移至一新灭菌ep管中，加入100微升10mol/l乙酸铵，混匀后，加入600μl预冷无水乙醇混匀，-20℃放置20min。12000rpm，4℃离心15min，弃上清液；

d、dna纯化：用75%乙醇洗涤沉淀2次，每次12000rpm离心1min，小心弃去上清液，最后沉淀于室温晾干10min；

e、dna溶解与保存：沉淀晾干后加入100微升te缓冲液溶解dna用于pcr扩增或者保存于-20℃备用。

本发明中，步骤a中样品前处理步骤如下：

a、将50mg-100mg的样品装入ep管中，用一次性研磨棒研碎后加入1ml75%酒精，12000rpm，4℃离心5min，弃去上清液；

b、重复步骤a一次；

c、在ep管中加入1mlte缓冲液，振荡混匀后，12000rpm，4℃离心5min，弃去上清液；

d、重复步骤c一次。

本发明中，步骤b包括以下步骤：

a、细胞裂解：

a、处理后的样品中加入抽提缓冲液500μl，85℃温浴10min;

b、加入2.5微升20mg/ml蛋白酶k，至终浓度100微克/ml，混匀后55℃水浴1h，不时旋动;

b、dna分离：

a、将溶液冷却至室温，加入500μl酚/氯仿/异戊醇，颠倒混合2min，于1200rpm,4℃离心5min；

b、取离心后的上层水相300μl于1新的ep管中，加入200微升te缓冲液和500μl酚/氯仿/异戊醇混合液，混合颠倒2min，于1200rpm,4℃离心2min；

c、取离心后的上层水相300μl，加入200微升te缓冲液和500μl氯仿/异戊醇，颠倒混合2min，于1200rpm,4℃离心2min。

将提取后的病毒dna放入高倍显微镜中，我们可以清楚的观察到该病毒dna的状态，实施例达到该专利的预期效果。

综上所述，本发明采用的提取方法操作简单，成本低，提取精度高，提取纯度高；其中，本发明采用的样品前处理步骤，能够有效的清除样品中的杂质离子，避免了杂质对提取精度的影响；采用的dna提取步骤中采用细胞裂解和dna分离，能够进一步提高了提取效率。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。