本发明属于动物分子标记筛选技术领域，具体涉及一种与母猪肢蹄骨密度相关的fam131c基因的snp分子标记。本发明的分子标记可用于猪肢蹄骨密度性状的检测。
背景技术：
我国是猪肉消费大国，生猪产业是我国国民经济的重要组成部分，为了提高我国的生猪生产水平，满足国内日益增长的对瘦肉的需求，每年从国外引进大量的杜洛克、长白、大白等瘦肉型种猪。在我国的集约化饲养环境下，这些猪往往容易发生肢蹄病，跛行甚至瘫痪，造成种猪的提前淘汰。母猪患肢蹄病会延迟发情或影响发情症状表现，延长空怀时间，分娩母猪患肢蹄病会导致产程延长、产仔无力、提高难产率、产后无乳等(刘瑞玲，2011)，肢蹄病成为制约我国生猪生产的一大障碍，肢蹄病的发病率高，据明尼苏达大学的一项研究表明，184头母猪中仅有3.8％的个体不存在任何肢蹄损伤(李宇晓等，2009)，肢蹄病是母猪被淘汰的第二大原因(刘永祥等，2011)，前两胎母猪因肢蹄病淘汰的比例高达27％(lahrmann等，2003)。国内规模化猪场肢蹄病发生率约为5％-35％(于永军，2015)，发病猪群母猪死亡率可能超过5％(张佳译，2010)，由于母猪肢蹄病导致的母猪提前淘汰或死亡，给猪场带来巨大的经济损失。
骨密度，是指单位体积骨矿物密度的大小，可以反映骨的柔韧度，单位为g/cm3，目前主要有定量ct(q-ct)、x-双能射线和超声波技术测定方法(scholz等，2015)。骨密度是人类骨质疏松症的主要诊断指标，占70-80％的参考比例(王洪复等，2003)，同时骨关节炎(oa)、类风湿性关节炎(ra)也表现为骨密度低于正常组(赵鉴非，2003)。猪肢蹄结实度一般用肢蹄评分、步态评分、腿型评分、骨矿物含量和骨矿物密度、软骨病评分、关节面软骨评分以及肱二头肌长度等来度量(侯丽娟等，2013)，相比之下，骨密度是有通过仪器测量所得，且可活体无损测量，较其他评定依据更科学、客观。再者，骨密度受基因调控，据报道smad3基因中的内含子变体在骨重塑和软骨中发挥作用，是骨关节炎和骨密度的生物学相关性的基因(hackinger等，2017)。在种猪选育过程中，如果能将骨密度作为一个育种指标，选育高产且骨密度高的种猪，提高种猪生产效率的同时增加其肢蹄结实度，就可以增加优良种猪使用年限、降低因肢蹄病造成的大量母猪淘汰，对降低母猪的淘汰率、降低母猪生产成本具有重要意义。
本发明中发现的snp与猪肢蹄骨密度性状的相关性达到了显著水平，为家猪肢蹄结实度性状的研究提供了新的遗传资源。
技术实现要素：
本发明的目的在于完善家猪抗病育种分子标记，利用geneseekporcine50ksnp芯片对snp进行分型，并使用全基因组关联分析(简称gwas)筛选与母猪肢蹄相关的snp标记，为猪的抗病育种提供新的分子标记资源。
本发明的技术方案如下所述：
申请人通过基因分型技术并参阅ensembl数据库，得到包括登录号为asga0099279基因上下游100bp的核苷酸序列的fam131c基因片段，其序核苷酸列如seqidno:1所示。具体为：
tgtcagagaaacagagaaggatctctggggagcgtgggcactgatttaaccggaggctggtgactttccccagcaacgtgcagctctgagggttcaggcar(c/t)gaagcaggtggagggttgagagggtcaagggcatccgcaaaggagagcttgtaggatacaagtgggaatggctggcccatctgcctgtgactaattctag，
上述序列的第101位碱基处的r是c或t的基因突变,该突变使seqidno：1序列产生了多态性。该分子标记可以作为检测与猪骨密度相关的分子标记，当seqidno：1上的第101位核苷酸为c时，则判定母猪的肢蹄具有更高的骨密度。
申请人提供了一种筛选猪骨密度性状相关snp分子标记的方法，所述的方法包括如下步骤：
①按常规方法提取猪耳朵基因组dna，并对dna进行质量检测。
②利用基因芯片技术(美国geneseekporcine50ksnp芯片，具体步骤见说明书文末)进行分型。
③采用基于单标记关联回归模型的方法，以个体性别作为固定效应，在利用r统计环境下的enabel软件包进行gwas分析。
回归模型如下：y＝xb+sa+zu+e，
其中y代表“表型值向量”(thevectorofphenotypes)；b代表“固定效应(包括性别)的估计值及表型值均值μ”；α代表“snp的替换效应”；u代表“随机加性遗传效应”；服从多维正态分布，u～n(0,gσα2)，g表示基因组相似度矩阵(基于snp标记)，g表示多基因加性方差(通过此进行遗传力的估计)；x、s、z分别为b、α、u的关联矩阵(incidencematrix)；e代表“残差向量”(avectorofresidualerrors)，服从正态分布，e～n(0,iσe2)，表示残差方差。
本发明筛选的分子标记可用于非诊断目的的对猪肢蹄骨密度相关基因的基因型或与猪肢蹄性状中的骨密度之间的关联分析中，为猪骨密度性状的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记资源。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明可通过在体外采用基因芯片技术检测猪的基因型，作为非诊断目的的评价猪的肢蹄结实度，与目前的pcr-rflp等方法相比，本发明具有简单、快捷、灵敏度高和特异性好等突出优点。
更详细的技术方案请参见说明书的《附图说明》及《具体实施方式》中的实施例。
附图说明
序列表seqidno：1是本发明克隆的包括登录号为asga0099279基因上下游100bp核苷酸序列的fam131c基因片段，该片段是本发明筛选的分子标记，其核苷酸序列长度为201bp，该序列的101位碱基处的r存在一个c/t等位基因突变。
图1：本发明的总体技术流程示意图。
图2：是本发明克隆的包括登录号asga0099279基因上下游100bp核苷酸序列的fam131c基因片段(即，本发明筛选的分子标记的核苷酸序列)。附图标记说明：在图2中显示核苷酸序列的第101位碱基处存在一个c/t等位基因突变(101bp处的英文字母“r”为突变位点)。
图3：是本发明的曼哈顿图。附图标记说明：黑色圆圈及箭头指向标记的为本发明筛选的分子标记，该标记位于猪第6号染色体上。
具体实施方式
实施例1：猪基因分型检测
(1)利用试剂盒法提取骨密度相关群体的耳朵组织dna
本实施例的试剂盒采用tianampgenomicdnakit血液/细胞/组织基因组dna提取离心柱型试剂盒，由天根生化科技(北京)有限公司生产。具体步骤为：
1)将骨密度相关群体(品种为大白猪和长白猪，实施本发明并不限于上述品种，该群体由广西扬翔股份有限公司提供)的耳样组织，用眼科剪剪碎至糊状，加入200ulga(上述试剂盒自带)，并震荡混匀；然后放入56℃水浴锅中消化过夜。
2)将消化后的组织样加入200ul缓冲液gb(上述试剂盒自带)，充分颠倒混匀，并70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管壁上的水珠。
3)加入200ul无水乙醇，充分震荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管壁上的水珠。
4)将上一步所得溶液及絮状沉淀一并加入吸附柱cb3中，并将吸附柱放入收集管中，12000rpm离心30s，倒掉废液，并将吸附柱放回收集管中。
5)向吸附柱cb3中加入500ul缓冲液gd(上述试剂盒自带)，12000rpm离心30s，倒掉废液，并将吸附柱放入收集管中。
6)向吸附柱cb3中加入600ul漂洗液pw(上述试剂盒自带)，12000rpm离心30s，倒掉废液，并将吸附柱放入收集管中，并重复该步骤。
7)将吸附柱cb3置于室温下放置数分钟，以彻底晾干吸附柱材料中剩余的漂洗液。
8)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，并向吸附柱膜中间部位悬空滴加50-200ul的洗脱液te(试剂盒自带)，室温下放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(2)snp基因型的判定及质量控制
使用50k基因芯片(美国geneseekporcine50ksnp芯片)进行分型，并对基因型数据进行质检，最终有879个个体和48909个snp用于gwas研究。
实施例2：分子标记分型方法在猪肢蹄骨密度性状关联分析中的应用
(1)asga0099279分子标记分型结果与肢蹄骨密度性状关联分析
用于基因型与肢蹄骨密度性状关联检测分析所用的试验猪群来自广西扬翔股份有限公司培育的纯种母猪群体，包括大白猪、长白猪(为常规品种，但不限于上述品种)。基因分型所用的dna由纯种大白猪、长白猪(说明书正文和表中所称的“纯种大白猪、长白猪”简称“猪”)耳样提取。采用基于单标记关联回归模型的方法，采用个体的性别作为固定效应，在利用r统计环境下的genabel软件包进行gwas分析。
回归分析模型如下：y＝xb+sa+zu+e
其中：y代表“表型值向量”(thevectorofphenotypes)；b代表“固定效应(包括性别)的估计值及表型值均值μ”；α代表“snp的替换效应”；u代表“随机加性遗传效应”；服从多维正态分布，u～n(0,gσα2)，g表示基因组相似度矩阵(基于snp标记)，g表示多基因加性方差(通过此方差进行遗传力的估计)；x、s、z分别为b、σ、u的关联矩阵(incidencematrix)；e代表“残差向量”(avectorofresidualerrors)，服从正态分布，e～n(0,iσe2)，表示残差方差。
关联分析结果见表1。
表1本发明的分子标记的多态性对不同基因型母猪骨密度的影响
表1说明：p<0.05为差异显著；p<0.01为差异极显著。
由表1可知，基因型为cc的个体肢蹄骨密度极显著高于tc个体，所以c是有利于骨密度增加的等位基因。
附录：关于基因芯片技术的说明：
本发明使用illumina公司研制porcinesnp50beadchip全基因组芯片，该芯片包含超过50000个snp位点，覆盖猪的基因组。此芯片整合了多种猪的基因差异，包括杜洛克猪，长白猪，皮特兰猪和大白猪，能提供足够的snp密度，可应用于全基因组关联分析中。
主要参考文献
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序列表
<110>华中农业大学
<120>与母猪肢蹄骨密度相关的fam131c基因的snp分子标记
<141>2018-05-02
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>201
<212>dna
<213>猪(susscrofa)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(201)
<220>
<221>mutation
<222>(101)..(101)
<400>1
tgtcagagaaacagagaaggatctctggggagcgtgggcactgatttaaccggaggctgg60
tgactttccccagcaacgtgcagctctgagggttcaggcaggaagcaggtggagggttga120
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