高产纤维素酶的真菌及其高产纤维素酶的方法与流程

本发明涉及微生物领域，属于产纤维素酶的微生物的发明创造。

背景技术：

纤维素是全球分布最广、最丰富的可再生有机物资源。纤维素酶是已知的一类能够催化水解纤维素生成葡萄糖且具有生物活性的酶的总称。经纤维素酶水解后，纤维素被转换成可溶的单分子葡萄糖，这种可溶性单分子葡萄糖具备制备生物燃料的潜质，具有广阔的发展前景。

可惜，至今大部分纤维素尚未被加以利用，究其原因，一方面的瓶颈在于纤维素酶的生产效率和质量还不足以支撑纤维素的应用落地为产业。这样的现实，对于像纤维素这样广泛分布的可再生资源来说，无疑是一种严重的浪费；不仅如此，例如，废弃的建筑木板还造成了一定的环境污染。

根据性质和功能可将纤维素酶分为：内切葡聚糖酶(endo-1,4-d-glucanase，ec3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exo-1,4-β-d-glucanase，ec3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(3-d-glucosidase，ec3.2.1.21)。通常利用滤纸纤维素酶(filterpapercellulase，fpa)来表征纤维素酶系总的糖化能力。自然界中的多种微生物均可分泌纤维素酶作用于纤维素，不同微生物分泌的纤维素酶在组成上有显著差异，且对纤维素的水解能力也各不相同。长期以来，从自然界中发现高产纤维素酶的微生物及其方法是几代科研工作者的梦想。特别是发现提高生产效率和发酵活力的纤维素酶将会对纤维素应用的产业化带来希望。

本发明正是基于这样的背景提出的。本发明提供的真菌相比与现有的产纤维素酶真菌，具有更高的产酶效率和酶活性。本发明对纤维素应用的产业化必将起到关键作用。

技术实现要素：

本发明提供一种哀牢山绚孔菌laetiporusailaoshanensis，隶属于真菌界、担子菌门、伞菌纲、多孔菌目、拟层孔菌科fomitopsidaceae；它具有genbank序列号为mg672515的基因片段。经测定，它的酶活性范围至少为53.28(u/ml)到77.68(u/ml)之间(包括首尾)，菌落形态见图1、图2。图1、图2所示菌落是采自云南省永德县大雪山自然保护区的栲树树桩上的哀牢山绚孔菌的子实体培养而成。该菌落的培养过程记录：用消毒过的刀片切取表面已消毒的子实体靠近基部的菌肉组织(约0.5cm×0.5cm×0.5cm)接种到平板培养基上，于恒温培养箱28±2℃静置培养，期间每天在体视显微镜下观察菌丝的生长情况，直至培养基中长出菌落。无菌条件下挑取平板培养基上远离杂菌菌落的菌丝接种到新的培养基上，于恒温培养箱28±2℃静置培养，期间每天在体视显微镜下观察菌丝的生长情况。再次发现杂菌菌落后，重新挑取远离杂菌菌落的菌丝接种到新的培养基上，于恒温培养箱28±2℃静置培养，直至培养基中为单一纯净的哀牢山绚孔菌菌落。其中，平板培养基的组分为：去皮马铃薯300g/l，葡萄糖20g/l，琼脂粉20g/l，蛋白胨5g/l，kh2po41g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，znso4·7h2o0.05g/l，维生素b10.01g/l，ph5。本发明提供高产纤维素酶的方法，所制备的酶液可被应用于生物燃料制造、食品加工、纺织造纸等领域；该方法用具有genbank序列号为mg672515的基因片段的哀牢山绚孔菌作为酶菌，该方法中产纤维素酶的培养基由碳源纤维原料、无机氮源、微量元素液组成。其中，微量元素的重量份为mnso4·h2o(0.5-1.5)、mgso4·7h2o(0.5-1.5)、cocl2·6h2o(0.005-0.015)、feso4·7h2o(0.03-0.07)、znso4·7h2o(0.05-0.15)、维生素b1(0.03-0.07)组成；ph大于等于3且小于等于7。

附图说明

图1是本发明哀牢山绚孔菌菌落形态远照；

图2是本发明哀牢山绚孔菌菌落形态近照。

具体实施方式

1.分子生物学鉴定

在无菌条件下将平板培养基上的菌丝刮取后放入研钵中，用液氮充分研磨至粉状，立即装入1.5ml离心管中，利用ctab植物基因组dna快速提取试剂盒提取该菌株的基因组dna。

利用its5和its4扩增its1-5.8s-its2(its)rdna基因片段。pcr反应体系(30μl)：15μl2×easytaqpcrsupermix、1μl10μmol/l引物its5、1μl10μmol/l引物its4、1μl基因组dna和12μl去离子水。pcr反应程序：95℃预变性3min，94℃变性40s，54℃复性45s，72℃延伸1min，35个循环后72℃延伸10min，4℃保温。最后将pcr产物交由北京六合华大基因科技有限公司进行测序，对测序结果进行blast比对。

经比对后与哀牢山绚孔菌laetiporusailaoshanensis的序列完全一致，genbank序列号为mg672515，鉴定为哀牢山绚孔菌laetiporusailaoshanensis。其关键基因序列如下：

2种子培养

取250ml三角瓶分装100ml液体培养基，接种5个直径1cm菌饼，于恒温摇床28±2℃、150r/min振荡培养7天。利用内切式匀浆机以5000r/min、1min将培养物制成种子发酵悬液，充分振荡备用。

液体培养基：去皮马铃薯300g/l，葡萄糖20g/l，蛋白胨5g/l，kh2po41g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，znso4·7h2o0.05g/l，维生素b10.01g/l，ph5。

3产纤维素酶培养基优化

取500ml三角瓶分装产纤维素酶培养基，接种10ml种子发酵悬液，于恒温培养箱28±2℃静置培养10天。

向上述固体发酵的500ml三角瓶中加入100ml0.05mol/l柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(ph5)，于恒温摇床28±2℃、150r/min反应2h，所得提取物于4℃、12000r/min离心15min，上清液即为纤维素酶液。

产纤维素酶培养基：80-120目棉籽壳20g/l(5-35)，8-120目玉米芯10g/l(5-15)，微晶纤维素10g/l(5-15)，蛋白胨5g/l(3-7)，tween802ml/l(1-3)，peg40000.5g/l(0.3-0.7)，kh2po41g/l(0.5-1.5)，cacl20.3g/l(0.1-0.5)，微量元素液50ml/l。

微量元素液：mnso4·h2o1g/l(0.5-1.5)，mgso4·7h2o1g/l(0.5-1.5)，cocl2·6h2o0.01g/l(0.005-0.015)，feso4·7h2o0.05g/l(0.03-0.07)，znso4·7h2o0.1g/l(0.05-0.15)，维生素b10.05g/l(0.03-0.07)，ph5(3-7)。

4纤维素酶活性测定

dns试剂配制：准确称取5.3g3,5-二硝基水杨酸溶于500ml去离子水中，搅拌5s，水浴至45℃。后加入9.9g氢氧化钠，期间不断搅拌，直至溶液清澈透明。再逐步添加153g四水酒石酸钾钠、3.8ml苯酚(50℃融化)和4.15g无水亚硫酸钠，45℃水浴加热，补加208ml去离子水，期间不断搅拌，直至加入的物质完全溶解，冷却至25℃，避光保存7天后备用，有效期6个月。

标准曲线制作：准确配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mg/ml葡萄糖标准液。分别吸取0.5ml上述葡萄糖标准液于8支20ml具塞刻度试管中，加入1.5mldns试剂，摇匀沸水浴5min，取出冷却后用去离子水定容至20ml，充分混匀。于540nm处测定吸光值，设3个重复，求平均值。以反应体系中葡萄糖标准品的浓度为横坐标、吸光值为纵坐标作标准曲线，计算回归方程为：y＝0.0569x-0.0139，相关系数r2＝0.9997。

fpa测定：吸取0.5ml酶液和1.5ml0.05mol/l柠檬酸-磷酸盐缓冲液(ph5)加入20ml具塞刻度试管中，50℃水浴保温10min后，加入50mg滤纸条(约1cm×6cm)，50℃水浴保温1h，取出立即加入1.5mldns试剂，煮沸5min后取出冷却，用去离子水稀释至20ml，于540nm处测定吸光值，设3个平行，求平均值。向已吸取酶液和缓冲液的试管中直接加入dns试剂以钝化酶活，作为空白对照。定义1min内催化产生1μmol葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位(u)。

表1哀牢山绚孔菌在不同培养基条件下的纤维素酶活性

以上实施例在实验室条件下完成，已经验证的了本发明所提之效果，也已经向本领域之普通技术人员阐明了实践本发明所需的必要手段，本发明之保护范围应受尊重，不得于刻意缩小，凡是于产业应用时所做的适应性调整或改动后技术方案均应承认是本发明精神之贯彻。