本发明涉及临床医学检测和诊断领域，具体而言，涉及一种重组人肌红蛋白的表达纯化方法。
背景技术：
肌红蛋白(myoglobin,mb)是一种氧结合血红蛋白，由一条肽链和一个血红素辅基组成，分子量为16.7kda，广泛存在于人和其他哺乳动物的心肌和骨骼肌中。血红素辅基是铁卟啉化合物，由4个吡咯通过4个甲炔基相连形成一个大环，fe2+位于吡咯环中央。肌红蛋白分子排列紧密，一分子蛋白结合一分子氧，这种结构使得肌红蛋白在贮存和输送氧的过程更快发挥作用。
在急性心肌损伤时，由于肌红蛋白是胞浆蛋白，分子量较小，会最先被释放在血液中，2-3h后血中的mb超出正常上限，6-9h达到高峰，因此检测mb水平可以快速确诊并及时治疗，从而降低病死率。有关mb的检测方法有很多，如elisa法、ria法、荧光免疫测定法、免疫比浊法等，目前国内的检测试剂盒多为进口或者进口原料组装，价格昂贵，很大程度上限制了mb检测的推广和应用。因此当前急需的是自主开发检测试剂盒，摆脱依赖进口的现状。
近年来，国内一些提取肌红蛋白的相关报道显示天然提取纯化方法存在以下问题：来源困难、提取步骤繁琐、质量和活性不稳定等；重组肌红蛋白虽然解决了天然纯化的部分问题，但也存在产率低、稳定性不好、活性低等问题。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的目的在于解决人肌红蛋白传统天然纯化方法心肌组织来源困难，产率低，质量及活性难以稳定的缺陷，提供一种高效表达重组人肌红蛋白的基因工程菌及纯化方案，能够获得高活性和高稳定性的重组人肌红蛋白，为临床检测心肌损伤及预后提供诊断试剂原料，为急性心肌梗死等心脏疾病的快速诊断试剂盒的制备奠定了基础。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明涉及一种重组人肌红蛋白的表达纯化方法，包括：
将重组人肌红蛋白基因序列连入大肠杆菌表达载体，获得人肌红蛋白表达质粒，将所述质粒转化到大肠杆菌得到转化子；
对所述转化子扩大培养诱导表达后将细胞破碎、离心后收集上清；表达出的重组人肌红蛋白n端含有trx-(his)6融合标签；将所述上清经滤膜过滤后用ni-柱亲和层析，洗脱后即得重组人肌红蛋白。
本发明所述方法制备的重组人肌红蛋白表现出高产率、高活性及高稳定性的特征，适用于体外诊断原料的要求。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明采用重组大肠杆菌表达mb，n端有(his)6标签，一步法获得高纯度、高产率目的蛋白，收率达40mg/l；
(2)本发明在目的蛋白n端设计trx标签，并且优化蛋白保存体系，提高了mb的保存稳定性，在37℃加速试验中，稳定性大于1周。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中金属螯合层析法纯化蛋白电泳图；
图2为本发明一个实施例中mb于37℃加速一周电泳图；
图3本发明一个实施例中mb于37℃加速一周浓度测定图；
图4本发明一个实施例中mb于37℃加速一周活性稳定性。
具体实施方式
本发明涉及一种重组人肌红蛋白的表达纯化方法，包括：
将重组人肌红蛋白基因序列连入大肠杆菌表达载体，获得重组人肌红蛋白表达质粒，将所述表达质粒转化至大肠杆菌得到转化子；
对所述转化子扩大培养诱导表达后将细胞破碎、离心后收集上清；表达出的重组人肌红蛋白n端含有trx-(his)6融合标签；将所述上清经滤膜过滤后用ni-柱亲和层析，洗脱后即得重组人肌红蛋白。
融合标签技术是将某种标签的编码基因融合在靶基因的3'或5'端，是一种重组dna技术，常见的融合标签有：mbp-tag、gst-tag、sbp-tag、sumo-tag、trx-tag等。本发明采用融合标签trx，最终提高了目的蛋白的可溶性和稳定性。
本发明克服了人肌红蛋白传统天然纯化方法心肌组织来源困难、产率低、质量及活性难以稳定的缺陷，提供一种高效表达重组人肌红蛋白的基因工程菌及纯化方案，能够获得高活性和高稳定性的重组人肌红蛋白，为临床检测心肌损伤及预后提供诊断试剂原料，为急性心肌梗死等心脏疾病的快速诊断试剂盒的制备奠定了基础。
优选的，如上所述的方法，所述大肠杆菌为bl21(de3)。
优选的，如上所述的方法，所述大肠杆菌表达载体为pet-32a(+)。
pet-32a(+)表达载体n端有trx标签和his标签，有利于表达产物的稳定和分离纯化的便利。
优选的，如上所述的方法，所述转染的条件包括：
将所述人肌红蛋白表达质粒冰浴条件下加入到处于感受态的所述大肠杆菌中，冰浴放置15min～25min，热激80s～100s，36℃～38℃、200rpm～240rpm震荡培养40min～60min后涂板筛选转化子；
更优选的，所述转染的条件包括：
将所述人肌红蛋白表达质粒冰浴条件下加入到处于感受态的所述大肠杆菌中，冰浴放置20min，热激90s，37℃、220rpm震荡培养50min后涂板筛选转化子。
优选的，如上所述的方法，所述诱导为用0.05mm～0.80mm异丙基硫代半乳糖苷进行诱导表达；
更优选的，所述诱导为用0.10mm异丙基硫代半乳糖苷进行诱导表达。
优选的，如上所述的方法，加入所述异丙基硫代半乳糖苷时，菌液培养至od600＝0.6～0.8，更优选为0.7。
优选的，如上所述的方法，在加入所述异丙基硫代半乳糖苷后，还包括：16℃～38℃、200rpm～240rpm震荡培养3h～20h；
更优选的，在加入所述异丙基硫代半乳糖苷后，还包括：37℃、200rpm～240rpm震荡培养3h～5h。
优选的，如上所述的方法，所述细胞破碎在缓冲液中进行，所述缓冲液包括15mm～25mm咪唑；
更优选为20mm咪唑；
更优选的，所述缓冲液的成分包括：
ph8.2～8.8的40mm～60mmtris-hcl，0.4m～0.6mnacl，15mm～25mm咪唑；
更优选的，所述缓冲液的成分包括：
ph8.5的50mmtris-hcl，0.5mnacl，20mm咪唑。
优选的，如上所述的方法，所述离心的参数为8000rpm～12000rpm离心10min～30min；
更优选的，所述离心的参数为10000rpm离心20min。
优选的，如上所述的方法，所述滤膜的孔径为0.2μm～0.24μm；
更优选为0.22μm。
优选的，如上所述的方法，所述洗脱所用的洗脱液包括90mm～500mm咪唑，优选90mm～110mm咪唑；更优选为100mm；
更优选的，所述洗脱液的成分包括：
ph8.2～8.8的40mm～60mmtris-hcl，0.4m～0.6mnacl，90mm～500mm咪唑；
更优选的，所述洗脱液的成分包括：
ph8.5的50mmtris-hcl，0.5mnacl，100mm咪唑。
除非另有限定，本发明使用的所有技术和科学术语具有与所公开的实施方案所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本发明所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本实施方式的实践或测试中，但下文仍然描述了合适的方法和材料。本发明提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过引用全部内容结合于本文中。在冲突的情况下，本说明书(包括定义)将起支配作用。此外，材料、方法以及实施例仅仅是说明性的，而不旨在限制。实施方式的其他特征和优点将从以下详细的说明书和权利要求中变得明显。
为了促进理解本文描述的实施方式这一目的，将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述这些实施方式。本文所使用的术语仅用于描述具体实施方式目的，而不旨在限制本公开的范围。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例
1)以ncbi提供的人心肌肌红蛋白的基因为参考，结合本发明的试验设计要求，确定seqidno:1所示的基因并委托上海生工进行合成，载体为pet-32a(+)，n端有trx和(his)6标签，有利于表达产物的稳定，为快速分离纯化提供便利。
2)重组质粒导入宿主大肠杆菌
取1μl表达质粒，在冰浴条件下，加入到大肠杆菌感受态bl21(de3)中，冰浴放置20min，热激90s，加入700μllb培养基，37℃，220rpm，震荡培养50min，取100μl菌液涂布到氨苄抗性平板上。
3)目的基因表达过程
挑去步骤2)中的单克隆，无菌操作接种于5ml含100μg/ml的lb培养基中，37℃，220rpm，震荡培养至od600在0.6～0.8之间，加入0.1mmiptg进行诱导表达，37℃，220rpm，继续震荡培养4h。取样进行sds-page鉴定，以未诱导的菌液为对照。
4)表达产物纯化
摇瓶培养5l菌液，8000rpm，离心5min，收集菌体，配制缓冲液250ml(50mmtris-hcl，0.5mnacl，20mm咪唑，ph8.50)，菌体重悬，超声破碎，离心10000rpm，20min，收集上清，0.22μm滤膜过滤后过ni-柱亲和层析，用50mmtris-hcl，0.5mnacl，100mm咪唑，ph8.50洗脱的蛋白即为目的蛋白。
洗脱后蛋白的电泳图如图1所示。
5)蛋白稳定性试验
将获得的目的蛋白分别分装于2mlep管中，1ml/支，用封口膜封好。每批次5支，其中1支置于4℃作为对照，其余4支置于37℃做加速一周试验，分别于0、1、3、5、7天取样进行鉴定，进行电泳鉴定和浓度测定。
mb于37℃加速一周电泳图如图2所示。
mb于37℃加速一周浓度测定图如图3所示。
6)化学发光法鉴定活性
采用双抗体夹心法进行检测：1.样本、生物素标记的肌红蛋白单克隆抗体、吖碇酯标记的另外一株mb单克隆抗体以及链亲和素包被的磁性微粒在温育条件下反应，抗体捕获样本中的抗原，形成抗原抗体夹心复合物。加样体系：20μl样本+100μll4+10μll1，37℃温育10min；100μll3，37℃温育15min，磁珠洗液洗3次，测定发光值。2.检测读数：温育结束后，加磁场沉淀，去掉上清液，用清洗液清洗沉淀复合物，并吸干废液，除去未与磁性微粒结合的物质，再将反应杯送入测量室中。仪器自动泵入两种激发液，使复合物产生化学发光信号，通过光电倍增器测量发光强度。
采用化学发光法测定mb活性浓度，结果活性浓度为蛋白浓度的40％，远高于诊断试剂盒校准品高限。
7)化学发光法鉴定稳定性
实验方案：分装100ulmb若干支抗原放置37℃恒温箱，第0/4/7天取出10ul检测，按照抗原母液有效浓度确认标准操作规程进行操作，考察原料稳定性
实验结果如图4所示，结果表明，含50％甘油的mb在加速一周稳定性良好。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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<110>基蛋生物科技股份有限公司
<120>一种重组人肌红蛋白的表达纯化方法
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