本发明属于基因工程技术领域，基体涉及一种经α-磷-硒修饰的sirna及其制备方法和应用。
背景技术：
结肠直肠癌(colorectalcancer)是胃肠道中常见的恶性肿瘤，早期症状不明显，随着癌肿的增大而表现排便习惯改变、便血、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛等症状，晚期则表现贫血、体重减轻等全身症状。其发病率和病死率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌，严重危胁人类的身心健康，在癌症中的发病率约为9.7％。
肿瘤细胞的浸润性受肿瘤—基质相互作用的调控，在结直肠癌中，arp2/3复合体在基质细胞附近表达，它的形成提高了基质细胞与成瘤细胞之间的运动性，进而为这两种细胞的浸润性提供更适合的环境。
肌动蛋白相关蛋白2/3复合体是细胞骨架的重要组成部分，能够促进新微丝核化，广泛参与细胞形状的维持、细胞运动、胞质分裂和细胞移动等功能，arpc4与arpc2构成该复合体的中心，在该复合体的生物学功能上扮演重要角色。在胰腺癌，结直肠癌等多种癌细胞中异常高表达。arpc4是arp2/3复合体的组成亚基之一，它具有控制肌动蛋白(actin)在细胞内的成核过程，与下游基因产生融合蛋白以及影响胰腺癌细胞的迁移等作用。但目前未见采用sirna沉默sw620细胞系中的arpc4基因来抑制其迁移的相关报道。
技术实现要素：
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种经α-磷-硒修饰的sirna及其制备方法和应用，通过本发明方法，制备得到一种α-磷-硒修饰的sirna可有效的抑制sw620细胞中arpc4基因的表达。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种经α-磷-硒修饰的sirna，是通过对seqidno.1和seqidno.2所示序列的磷酸骨架进行修饰后得到的，其修饰位点为atp、ctp、gtp或utp。
进一步地，该sirna是由seqidno.1和seqidno.2所示的双链分子经α-磷-硒修饰ctp后得到的，其基因序列如下所示：
sirna-antisense：5＇-gguaugauausecagsecuuusecuuu-3＇；
sirna-sense：3＇-agaaagsecugauausecauasecsecuu-5＇；
其化学结构式为：
一种α-磷-硒修饰的sirna的制备方法，包括以下步骤：
(1)将胞嘧啶核苷、焦磷酸三丁基铵和3h-1,2-benzothiaselenol-3-one抽滤干燥1～5h后备用；
(2)用体积比为0.5～1:1～2的dmf和三丁胺的混合溶液溶解焦磷酸三丁基铵，形成焦磷酸盐溶液；然后将溶解有无水2-氯-4h-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮的dmf加入焦磷酸盐溶液中混合；在氩气环境下，于室温搅拌60分钟，然后加入溶解有由胞嘧啶核苷转化的尿苷的dmf；继续搅拌，反应1h后，加入溶解有3h-1,2-benzothiaselenol-3-one的1,4-二氧六环，于室温下反应1小时；其中，无水2-氯-4h-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮与焦磷酸三丁基铵的摩尔比为0.5～1:0.5～1；胞嘧啶核苷、焦磷酸三丁基铵以及3h-1,2-benzothiaselenol-3-one的摩尔比为0.5～1:1～2:1～2；
(3)然后向步骤(2)所得产物加入水中，在室温下水解2小时，然后在2mm的二硫苏糖醇的环境下依次采用nacl-乙醇方法进行沉淀，于-80℃下冷冻沉淀后的溶液20分钟，然后在室温、14000rpm的转速下离心10分钟，收集沉淀并溶解，然后重复上述离心条件再次沉淀，最后将沉淀重新溶解在水中，冻干，得α-磷-硒修饰的ctpαse，再通过hplc进行纯化，备用；
其中，ctpαse合成原理如下：
(4)对步骤(3)所得物进行转录合成，再加入0.1～0.5u/μl不含核糖核酸酶的dnaasei，于37℃水浴2h，得α-磷-硒修饰的sirna。
进一步地，步骤(1)中胞嘧啶核苷、焦磷酸三丁基铵以及3h-1,2-benzothiaselenol-3-one的摩尔比为1:2:2。
进一步地，步骤(2)中无水2-氯-4h-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮与焦磷酸三丁基铵的摩尔比为1:1。
进一步地，步骤(4)中转录过程的反应体系包括：atp10mm、gtp10mm、utp10mm、t7rnapolymerasemix10％、模板2μm、ctpαse5mm以及占反应体积10％的10×反应缓冲液。
上述经α-磷-硒修饰的sirna在制备抑制人结直肠癌细胞迁移药物中的应用。
进一步地，该sirna是通过沉默arpc4基因来达到抑制抑制人结直肠癌细胞迁移的目的。
本发明的有益效果为：
本发明可通过一锅合成方法快速合成ctpαse，合成方法简便，节省时间，产率高。并能通过体外转录方法大量制备α-磷-硒修饰sirna；它在生物体内较为稳定，可沉默sw620细胞中arpc4基因的表达，以达到抑制sw620细胞的增殖和迁移的目的。
附图说明
图1为ctpαse的纯化分析图谱；其中，图1a为反相高效液相色谱纯化图；图1b为hr-ms质谱图；
图2为稀释后的四种sirna的琼脂糖凝胶电泳分析图；
图3为sirna对arpc4蛋白在sw620细胞中表达的影响的检测结果图；其中，a为转染72h后arpc4表达量检测图；b为转染96h后arpc4表达量检测图；c为westernblot条带灰度值分析图(相对于β-actin)；d为反转录pcr条带灰度值分析图(相对于gapdh)；
图4为sirna转染后的sw620细胞96h后，对其侵袭能力影响的检测结果图；其中，图4a为10×物镜下穿膜实验细胞照片；图4b为细胞穿膜数统计；
图5为sirna转染96h后侵袭正相关蛋白(iqgap1andvimentin)表达量的检测图；其中，a为iqgap1表达量检测图；b为vimetin表达量检测图；c为westernblot条带灰度值分析iqgap1表达水平；d为westernblot条带灰度值分析vimentin表达水平。
图6为cck-8实验检测se-sirna对细胞增殖活性的影响。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例
1、α-磷-硒修饰的三磷酸胞苷(ctpαse)的合成
(1)分别将0.2mmol，49mg的单体胞嘧啶核苷、0.4mmol，189g的焦磷酸三丁基铵和0.4mmol，87mg的3h-1,2-benzothiaselenol-3-one(btse)置于不同的烧瓶中，用油泵高真空抽滤干燥1小时以上，备用；
(2)用0.3ml的dmf和0.6ml的三丁胺的混合溶液溶解干燥后的焦磷酸三丁基铵，形成焦磷酸盐溶液；然后将0.6ml，溶解有0.4mmol，81mg无水2-氯-4h-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮的dmf加入焦磷酸盐溶液中混合；在氩气保护环境下，于室温搅拌60分钟，然后加入0.3ml溶解有由胞嘧啶核苷转化的尿苷的dmf，保持该核苷磷酸化反应在氩气保护和室温下搅拌反应1h后，加入0.5ml溶解有btse的1,4-二氧六环，于室温下反应1小时；
(3)向步骤(2)所得产物中加入6ml水(约为反应溶液体积的两倍的量)在室温下水解2小时，然后在2mm的新鲜二硫苏糖醇的环境下依次采用0.9ml，3m的nacl和30ml乙醇进行沉淀，并于-80℃下冷冻沉淀后的溶液20分钟，然后在室温、14000rpm的转速下离心10min，收集沉淀物，然后用500μl将其溶解，再重复上述离心过程，再次沉淀，最后将沉淀重新溶解在少量水(200μl)中，在冷冻干燥器中迅速冻干，制备得到ctpαse粗品。
其中，ctpαse的合成原理如下：
2、ctpαse的纯化分析
(1)利用反相高效液相色谱(rp-hplc)，使用ultimatexb-c18hplc柱(10μm，30×250mm，welch)纯化粗产物，其具体过程如下：
使用95％缓冲液a(20mm三乙胺乙酸盐(teaac)，ph6.6)和5％缓冲液b至20％缓冲液b(50％乙腈水溶液，20mmteaac，ph6.6)的线性梯度洗脱样品(流量15ml/min)40分钟，由于se的引入，使得α-磷原子成为手性原子，由此，ctpαse具有两种非对映异构体sp-ctpαse(ctpαsei)和rp-ctpαse(ctpαseii)(图1a)；
hplc纯化即可分别收集不同非对映异构体，将纯化的ctpαse非对映异构体冻干并重新溶解于少量含有10mm三(羟甲基)氨基甲烷/hcl(tris-hcl，ph7.5)和20mmdtt的溶液中，储存在-80℃环境中；
合成的ctpαse通过rp-hplc和hr-ms分析；其中，ctpαse通过ultimatexb-c18柱(5μm，4.6×250mm，welch)在95％缓冲液a和5％缓冲液b至26％缓冲液b的线性梯度下于21分钟出峰(1ml/min)；其结果分别见图1a和图1b；如图1a所示，图中1表示nativectp；2表示ctpαsei；3表示ctpαseii；如图1b所示，ctpαsei(分子式：c9h15n3o13p3se-；calculatedmass(e-):545.8988；measuredmass:545.8932)(ctpαseii质谱数据与ctpαsei一致)。
3、体外转录合成α-磷-硒修饰的sirna(pse-sirna)
使用hiscribet7高产量rna合成试剂盒(neb)转录合成硒代胞嘧啶sirna(se-arpc4)、天然sirna(arpc4)、硒代胞嘧啶非特异性对照sirna(se-nc)和天然非特异性对照sirna(nc)，37℃水浴孵育8小时，再加入dnaasei(不含核糖核酸酶，0.1u/μl，neb)，37℃水浴2h，终止反应，并消化dna模板，合成的sirna序列见表1，其反应体系如下：
atp(10mm)，gtp(10mm)，utp(10mm)，t7rna聚合酶混合物，模板(temarpc1，2和temarpc3，4分别用于合成nat-sirna和se-c-sirna；temnc1，2和temnc3，4分别用于合成nat-nc和sec-nc)和ctp(10mm天然ctp用于合成nat-sirna和nat-nc；5mmctpαsei用于合成se-c-sirna和se-c-nc)。
表1sirna序列
其中，psec-sirna的化学结构式为：
4、pse-sirna的纯化和定量
向未经纯化粗产物中加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，混合后在10，000rpm的条件下，4℃离心2分钟，将上层水相与0.1倍体积的3m氯化钠和3倍体积乙醇混合后，在-80℃下静置15min，4℃下12，000×g转速离心10分钟，再用1ml的70％乙醇洗涤沉淀，并用少量depc水溶解，超滤(amiconultra-2centrifugalfilterdevices3k，merckmillipore)除去残余游离核苷酸和短片段，得到纯化后的pse-sirna。
将纯化后的pse-sirna、天然sirna、硒代胞嘧啶非特异性对照sirna以及天然非特异性对照sirna分别用depc水稀释3倍，9倍，12倍，18倍，24倍，并在琼脂糖凝胶(2.5％)上电泳检验，其结果见图2；图2中从右至左依次各为3倍，9倍，12倍，18倍，24倍的各sirna的稀释浓度；通过quantitativetoolofmolecularimagerchemidocxrs+system(bio-rad，参照http://www.bio-rad.com)测量sirna的浓度。根据标准参照物(m)的浓度测得sirna(arpc4，se-arpc4，nc和se-nc)的浓度分别为300ng/μl，243ng/μl，312ng/μl，202ng/μl。
5、将培养的sw620细胞分为6组：空白组(blank)、只加转染试剂组(reagent)、天然sirna组(arpc4)、pse-sirna组(se-arpc4)、天然非特异性对照sirna组(nc)以及pse修饰非特异sirna组(se-nc)；次日(汇合度80％)换只含dmem培养基，2h后按照ribofecttm说明书步骤分别转染。
6、westernblot检测sw620细胞侵袭和增殖相关基因的表达
将传代培养6-8代的sw620细胞标记为：空白组(blank)、只加转染试剂组(reagent)、天然sirna组(arpc4)、pse-sirna组(se-arpc4)、天然非特异性对照sirna组(nc)以及pse修饰非特异sirna组(se-nc)，每孔以5×105的密度接种6孔板，在37℃、5％co2的条件下培养过夜后，按照ribofecttm转染试剂说明书步骤转染；分别收集转染72h、96h后实验组和对照组生长状态良好的对数生长期sw620细胞，提取总蛋白，以β-actin为内参，采用westernblot蛋白印迹检测波形检测蛋白(vimentin)和支架蛋白(iqgap1)的表达水平，并应用imagej软件对westernblot结果进行图像灰度分析，检测各个蛋白条带的灰度值。
7、rt-qpcr检测se-sirna转染后细胞mrna水平
收集与westernblot蛋白印迹检测arpc4表达实验同一批次的sw620细胞，提取各实验组与对照组细胞的全rna，用酶标仪测定rna纯度与浓度，再使用cdna逆转录试剂盒，参照revertaidfirststrandcdnasynthesiskit说明书，反转录合成arpc4的cdna；然后参照qpcrkit试剂盒说明书，取1μlcdna溶液，在反应体系中加入目的基因的引物与模板，设置热力学参数为95℃下预变性3min，95℃持续变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s，持续延伸7min，以上为一个循环，共进行33个循环，将逆转录产物进行扩增。每个实验组和对照组设置3个重复，记录各组ct值，采用2－δδct法进行mrna的相对定量分析；使用1.5％琼脂糖凝胶，每组取6μlrt-pcr扩增产物进行电泳分析，电泳液采用0.5xtbe缓冲液，加入1μlsybrgreen荧光染料标记，以gadph作为内参，在100v电压的条件下电泳40min。电泳结果分析采用bio-rad公司的quantityone和imagej软件进行图像分析，比较相应荧光条带的光密度值以及反色后的条带灰度值。
8、transwell实验检测sw620细胞侵袭能力
将传代培养6-8代的sw620细胞标记为：空白组(blank)、只加转染试剂组(reagent)、天然sirna组(arpc4)、pse-sirna组(se-arpc4)、天然非特异性对照sirna组(nc)以及pse修饰非特异sirna组(se-nc)，每孔以5×105的密度接种6孔板，在37℃、5％co2的条件下培养过夜后，按照ribofecttm转染试剂说明书步骤转染；
分别收集转染24h后的实验组和对照组生长状态良好的对数生长期sw620细胞，细胞计数调整细胞密度至5×105个/ml，每孔上室加200μl无血清的该细胞dmem悬液，下室加30％胎牛血清培养基500μl，每组设置3个复孔，分别在37℃、5％co2的条件下常规培养48h、72h后取出小室，pbs洗涤3次，用棉签轻轻擦去穿透膜接种面一侧的细胞，浸入甲醇常温固定30min，pbs冲洗两次，在2g/l浓度的结晶紫中染色1min，然后用pbs冲洗2次，每次20秒，在10×40倍镜下观察滤膜下被染色的细胞并计数，每个样本随机计数3个视野，计算结果去除个别由于操作不当产生的极端值后取平均数。
9、cck-8实验检测se-sirna对细胞增殖活性的影响
收集传代培养6-8代的生长状态良好的对数生长期细胞，胰酶消化后计数调整细胞密度至1×104个/ml，按照1×103个细胞/孔的接种量接种于96孔板中，标记为：空白组(blank)、只加转染试剂组(reagent)、天然sirna组(arpc4)、pse-sirna组(se-arpc4)、天然非特异性对照sirna组(nc)以及pse修饰非特异sirna组(se-nc)；每组设置5个复孔，在37℃、5％co2的条件下培养过夜后，按照ribofecttm转染试剂说明书步骤转染，在转染后0h，24h、48h、72h和96h后取出细胞，每孔加入10μlcck-8溶液，继续存放于37℃、5％co2的培养箱中孵育2h后，利用酶标仪在450nm波长处测定每孔的光密度(od值)，并绘制生长曲线。
结果分析
1、转染sirna后sw620细胞中arpcr4的表达量分析
将实验组分为：空白组(blank)、只加转染试剂组(reagent)、天然sirna组(arpc4)、pse-sirna组(se-arpc4)、天然非特异性对照sirna组(nc)以及pse修饰非特异sirna组(se-nc)，所有sirna转染浓度均为50nm。全细胞蛋白在转染72h和96h后分别提取，然后进行wb检测，其检测结果见图3。
如图3所示：对于arpc4基因表达，转染72h和96h后，se-arpc4组和天然sirna组都有明显的敲降效果(图3a，b)；其中，se-arpc4组的敲降效果要好于天然sirna组(p＜0.05)(图3c)；运用bio-rad公司的quantityone软件对反转录pcr(rt-pcr)电泳结果进行光密度分析，结果显示：(1)转染后72h和96h后，se-arpc4组与arpc4组的mrna水平均显著低于nc组、se-nc组与空白组(图3d，p＜0.05)；(2)se-arpc4组和arpc4组相比，在转染72h时，se-arpc4组的mrna水平较高(抑制效果较弱)，但是在转染96h时，mrna水平明显更低(抑制效果较强)，说明se-arpc4组比arpc4组有更持久的效果。
2、sirna转染后的sw620细胞的侵袭能力分析
使用nikoneclipseti倒置显微镜，在10×物镜下拍摄transwell实验组各组图像，采用人工计数的方式进行计数，以具有明显细胞形态的染色单位作为有效计数单位；其中，实验组(se-arpc4组)的穿膜细胞数显著少于空白组和对照组(se-nc组和nc租)(图4a)；96h空白组和对照组穿膜细胞数(图4b)分别为blank(141±5.04)，se-nc(120±3.46)，nc(134±5.28)reagent(132±4.20)，与实验组se-arpc4(33±1.11)、arpc4(50±2.06)相比较，差异具有统计学意义(p＜0.05)。
3、westernblot分析侵袭相关基因表达水平
sirna转染细胞96h后，提取蛋白进行westernblot分析，对于侵袭正相关的支架蛋白iqgap1在96h的westernblot结果分析如图5所示：实验组与对照组在96h处相比表达水平有显著差异，差异具有统计学意义(图5a，c；p＜0.05)；对侵袭正相关蛋白波形蛋白viemetin在96h的westernblot分析结果显示：实验组与对照组相比具有显著差异，差异具有统计学意义(图5b，d；p＜0.05)；硒修饰的sirna比天然sirna对相关蛋白表达水平的影响更加明显(图5c，d)。
4、cck-8实验检测se-sirna对细胞增殖活性的影响
cck-8检测结果如图6所示，se-si-rna、天然si-rna组的细胞增殖能力与空白对照组cck-8法结果显示实验组和各个对照组的细胞增殖差异不具统计学意义(p＞0.05)，说明se-si-rna没有明显的细胞毒性。
序列表
<110>四川大学
<120>一种经α-磷-硒修饰的sirna及其制备方法和应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>21
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gguaugauaucagcuuucuuu21
<210>2
<211>21
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
agaaagcugauaucauaccuu21
<210>3
<211>21
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
uucuccgaacgugucacguuu21
<210>4
<211>21
<212>rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
acgugacacguucggagaauu21