一种猪流行性腹泻病毒ORF1基因全序列的扩增方法与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，更具体地，涉及一种猪流行性腹泻病毒orf1基因全序列的扩增方法。
背景技术：
猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus,pedv）是猪流行性腹泻（ped）的病原，为一种有囊膜的单股正链rna病毒，是冠状病毒科α冠状病毒属的成员。该病主要发生于寒潮季节，感染仔猪会因水样腹泻，呕吐，脱水，及电解质紊乱而死亡。其发病的严重程度及死亡率与猪的日龄呈负相关。特别对于7日龄内的新生仔猪，在缺乏有效母源抗体下，死亡率可高达100%。基于近年流行野毒株的出现及大流行，传统商品疫苗已经对当前流行野毒株缺乏产生充分的抵抗作用，高死亡率使养猪业经济损失惨重。1971年，ped于英国首次被报道。欧洲的许多国家陆续报道本病的流行暴发。比利时科学家在1976年从暴发ped的腹泻猪只中分离出类冠状病毒cv777。2005年，中国学者分离到一株野毒，命名为ljb/03。2006年，中国学者从仔猪腹湾的类便样品中分离到6株野毒。2006年初，pedv疫情开始爆发于免疫后猪群。2010年，中国各大省份陆续出现疫情。2010年10月，国内南方的几个省份暴发了大规模的pedv感染，并且迅速传播到其他地区，尤其是西北地区。2011～2012年，中国各大省份已大规模爆发pedv疫情。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒orf1基因全序列的扩增方法，该方法能够扩增猪流行性腹泻病毒orf1基因的全长，特别是在细胞上培养的不同代次的种毒的orf1基因基因全序列。通过该方法可以捕捉到猪流行性腹泻病毒在细胞培养传代过程中orf1基因的序列变化，从而通过基因的遗传变异分析了解其与毒力或者免疫效力的相关性。为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：一种猪流行性腹泻病毒orf1基因全序列的扩增引物组，由8个引物对组成，各引物对上下游引物依次如seqidno.1～16所示。一种猪流行性腹泻病毒orf1基因全序列的扩增方法，包括如下步骤，提取猪流行性腹泻病毒样品总rna，反转成cdna，分别利用如上所述8个引物对进行pcr扩增反应，分别进行克隆测序，最后拼接序列，得到orf1基因全序列。该方法扩增的目的片段orf1全长为20345bp，由包含46个核苷酸重叠序列且长度分别为12,354个核苷酸和8,037个核苷酸的两个大阅读框组成，占据基因组核苷酸数量约2/3。优选地，所述pcr扩增反应的程序为94℃预变性2min；94℃变性10s；退火温度下退火30s；68℃延伸2min；循环35次，72℃终延伸10min；所述退火温度对应为各引物对各自对应的退火温度。优选地，8个引物对分别为引物对orf1-1、orf1-2、orf1-3、orf1-4、orf1-5、orf1-6、orf1-7、orf1-8，各引物对上下游引物依次如seqidno.1～seqidno.16所示。优选地，8个引物对的退火温度分别为：引物对orf1-1、引物对orf1-6、引物对orf1-7、引物对orf1-8、退火温度均为62.5℃。引物对orf1-2、引物对orf1-3、引物对orf1-4、引物对orf1-5的退火温度均为65℃。优选地，上述方法中，所述克隆测序的具体方法为将扩增产物回收纯化，扩增产物3’末端加碱基a，然后连接至克隆载体pta2vector中，转化top10感受态细胞，筛选和鉴定重组菌后，进行测序。所述拼接序列的具体方法为：测序结果利用lasergene7.10生物信息学软件中的editseq软件进行去除包括引物对在内的外向端序列，全长序列的拼接及同源性分析同时，运用ncbi中genbank快速比对工具blast进行测序结果的验证或比对搜索，完成序列与数据库中的已有序列进行比对分析。上述引物组或/和扩增方法在猪流行性腹泻病毒orf1基因全序列扩增方面的应用亦在本发明保护范围内。本发明还提供一种扩增猪流行性腹泻病毒orf1基因全序列上特定区域的方法，所述方法为根据需要任意组合上述8个引物对进行扩增反应。上述扩增方法在猪流行性腹泻病毒orf1基因全序列特定区域研究上的应用亦在本发明保护范围内。上述扩增方法能获取病料中猪流行性腹泻病毒变异株的orf1基因。从而捕获猪流行性腹泻病毒变异株在细胞培养传代过程中基因序列的变化。也可以作为一种检测病料中pedv的方法，并为pedv的orf1基因相关研究奠定基础。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明特异性设计出一组能够克隆猪流行性腹泻病毒株传代第65代后的orf3基因全序列。通过本发明提供的引物组可以扩增获取病料中猪流行性腹泻病毒变异株的orf1基因，并可以捕获猪流行性腹泻病毒变异株在细胞培养传代过程中基因序列的变化，也可以作为一种检测病料中pedv的方法，并为pedv的orf1基因相关研究奠定基础。附图说明图1为本发明设计的对引物扩增结果琼脂糖凝胶电泳图；m为dl5000的marker；泳道1～8分别为：orf1-1、orf1-2、orf1-3、orf1-4、orf1-5、orf1-6、orf1-7、orf1-8。图2为orf1基因在pedv基因组中的位置。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1一种猪流行性腹泻病毒orf1基因全序列扩增方法，包括如下具体步骤：1、引物设计与合成：根据genbank中公开的的猪流行性腹泻病毒变异株基因的核苷酸序列，设计引物，经过大量筛选得到如下序列的引物序列，引物序列和每个引物组扩增长度如表1所示。表1为8个引物对的序列和基因的扩增长度2、病毒总rna的提取：将发明人实验室分离得到的流行毒株在细胞上传代至65代的病毒培养液250µl加入750µl的trizol中，取250µl的pbs于一灭菌离心管中，加入750µltrizol，剧烈振荡，室温下作用5分钟。再加200µl氯仿，剧烈振荡，室温下放置5分钟。4℃12,000r/min离心15分钟。将500µl上层水相移到另一新的灭菌微量离心管中，加入500µl异丙醇，轻柔混匀，-20℃放置15分钟。12,000r/min离心15分钟，倾去上清液。加入1,000µl冰预冷的75%乙醇，缓慢颠倒摇匀。4℃12,000r/min离心15分钟。轻轻弃去上清，放置3~5分钟以风干沉淀。加入20µl的rnasefree双蒸水溶解rna，于-20℃保存备用。3、病毒cdna第一链的合成参照东洋纺（上海）生物科技有限公司的改良型高效逆转录酶试剂盒revertraace（trt-101）的说明书进行，所得到的cdna置于-20℃保存。4、pcr的扩增运用8个引物对，使用以下反应体系和反应程序进行扩增：所述扩增反应的体系为10µm的上游引物1.0µl、10µm的下游引物1.0µl、i-52×highfidelitymastermix12.5µl、ddh2o8.5µl。所述扩增反应的程序为94℃预变性2min；94℃变性10s；退火温度下退火30s；68℃延伸2min；循环35次，72℃终延伸10min；所述退火温度对应为各引物对各自对应的退火温度。5、扩增产物的凝电泳（1）琼脂糖凝胶配制称取2.0g琼脂糖粉置锥形瓶中，加入100ml的电泳液，配成2%的琼脂糖凝胶，于微波炉加热使琼脂糖粉充分溶解。然后取出并置于常温水槽中冷却至50℃左右，加入7µlgoldview核酸染料，充分混匀。倒制凝胶，室温下约20分钟后可凝固。（2）核酸电泳，将pcr产物加至凝胶的孔内，另加5µldnamarkerdl5,000作对照。于120v电压下电泳30~40分钟。在凝胶图像处理系统上观察结果及拍照保存。6、扩增产物的回收与纯化：将所有扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯短暂照射下切下目的片段，参照magen公司dna快速回收试剂盒进行回收纯化。7、胶回收产物3’末端加碱基a：由于高保真酶扩增出来的片段为平末端，而普通酶具有在产物3’末端加一个碱基a的特性，由此可以与粘性末端的pta2vector载体连接，从而可以大大提高片段与pta2vector载体连接的效率。具体反应体系见表2。表2为胶回收产物3’末端加碱基a反应体系：反应程序为72℃，30分钟。8、目的片段与载体连接：将3’末端加碱基a的产物进行浓度测定，以125ng的量与载体进行连接，连接体系见表3。表3为连接体系：将反应液于室温（15～25℃）进行30分钟反应。9、连接产物转化感受态细胞：将competentcell（100μl）于冰浴中融解。加入10μl连接液，轻轻混匀后置于冰浴30分钟。42℃，30秒热休克后，冰浴冷却2分钟。加soc培养基900µl，于37℃振动培养1小时。取适量涂于lb板上，于37℃过夜培养。10、重组体的确定：从lb琼脂平板上挑取大小均一、形态圆润的疑似阳性单菌落，通过无菌操作将各个待检菌落挑至含有30µl氨苄青霉素的lb液体培养基的1.5ml的无菌离心管中，移液器吹打均匀成细菌悬浮液，同时以此悬浮液做模板进行菌落pcr鉴定，引物对序列如表1所述。各段基因扩增分别用对应的引物进行扩增鉴定，体系见表4。表4为菌落鉴定pcr体系：2xtaqpcrmastermix10.0μlp1(10μm)0.5μlp2(10μm)0.5μl菌落模板1.0μlddh2o8.0μltotal20.0μlpcr扩增程序：扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，选取能扩增出强且特异目的条带的对应的菌液至含氨苄青霉素的液体培养液中摇菌，菌液送金唯智生物技术有限公司进行测序。11、基因测序结果的处理测序结果利用lasergene7.10生物信息学软件中的editseq软件进行去除包括引物对在内的外向端序列，全长序列的拼接及同源性分析同时，运用ncbi中genbank快速比对工具blast进行测序结果的验证或比对搜索，完成序列与数据库中的已有序列进行比对分析。流行毒株细胞传代第65代病毒orf3基因全序列如seqidno：17所示。序列表<110>华南农业大学<120>一种猪流行性腹泻病毒orf1基因全序列的扩增方法<160>17<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>29<212>dna<213>猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus)<400>1atggctagcaaccaagtcacattggcttt29<210>2<211>29<212>dna<213>猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus)<400>2ggtttaaatgtcgtctcttctaattccac29<210>3<211>29<212>dna<213>猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus)<400>3gagaagtttaaagtcttccttaactgtgt29<210>4<211>29<212>dna<213>猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus)<400>4caacaacaggtttgttgtctgtgacaacg29<210>5<211>29<212>dna<213>猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus)<400>5cacgtagtgttaaggctgttaaagtagaa29<210>6<211>29<212>dna<213>猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus)<400>6atgaaggttatacccttaactttagtcgt29<210>7<211>29<212>dna<213>猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus)<400>7ggaagaaactaggaagtacattatccgta29<210>8<211>29<212>dna<213>猪流行性腹泻病毒(porcineepidemi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