本发明属于医药技术领域，具体涉及一种原代肿瘤上皮细胞培养及药物评估的方法，包括原代肿瘤上皮细胞培养基，培养方法，以及药物评估的方法。
背景技术：
近年来，随着筛检技术、手术技术的逐步发展以及规范化的放化疗技术的应用，癌症的临床预防及治疗水平已经有了较大的进步，但是很多进展期癌症的五年生存率并没有得到明显的提高。其原因主要在于临床化疗药物的疗效非常有限，由于不同癌症患者肿瘤的进展程度，基因突变，生物学特性，耐药性及异质性均不完全相同，故其对临床上化疗药物的敏感程度不同，患者应用临床一线药物的应答率及有效率也不理想。因此，临床上针对不同患者均使用相同药物会带来不必要的治疗，导致患者的痛苦及医疗资源的浪费。
如何评价化疗药物对不同肿瘤患者的有效性成为了一个重要的研究方向，即所谓的个体化治疗。目前现有的临床评价药物的模型主要为来源于人体新鲜肿瘤的动物移植模型(patient-derivedtumorxenograftmodels，pdx)，即将病人新鲜的瘤组织直接移植到免疫缺陷小鼠（裸鼠）体内而建立的肿瘤模型。在多种类型肿瘤的pdx移植模型的检测中，裸鼠移植瘤保持了患者肿瘤的生物学特征，同时也具有患者肿瘤的遗传多样性，在抗肿瘤药物研究和基础机制研究中起到了重要意义。但是pdx模型建模时间长，成本过大，有免疫微环境的缺失，成功率近为25%左右，难以大规模应用于临床造福患者。
肿瘤原代细胞培养一直是临床评价药物的一种重要方法，但是由于不同肿瘤组织的建系难度及成功率不一，故一直难以形成稳定的方法。经过了长期探索和研究，我们发现使用滋养层细胞的条件性重编程培养法（conditionalreprogrammingculture，crc）可以快速稳定建立原代肿瘤细胞系。且由于肺癌和膀胱癌的特殊性，其患者胸水或尿液中会有一定量的肿瘤上皮细胞，故可以利用这些肿瘤细胞进行便捷的原代细胞培养，一方面提高液体活检的准确性，另一方面通过药物评估进行患者的个体化治疗。
技术实现要素：
本发明的的目的在于提供一种快速、稳定的原代肿瘤细胞的培养方法，并进一步对癌症患者进行个性化药物评估和筛选。
本发明提供的原代肿瘤细胞的培养方法，具体步骤为：
（1）配置原代细胞培养基：其组分包含：氢化可的松，egf（表皮生长因子），insulin（胰岛素），rock抑制剂（rhoa激酶抑制剂）；但不包含霍乱毒素（参见natureprotocol中的文章：conditionalreprogrammingandlong-termexpansionofnormalandtumorcellsfromhumanbiospecimens.其包括霍乱毒素），是对已有原代细胞培养基的改进；所述培养基简称完全f培养基（记为completef），培养基于35℃-38℃，3%-10%co2（最优条件为37℃，5%co2）条件下培养待用；
（2）铺好滋养层细胞；
（3）取肿瘤组织上皮细胞；
（4）使用上述原代细胞培养基在铺好滋养层细胞上培养肿瘤组织上皮细胞：
将肿瘤组织上皮细胞铺于已准备好的滋养层细胞上，用completef培养基在35℃-38℃，3%-10%co2（最优条件为37℃，5%co2）条件下进行培养；根据肿瘤组织上皮细胞的量选择合适大小的培养皿和适量completef培养基（实例中所用培养基的量为：直径6cm的培养皿用5mlcompletef，直径10cm的培养皿用10mlcompletef）；肿瘤组织上皮细胞在滋养层细胞所分泌的生长因子及培养基中所含营养因子的共同作用下快速增殖，待肿瘤组织上皮细胞长至80%~90%左右的细胞密度时进行消化传代。
本发明中，所述培养基，其中：
所述氢化可的松的优选含量为：10ng/ml~40ng/ml；
所述egf的优选含量为：0.05ng/ml~0.175ng/ml；
所述insulin的优选含量为：2.5μg/ml~7.5μg/ml；
所述rock抑制剂的优选含量为：5μm~15μm；
所述rock抑制剂是选自y-27632。
本发明中，所述滋养层细胞选自小鼠或人的成纤维细胞。
本发明中，所述的肿瘤选自但不限于膀胱癌、肺癌、肝胆管癌、肝癌、前列腺癌、肾癌、胸腺癌。
本发明中，所述肿瘤上皮细胞，是从各类肿瘤组织、肺癌患者的胸水或膀胱癌患者的尿液中分离获得。
本发明中，作为优选，所述肿瘤上皮细胞通过肿瘤切除方法获得。
本发明中，作为优选，所述肿瘤上皮细胞通过穿刺方法获得。
本发明中，作为优选，所述肿瘤上皮细胞通过气管镜方法获得。
本发明中，作为优选，所述肿瘤上皮细胞从肿瘤患者的胸水中获得。
本发明中，作为优选，所述肿瘤上皮细胞从肿瘤患者的尿液中获得。
进一步地，
本发明中，作为优选，对于膀胱癌，上皮细胞取自膀胱癌尿液样本。
本发明中，作为优选，对于肺癌，上皮细胞取自气管镜样本，或者选自胸水样本，或者取自手术样本。
本发明中，作为优选，肿瘤组织上皮细胞分离过程是：将手术样本、穿刺样本及气管镜样本来源的肿瘤组织于无菌环境中切分后用组织消化酶进行消化，消化为单个悬浮细胞后离心清洗消化酶，用培养基重悬，得到原代细胞悬液。
本发明中，作为优选，对于肺癌或膀胱癌情况，肿瘤上皮细胞分离过程是：清洁环境下，收集肺癌患者的胸水或膀胱癌患者的尿液于无菌离心管内，800-1200rpm离心8--12min。用添加0.8—1.2%的青霉素-链霉素双抗的pbs（磷酸缓冲盐溶液）进行重悬，再次离心，重复两次后得到的肿瘤上皮细胞用培养基重悬，得到原代细胞悬液。
本发明中，作为优选，步骤（4）的流程为：原代细胞培养基为经过改进的培养基，其成分为completedmem和completef12medium以2:1-4:1的比例混合，添加0.04%-0.16%氢化可的松/egfmix，0.05%-0.15%insulin和y-27632（终浓度5μm-15μm），但不含霍乱毒素。将辐照过的滋养层nih/3t3细胞种植于培养皿上，待其完全贴壁后，将上述肿瘤上皮细胞接种于滋养层nih/3t3细胞上进行培养。
本发明中，肿瘤上皮细胞经体外培养后，鉴定其来源及属性，然后进行临床药物的疗效评估和筛选，具体步骤如下：
（1）根据患者具体情况选择所需检测的药物，通过预实验进行药物浓度的确定；
（2）每个药物以预实验所确定的药物浓度为参考，前后稀释8-12个不同的浓度，依次5-10倍稀释，对照组为dmso；
（3）将所培养的原代细胞消化铺板，铺于96孔板内，每孔3000~5000个细胞（视细胞增殖速度决定），加95µlcompletef培养基，置于孵箱中进行过夜贴壁；
（4）第二天将梯度稀释的药物加于细胞内；
（5）加药处理三天后，进行alamarblue检测，向每孔加入10µlalamarblue，37℃孵育3.5-4h，之后用荧光酶标仪测量各孔的荧光强度，根据测得的数值，以浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，应用graphpadprism5软件绘制药物剂量反应曲线，计算各个药物对所测试细胞的50%抑制浓度(50%inhibitionconcentration，ic50)。
本发明构建了一种新型的药物测试模型，利用便捷的原代细胞培养方法，得到拥有病人自身肿瘤生物学特性的永生细胞，解决了肿瘤细胞的原代培养永生化的问题，从而实现对患者的个性化治疗。
本发明的优点在于提供一种快速稳定扩增癌症患者肿瘤上皮细胞的方法，且针对肺癌和膀胱癌患者，提供更为便利的以胸水或尿液为样本来源的无创液体活检的方法，可以很方便的收集培养大量患者的肿瘤细胞，跟踪病情及用药耐受性情况，通过药物筛选随时调整用药方法，达到精确的个性化治疗的目的。
附图说明
图1为滋养层细胞的形态结构（10×40）。
图2为两种培养方法所培养细胞状态的对比（10×40）。
图3为膀胱癌、膀胱癌尿液来源、肺癌（气管镜样本）、肺癌（胸水样本）、肺癌（手术样本）、肝胆管癌、肝癌、前列腺癌、肾癌、胸腺癌肿瘤上皮细胞的形态结构（10×40）。
图4为膀胱癌尿液肿瘤上皮细胞的he染色结果。
图5为膀胱癌尿液肿瘤上皮细胞的免疫组化分析结果。
图6为膀胱癌尿液肿瘤上皮细胞及相应肿瘤组织上皮细胞对不同一线药物的剂量反应曲线。其中，a为同一患者不同来源肿瘤上皮细胞对doxorubicinhydrochloride的剂量反应曲线，b为同一患者不同来源肿瘤上皮细胞对epirubicinhydrochloride的剂量反应曲线，c为同一患者不同来源肿瘤上皮细胞对hydeoxycamptothecin的剂量反应曲线。
图7为同一患者不同来源肿瘤上皮细胞对mitomycinc的剂量反应曲线。
具体实施方式
一、材料
dmem培养基：购自美国gibco公司
f12培养基：购自美国gibco公司
10%胎牛血清：购自美国gibco公司
链霉素-青霉素溶液：购自美国thermo公司
胰酶：购自美国gibco公司
pbs：磷酸盐缓冲液（1×），0.0067m（po4）
egf：购自上海生工公司
氢化可的松：由复旦大学附属华山医院提供
胰岛素：由复旦大学附属华山医院提供
y-27632：购自美国selleck公司
alarmablue试剂：购自美国invitrogen公司
胶原酶：购自美国sigma公司
分散酶：购自美国gibco公司
透明质酸酶：购自美国sigma公司。
二、方法
（一）培养滋养层细胞
1、nih/3t3小鼠成纤维细胞用完全dmem培养基（其中需添加10%fbs和1%双抗溶液），在37℃，5%co2条件下进行培养；
2、传代时，吸掉培养基，用pbs洗一遍，加0.25%胰酶于37℃消化3min，待细胞变圆并部分悬浮时，用同体积完全dmem培养基中和；
3、将细胞悬液1000rpm离心5min，弃上清；
4、用完全dmem将细胞重悬，按一传三的比例进行铺板，每三天传代一次。
（二）辐照滋养层细胞
1、待nih/3t3长至80%左右的密度时，将细胞消化下来，重悬于完全dmem培养基中；
2、进行辐照，辐照剂量为50gy；
3、辐照完成后，将滋养层细胞直接铺板待用，铺板密度为1×104cells/cm2，培养基为completef，或按适当的细胞密度进行液氮冻存备用。
（三）配制组织消化酶
将2ku胶原酶、10mg分散酶和3ku透明质酸酶混合，用添加过10%血清和1%双抗溶液的dmem稀释至10ml，0.22μm滤膜过滤后，4℃保存。
（四）配制completef培养基
1、配制氢化可的松/egf混合溶液：将氢化可的松溶于无水乙醇中，终浓度为0.5mg/ml；取1ml氢化可的松/egf混合溶液与2.5µgegf混合，用19mldmem稀释，混匀，置于-20℃；
2、配制completef：373mlcompletedmem（即添加过10%血清和1%双抗溶液的dmem），125mlf12medium，0.5ml氢化可的松/egfmix，0.5mlinsulin，y-27632（终浓度10μm）混合。0.22μm滤膜过滤，4℃保存两个月。
（五）收集样本
样本来源包括手术样本、穿刺样本、气管镜样本、胸水样本和尿液样本，不同样本收集方法如下：
1、对于手术样本、穿刺样本和气管镜样本：组织需于无菌环境中收集，迅速置于无菌培养基中保持湿润，之后标好标签，用冰袋尽快运输；
2、对于胸水样本：肺癌患者收集其胸水，需按医院标准流程收集至无菌容器中，添加2%的链霉素-青霉素溶液，立刻冰盒运送至实验室进行处理；
3、对于尿液样本：膀胱癌患者收集其尿液，要求是膀胱镜检查前或手术前的新鲜自然排尿尿液，对尿道口进行消毒过后，收集体积约为50ml的尿液于无菌管中，添加2%的链霉素-青霉素溶液，立刻冰盒运送至实验室进行处理。
（六）样本处理
1、对于手术样本、穿刺样本和气管镜样本（为肿瘤组织的固体样品）：样本由冰盒运回实验室后，用灭菌的剪刀和镊子将组织切成小块（尽量越细越好）后，置于1ml~3ml组织消化酶（根据组织大小决定）中，37℃孵箱消化3h~24h（根据消化效果决定）；组织消化完成后，1000rpm，5min离心弃上清；用dmem重悬后再次1000rpm，5min离心，弃上清；用completef重悬消化后的组织，铺于已准备好的滋养层细胞上，用completef培养基在37℃，5%co2条件下进行培养，培养时间与初始细胞的量有关，从3天到1周时间可以看到明显的细胞克隆。培养时间视组织消化下来的肿瘤细胞的量、生长速度等因素决定；
2、对于胸水样本和尿液样本（为液体活检样本）：样本采集后，一般应在2h内及时处理，将采集的胸水或尿液用1000rpm，10min离心，弃上清，之后用添加1%的青霉素-链霉素双抗的pbs洗3遍，均弃上清，将最后一遍离心后的细胞沉淀用少量培养基重悬，铺于已准备好的滋养层细胞上，用completef培养基在37℃，5%co2条件下进行培养，培养时间与初始细胞的量有关，从3天到1周时间可以看到明显的细胞克隆。培养时间视组织消化下来的肿瘤细胞的量、生长速度等因素决定。
（七）原代细胞培养
每日观察细胞状态，每隔两天换液，当出现明显集落时即说明建系成功，待原代细胞长至80%~90%左右的细胞密度时消化传代：
1、传代时，pbs洗过之后，0.05%的trypsin37℃消化90s，此时可将滋养层细胞消化下来；
2、吸去已被消化的滋养层细胞后，用pbs洗一遍，再次加trypsin消化，直至原代细胞开始变圆并部分悬浮离壁；
3、消化完成后用等体积的培养基进行中和；
4、1000rpm5min离心，弃上清；
5.重悬之后铺于新鲜的滋养层上进行培养。
（八）原代肿瘤上皮细胞的鉴定
以膀胱癌尿液肿瘤上皮细胞为例。
通过以下两个方面对所培养的膀胱癌尿液来源原代细胞进行鉴定：
通过str分析对原代细胞的来源进行鉴定：将所培养的原代细胞及同一患者的血液均用dna抽提试剂盒抽提基因组dna，调整至合适浓度后送至专业机构进行str检测，所得结果进行对照，判断是否来源一致。
通过he染色及免疫组化、htert突变筛选对原代细胞的类型进行鉴定：
1、he染色和免疫组化：
（1）将所培养的原代尿液上皮细胞消化离心，用pbs洗1~2次，之后固定于95%乙醇中；
（2）固定好的细胞离心，去除上清后，将细胞沉淀用肠衣包裹好，再次浸泡于95%乙醇中，用于制作细胞蜡块；
（3）样品进行细胞蜡块的制作，之后进行he染色和免疫组化分析，选择三种膀胱癌特异性的marker，包括gata3、p40和p63，通过he染色的细胞形态及免疫组化marker是否为阳性来判断原代细胞是否为膀胱癌肿瘤上皮细胞；
2、htert突变筛选：
（1）将所培养的原代细胞用dna抽提试剂盒进行基因组dna的提取；
（2）以所提取出的基因组dna片段为模板进行htert片段的扩增，扩增引物为：
正向引物：5’-cacccgtcctgccccttcacctt-3’（seq.id.no.1）和
反向引物：5’-ggcttcccacgtgcgcagcagga-3’，（seq.id.no.2）
pcr反应条件如下：
（3）pcr产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳分离；
（4）对电泳分离产物用胶回收试剂盒进行割胶回收，之后送至专业机构进行测序；
（5）测序结果与htertpromoter区域的序列进行比照，分析是否有突变的存在。
（九）药物敏感性分析
以膀胱癌尿液肿瘤上皮细胞为例。
用膀胱癌患者的尿液细胞系和相应的肿瘤细胞系进行药物敏感性分析，验证其药物敏感的一致性，进一步证明其作为液体活检及个性化治疗的可能性。
具体操作为：
1、挑选4种膀胱癌一线药物，通过预实验确定进行药物浓度的确定；
2、每个药物以预实验所确定的药物浓度为参考，前后稀释8个不同的浓度，依次5倍稀释，对照组为dmso；
3、将所培养的原代细胞消化铺板，铺于96孔板内，每孔3000~5000个细胞（视细胞增殖速度决定），加95µlcompletef培养基，置于孵箱中进行过夜贴壁；
4、第二天将药物再次用pbs进行50倍稀释，之后按顺序加药于细胞板内，每孔5µl；
5、加药处理三天后，进行alamarblue检测，向每孔加入10µlalamarblue，37℃孵育4h，之后用荧光酶标仪测量各孔的荧光强度，根据测得的数值，以浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，应用graphpadprism5软件绘制药物剂量反应曲线，计算各个药物对所测试细胞的50%抑制浓度(50%inhibitionconcentration，ic50)。
三、结果
（一）滋养层细胞的培养及辐照
如图1所示，滋养层细胞经辐照后，细胞形态扁平，失去增殖能力，但仍旧分泌生长因子。
（二）两种培养基配方的对比
如图2所示，添加霍乱毒素与否对原代细胞的生长状态无明显影响。
（三）各种类型癌症原代细胞的培养
如图3所示，所培养的各种类型的原代肿瘤细胞，均呈现典型的上皮细胞的形态。
（四）膀胱癌尿液肿瘤上皮细胞的鉴定
如表1所示，所培养的尿液肿瘤上皮细胞来源与患者的血液来源属于同一个体；
如图4所示，所培养的尿液肿瘤上皮细胞的he染色结果符合肿瘤细胞的特征；
如图5所示，通过免疫组化分析可得，gata3、p40和p63三种膀胱癌特异性marker在所培养的尿液肿瘤上皮细胞中均有不同程度的阳性表达，说明其具有肿瘤细胞的特性；
如表2所示，部分膀胱癌尿液肿瘤上皮细胞存在htertpromoter区域的突变，且突变位点与先前文献所报道的位点一致。
（五）膀胱癌尿液肿瘤上皮细胞的药物筛选
如图6所示，膀胱癌尿液肿瘤上皮细胞和相应的组织肿瘤上皮细胞对同一药物的敏感性类似，可起到一定的替代作用，希望能由此建立新的液体活检方法及药物筛选平台，对患者临床用药的选择起到一定的指导作用。
如图7为同一患者不同来源肿瘤上皮细胞对mitomycinc的剂量反应曲线。
综上所述，我们构建的原代肿瘤上皮细胞培养模型不仅快速，便利，稳定，成功率高，而且在形态学及免疫组化上符合肿瘤上皮细胞的特征，同时在确保连续传代后与患者保持个体来源的一致性之上最大程度的保持了患者肿瘤细胞的生物学特性。更重要的是，本方法亦可从胸水及尿液中获取原代细胞，属于无创性方法，特别适用于晚期肺癌及膀胱肿瘤患者（晚期患者不适宜有创方法，且晚期患者癌细胞载量较多）。通过结合临床药物筛选，可以为其他临床手段难以处理的晚期癌症患者提供有效的指导，为临床治疗各类癌症带来新的曙光。
表1
表2