本发明涉及一种快速检测人hla-b*5801基因的pcr的试剂盒，以及检测人hla-b*5801基因的方法，属基因诊断领域。(二)
背景技术：
：别嘌呤醇是一种次黄嘌呤氧化酶抑制剂，能够减少尿酸合成并降低血中尿酸浓度，是治疗痛风的首选药物。临床用于治疗：高尿酸血症；慢性痛风患者；痛风石尿酸性肾结石或尿酸性肾病。但该药易引起严重的皮肤不良反应，包括较轻微的药疹，及严重的剥落性皮炎、中毒性表皮坏死松解症等，有较高的致死率。人类白细胞抗原(hla)是1组位于第6号染色体上的基因，是迄今已知基因中等位基因多态性最高的基因复合体，是人类最复杂的遗传多态系统，其分布存在明显的种群特性。1989年，chan等首次报道了hla与别嘌呤醇引起不良反应相关性的研究，结果显示中国南方人群中，a*33和b*58为此类不良反应的高风险因素。2005年，hung等进一步发现别嘌呤醇引起严重皮肤不良反应的患者中全部携带b*5801位点，而在未出现不良反应的患者中其携带率仅10％。由于中国汉族人、泰国人、韩国人的hla-b*5801基因阳性率远高于白人(高达15％)，因此以上人种使用别嘌呤醇药物前需检测hla-b*5801基因是否携带，避免患者误用别嘌呤醇而诱发严重副反应的风险。目前用于hla-b*5801基因检测的方法主要有以下几种：(1)pcr-sbt法:即直接测序法；其可直接获得dna序列，鉴定所有存在的多态性，为最直接、最直观的方法；但是，由于目的基因序列的特殊性、引物设计等多种因素，测序结果会出现套峰，不利于结果的判读，使得pcr-sbt法存在着模棱两可的结果，必要时需要人工判读碱基序列(adamsetal.,2004)，且测序技术需要用到造价昂贵的测序仪，医院内通常不会配备；(2)pcr-ssp法:即序列特异性引物法；其根据各等位基因的核苷酸序列，设计出一套针对每一等位基因特异性的或组特异性的引物，此即为序列特异性引物；所述ssp只能与某一等位基因特异性片段的碱基序列互补性结合，通过pcr特异性地扩增该基因片段，从而达到分析基因多态性的目的；所述pcr-ssp法也是临床上使用最普及的方法。但此种方法操作复杂，耗时较长，且易发生污染，每批次操作差异较大，无法进行稳定快速的批量化操作。(三)技术实现要素：针对上述问题，本发明提供了一种快速检测人hla-b*5801基因型的试剂盒及方法。本发明采用的技术方案是：一种人hla-b*5801基因型的试剂盒，所述试剂盒由通用引物、通用荧光探针和连接探针，以及连接反应及聚合反应试剂(酶buffer、dntp等)，酶混合液，阴性对照和阳性对照组成；所述通用引物序列如下：上游引物：5’-gactccaatcgagcatgcaaac-3’下游引物：5’-ttcggaactattgtcatggtccaa-3’通用荧光探针序列如下：5’-fam-ctgctggacccagcaccgtacca-bhq1-3’；连接探针1序列如下：5’-gactccaatcgagcatgcaaacctgctggacccagcaccgtaccaacggggagacacggaa-3’；连接探针2序列如下：5’-catgaaggcctccgcgttggaccatgacaatagttccgaa-3’。本发明试剂盒是利用连接酶要求连接切口高度互补配对的特性，通过连接酶连接反应来实现对于单核苷酸多态性或基因位点突变的检测，要点如下：1.首先找出hla-b*5801基因型特异性位点，设计对应的2条连接探针，分别位于特异性位点的两侧，形成一个和样本dna完全互补配对且带有一个缺口的组合体。2.为了检测到连接后的产物，需要设计通用引物和探针，通用引物为2条，分别加在连接探针的5’端，一条为完全一样的序列，另一条为和通用引物互补序列。荧光探针可加在通用引物和连接探针之间，探针可设计在左侧连接探针上也可放在右侧连接探针上。3.通用引物和通用荧光探针为人工设计，不和任何基因组匹配，因此不受临床样本dna干扰，扩增检测效率更高。4.需要先对样本dna进行高温变性使其快速充分解链，随后需要快速置于冰上骤冷，以防止其继续复性形成双链。本发明还涉及一种人hla-b*5801基因型的检测方法，所述方法包括：(1)样本dna纯化及预处理：纯化后样本dna经过95℃高温处理5min后立即于冰上放置；(2)pcr反应体系配置：在无dna酶的离心管中按以下配方配置反应体系：连接聚合酶检测反应液15μl，酶混合液3μl，混匀后加入八联管，加入样本4μl；所述连接聚合酶检测反应液由连接探针、通用引物、通用荧光探针、酶buffer、dntp配制而成；所述通用引物序列如下：上游引物：5’-gactccaatcgagcatgcaaac-3’下游引物：5’-ttcggaactattgtcatggtccaa-3’通用荧光探针序列如下：5’-fam-ctgctggacccagcaccgtacca-bhq1-3’；连接探针1序列如下：5’-gactccaatcgagcatgcaaacctgctggacccagcaccgtaccaacggggagacacggaa-3’；连接探针2序列如下：5’-catgaaggcctccgcgttggaccatgacaatagttccgaa-3’；(3)检测：设置反应程序为：连接温度50℃～60℃，时间20分钟；以下程序循环40次，热启动：温度95℃，时间5分钟，以下程序循环40次，预变性：温度94℃，时间15秒，一步退火延伸：温度62℃，时间30秒(收集荧光)；(4)结果分析：分析反应体系内fam是否产生荧光信号，且要求荧光信号呈s型曲线，若都呈s型曲线则该样本为hla-b*5801基因阳性；若没有检测信号，则判断为非hla-b*5801基因型。所述酶混合液中，所用连接酶为耐热性，可耐受90℃以上高温，用量为1u～3u，聚合酶为化学修饰或抗体修饰的特启动酶，用量为1u～5u。步骤(3)中连接温度优选为56℃。本发明是通过一种新型的连接酶反应结合聚合酶反应在同一体系中对样本hla-b*5801基因型进行分型检测，由于hla等位基因数量巨大且相似性较高，尤其hla-b等位基因与hla-b*5801具有90％以上的同源性，因此如何确保检测结果的特异性十分重要。本发明最大的优势是特异性非常强，一旦连接探针出现错配情况，该反应将会立即终止，没有任何噪音的干扰，结果精确定位相关基因型，为临床解决快速准确的基因分型检测方法及试剂盒。本发明的有益效果主要体现在：1)简单快捷，节省时间，高通量本发明连接酶和聚合酶在同一反应体系中，可大量节约时间及耗材，检测程序约70分钟，整个实验可在100分钟内完成。单次实验理论上可检测94份样本，满足高通量大规模检测的要求。2)特异性好基于连接酶反应的dna模板生成，其连接反应高度特异，一旦有错配，反应立即终止，不产生任何背景信号，使得单核苷酸多态性位点准确分析。3)安全无污染且成本低实验消耗仅试剂盒及八联管，且实验完成后样本无需开盖直接废弃，避免了可能的气溶胶泄露，且体系本身不含有任何对人体有毒害作用的成分，安全无污染。(四)附图说明图1为本发明方法原理示意图，为连接探针、通用引物、荧光探针和样本dna完全匹配的情况；图2为本发明方法原理示意图，为连接探针、通用引物、荧光探针和样本dna不匹配的情况；图3为hla-b*5801基因型阳性检测结果；图4为hla-b*5801基因型阴性检测结果；图5为阳性对照检测结果；图6为阴性对照检测结果。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：实施例1：快速检测人hla-b*5801基因型的试剂盒的主要组成配件如下：通用引物、通用荧光探针及连接探针序列如下：上述将设计好的引物探针序列交给合成公司，采用dna合成仪合成，经hplc纯化后出具合成检验合格报告。序列为本发明提供的序列，但不限于本发明所使用序列。上述通用荧光探针为荧光双标记探针，在5’端标记fam荧光，3’端标记bhq1萃灭荧光素。上述的连接酶用量为每人份1u，聚合酶用量为每人份2u，dntp的用量为0.4mmol/l。本试剂盒不包含dna提取试剂，需要采购商品化提取试剂。本发明主要原料采购的供应商信息如下：原料名称厂商规格连接探针上海生工生物工程有限公司5od/管通用引物上海生工生物工程有限公司5od/管通用荧光探针上海生工生物工程有限公司5od/管连接酶newenglandbiolabs1000u/管聚合酶宝生物工程(大连)有限公司5u/uldntp宝生物工程(大连)有限公司100mm/管本试剂盒荧光pcr试剂盒检测方法如下：i.第一步：样本dna纯化取edta抗凝外周血200微升，通过商品化的外周血基因组核酸纯化试剂盒进行基因组dna的提取，阴性对照和阳性对照品无需处理，可直接参与反应。ii.第二步：pcr反应体系配置从试剂盒中取出连接及聚合反应混合液，室温融化后混匀离心备用，取出酶混合液，按照每人份13微升连接及聚合反应混合液加入微升的酶混合液进行配制，分装入0.2ml的pcr薄壁管中，分别加入4微升的样本dna、阴性对照、阳性对照。iii.第三步：上机检测温度循环及荧光信号收集时间如下：设置反应程序为：连接温度56℃，时间20分钟；以下程序循环40次，热启动：温度95℃，时间5分钟，以下程序循环40次，预变性：温度94℃，时间15秒，一步退火延伸：温度62℃，时间30秒(收集fam通道荧光)。iv.第四步：结果分析质量控制：试剂盒阴性对照应当无信号值，阳性对照有信号，确保质控品正常情况下，分析临床样本结果。当样本检测ct值小于38时，可判定检测结果为阳性，该样本基因型为hla-b*5801，当样本检测ct值大于38且小于40时，样本dna质量存在问题，建议重新取样提取dna后再次测试。当样本检测无ct值，可判定该样本为非hla-b*5801。图1～图2为本发明方法原理示意图，其中图1为连接探针、通用引物、荧光探针和样本dna完全匹配的情况，如图所示，如果连接探针和样本dna序列完全匹配互补，则可进行连接反应生产连接产物，可用于荧光pcr的检测；图2为连接探针、通用引物、荧光探针和样本dna不匹配的情况，如图所示，如果连接探针和样本dna序列不匹配互补，则连接反应立即终止，无法形成有效的连接产物用于荧光pcr的检测。图3为样本检测结果，s型信号曲线显示hla-b*5801基因型为阳性结果；图4为样本检测结果，无s型信号曲线显示hla-b*5801基因型为阴性结果；图5为试剂盒的阳性对照品检测结果；图6为试剂盒阴性对照品检测结果。序列表<110>杭州泰领生物技术有限公司<120>一种人hla-b*5801基因型的试剂盒及方法<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>22<212>dna<213>未知(unknown)<400>1gactccaatcgagcatgcaaac22<210>2<211>24<212>dna<213>未知(unknown)<400>2ttcggaactattgtcatggtccaa24<210>3<211>23<212>dna<213>未知(unknown)<400>3ctgctggacccagcaccgtacca23<210>4<211>61<212>dna<213>未知(unknown)<400>4gactccaatcgagcatgcaaacctgctggacccagcaccgtaccaacggggagacacgga60a61<210>5<211>40<212>dna<213>未知(unknown)<400>5catgaaggcctccgcgttggaccatgacaatagttccgaa40当前第1页12