本发明涉及肿瘤生物学领域，特别涉及一种肿瘤细胞中周细胞的分离和仿生培养方法。
背景技术：
周细胞是广泛分布于全身微血管壁的结构细胞，和内皮细胞一起构成微血管和组织间隙的屏障(1)。周细胞通过细胞连接或旁分泌信号与微血管内皮细胞对话，在调控微循环血流量、微血管通透性及血管新生等方面发挥重要作用。此外，在肿瘤组织中，周细胞被证明可以介导内皮成熟和稳定性并减少血管渗漏的功能性细胞。多种疾病的微血管病变伴随周细胞结构和功能异常，周细胞的调控成为研究热点。基于其形态，周细胞经常与血管平滑肌细胞(vsmc)，成纤维细胞，巨噬细胞，甚至上皮细胞的混淆。虽然目前普遍采用与vsmc相同的细胞标记，但并没有特异性抗体标记可以明确识别周细胞。通常应用的细胞标记很大程度上不能成功区分周细胞与其他血管细胞。因此，作为折中的周细胞鉴定方法通常是使用位置、形态学和基因/蛋白质表达模式的综合标准来定义或描述。最近的几篇综述提供了周细胞分子标记的列表。但是，从实际角度来看，并非所有标记都是有用的(2)。同样重要的是，没有单一的完全周细胞特异性标记物是已知的，并且目前使用的所有标记物都在其表达动态，并且可能与发育状态，病理反应，体外培养等一起下调(3)。因此内皮细胞的阴性标记以及两种或更多种周细胞标记物的组合就成为必需。表1提供了目前验证和经常使用的周细胞标记物列表。由于周细胞的形态与成纤维细胞相似，因此很难明确鉴定，目前用于人周细胞的标记抗体(表1)。但是这些抗体都不是周细胞的特异性抗体，它们在其他细胞中(例如：内皮细胞、间充质干细胞、成纤维细胞等)也有表达(4-6)，因此周细胞鉴定是个技术难题。此外，周细胞在培养过程中，容易分化为成纤维细胞，寻找其适宜的环境也是亟待解决的难题。
表1鼠周细胞标记物
参考文献：
1.armulika,genovég,betsholtzc.pericytes:developmental,physiological,andpathologicalperspectives,problems,andpromises.[j].developmentalcell,2011,21(2):193.
2.ozerdem,u.,grako,k.a.,dahlin-huppe,k.,etal.ng2proteoglycanisexpressedexclusivelybymuralcellsduringvascularmorphogenesis.dev.dyn.2001,222,218–227.
3.winklerf,kozinsv,tongrt,etal.kineticsofvascularnormalizationbyvegfr2blockadegovernsbraintumorresponsetoradiation:roleofoxygenation,angiopoietin-1,andmatrixmetalloproteinases[j].cancercell,2004,6(6):553-63.
4.nehlsv,drenckhahnd.theversatilityofmicrovascularpericytes:frommesenchymetosmoothmuscle？[j].histochemistry,1993,99(1):1-12.
5.geraldesp,hiraokayamamotoj,matsumotom,etal.activationofpkc-|[delta]|andshp-1byhyperglycemiacausesvascularcellapoptosisanddiabeticretinopathy[j].naturemedicine,2009,15(11):1298-1306.
6.gerhardth,sembh.pericytes:gatekeepersintumourcellmetastasis？[j].journalofmolecularmedicine-jmm,2008,86(2):135-144.
技术实现要素：
为了克服现有周细胞没有特定抗体标记、难以鉴定的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种通过抗体标记从而鉴定和分离肿瘤组织中周细胞的的方法。该方法是一种基于多种抗体同时标记鉴定、分离纯化周细胞的方法。此外如果在普通培养瓶中培养周细胞，那周细胞将失去其在正常环境下的生长形态，从而分化为其他细胞(比如成纤维细胞)，为了在培养过程中模拟周细胞的生长环境，本发明提供了一种涂层仿生培养。
为了研究肿瘤组织中周细胞是如何促进内皮细胞形成血管的过程，我们首先要从肿瘤组织中提取分离到纯度高的周细胞。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种肿瘤组织中周细胞的分离和仿生培养方法，所有分离操作均在超净台中进行，包括如下步骤：
(1)取新鲜的肿瘤组织样本，用生理盐水冲洗至无血色为止，并除去凝固的血；
(2)将组织剪碎；
(3)将酶解液加入至剪碎后的组织中，然后打碎组织，酶解完后加dmem全培终止反应；所述的酶解液为：包含dmem培养基，1～2.5％(g/100ml)胶原蛋白酶typeⅰ，1～2.5％胶原蛋白酶typeⅲ，1～2.5％胶原蛋白酶typeⅳ和0.5～1.5％的dna酶；设置温度37℃；酶解时间为0.5～2小时；
(4)酶解完后离心，吸去上层脂肪组织，剩余液体加生理盐水重悬，静置，细胞滤网初滤；所述的细胞滤网的孔径为150～200μm；优选为200μm；
(5)离心，弃上清，加生理盐水重悬；用生理盐水润湿过的细胞筛网，过滤细胞；所述的细胞筛网的孔径为70～100μm；优选为100μm；
(6)过滤后的细胞再用细胞筛网过滤；除去滤液，将筛网上层未滤过的细胞移出；所述的细胞筛网的孔径为40μm；
(7)离心，除去上清；加入pbs缓冲液重悬细胞，数细胞；
(8)采用流式分选对周细胞和内皮细胞进行标记并鉴定；选择了10个抗体(阳性标记包括：cd13，cd140b，cd146，ng2，alphasma,；阴性标记包括：cd31，cd34，cd11b，cd140a，cd45)分别作为周细胞的阳性和阴性鉴定；3个抗体作为内皮细胞的鉴定抗体(阳性标记包括：cd31，cd34；阴性标记包括：cd45)；每个反应体系5×105个细胞；避光加入抗体和dapi染料后涡旋混匀，4℃避光反应30～60分钟(优选为60分钟)；每隔15分钟轻弹管壁，以促使其完全反应；孵育后的样品加pbs缓冲液洗两次，离心；弃去上清加入pbs缓冲液进行流式分选；
(9)以制备12ml培养涂层溶液为例，取90～120μl30μg/ml胶原蛋白溶液和20～40μl纤连因子加入到11.84～11.89ml0.1％明胶溶液中，轻微摇晃以铺平板；铺上涂层后的培养板置于37℃培养箱中培养30～60min后，放入4℃凝固16小时以上；在接种细胞之前立即吸出过量的溶液，用少量培养基简单冲洗以中和酸度；
(10)流式分选后的周细胞，加入周细胞培养基pm，置入有涂层的培养板中，37℃培养；注：培养期间不要换液；
(11)培养后通过观察，确定其为周细胞。
步骤(1)中所述的新鲜的肿瘤组织样本是指存放于含1％青链双抗(v/v)和0.2％肝素(v/v)的生理盐水中，冰盒保存4小时之内的样本；
优选的，步骤(3)中所述的酶解液为：包含dmem培养基，1％(g/100ml)胶原蛋白酶typeⅰ，1％胶原蛋白酶typeⅲ，1％胶原蛋白酶typeⅳ和1％的dna酶；酶解时间为1～2小时；
步骤(4)中所述的离心的条件为500g，20℃离心5分钟；
步骤(5)中所述的离心的条件为500g，20℃离心5分钟；
步骤(7)中所述的离心的条件为350g，20℃离心5分钟；
步骤(8)中所述的离心的条件为1200rpm离心4min；
步骤(9)中所述的0.1％明胶溶液的制备是取猪明胶0.4g加milli-q水至400ml，灭菌30min，放至室温后4℃保存。
优选的，步骤(9)中，以制备12ml培养涂层溶液为例，取90μl30μg/ml胶原蛋白溶液和30μl纤连因子加入到11.88ml0.1％明胶溶液中，轻微摇晃以铺平板；
通过本发明的方法成功从肿瘤组织中分离出纯度高的周细胞并对其进行鉴定。并通过仿生培养的方式重现周细胞在体内的生长。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
由于周细胞没有特定抗体标记、难以鉴定。此外，其在组织中含量低(0.5～3％)，如果不能将其分离纯化，在培养过程中很难存活。本发明方法突破了以往只用两种非特异性抗体标记周细胞的方法；首次用10个抗体标记(5个阳性标记，5个阴性标记)针对周细胞进行了分离、纯化和鉴定。并在显微镜下通过形态鉴定(图1)，可以明显看出周细胞在仿生基质培养基中可形成微管，这点符合周细胞的形态特征，为其进一步的功能研究奠定了基础。
附图说明
图1是肿瘤组织中周细胞显微观察。
图2是肿瘤组织中分离纯化的流式分析结果；其中，①ng2；②cd31；③cd45；④cd140b；⑤cd146；⑥alphasma。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施。
实施例1
本发明是用一种新方法对肿瘤组织中周细胞进行分离、纯化和培养的方法，所有分离操作均在超净台中进行，依次包括以下步骤：
1、新鲜的肿瘤组织样本，存放于含1％双抗(v/v，青霉素和链霉素)和0.2％肝素(v/v)的生理盐水中，冰盒保存，并在4小时之内进行酶解分离。
2、将组织置于100mm培养皿中，用生理盐水冲洗至无血色为止，并用镊子除去凝固的血。
3、用灭菌后的剪刀将组织剪碎。注：剪的越碎越好；不能用匀浆仪及刀片，会破坏细胞；冰上操作。
4、酶解液：包含dmem培养基，1％胶原蛋白酶typeⅰ，1％胶原蛋白酶typeⅲ，1％胶原蛋白酶typeⅳ(worthington)和1％dna酶(roche，100×)。酶解完后加dmem全培终止反应。
5、将8ml酶解液用灭菌移液管缓缓加入剪碎后的组织中，用2ml冲洗剩余的组织残渣。将加了酶解液的组织移入gentlemacsctubes(miltenyl)中，注意，组织酶解液混合溶液在ctube中不应超过10ml；如果超过，请分装成两管。在gentlemacsdissociator(miltenyl)中打碎组织，方法选择：h_tumor_01.01ctube，时间30秒。
6、将打碎后的组织置于分子杂交箱(uvp，hb-1000)中，设置温度37℃；酶解时间约为1至2小时，旋转混匀酶解整块组织(包括纤维组织、脂肪组织等)。注：每隔15分钟置于gentlemacsdissociator打碎块状组织。如果不能达到浑浊雾状，需适当延长混匀时间。
7、eppendorf离心机500g，5分钟，20℃离心。用移液管吸去上层脂肪组织，剩余5ml液体加生理盐水重悬，静置5分钟，用200μm细胞滤网初滤。
8、eppendorf离心机500g，5分钟，20℃离心。弃上清至约2ml，加生理盐水至约50ml重悬。用生理盐水润湿过的细胞筛网(100μm)，过滤细胞。
9、过滤后的细胞再用细胞筛网(40μm)过滤。除去滤液，将筛网上层未滤过的细胞(周细胞)移出。
10、350g，20℃离心5分钟，除去上清。加入5mlpbs重悬细胞，数细胞。
11、我们采用流式分选对周细胞和内皮细胞进行标记并鉴定。我们选择了10个抗体分别作为周细胞的阳性和阴性鉴定；3个抗体作为内皮细胞的鉴定抗体。每个反应体系5×105个细胞，50μl。每个单染的细胞分别加5μl抗体。
1)空白组；
2)周细胞peanti-humancd31(货号303106，biolegend)；
3)周细胞peanti-humancd11b(货号101208，biolegend)；
4)周细胞peanti-humancd140a(货号303506，biolegend)；
5)周细胞peanti-humancd45(货号368510，biolegend)；
6)周细胞brilliantviolet510tmanti-humancd34(货号343528，biolegend)；
7)周细胞alphasma-cy3(货号c6198，sigma)。
8)周细胞apcanti-humancd140b(pdgfrβ，货号323608，biolegend)；
9)周细胞apcanti-humancd146(货号556002，bd)；
10)周细胞apcanti-humancd13(货号301706，biolegend)；
11)周细胞fitc-ng2(货号：ab5324a，millipore)；
12)周细胞混染(阳性标记包括：cd13，cd140b，cd146，ng2，alphasma；阴性标记包括：cd31，内皮细胞抗体；cd34，内皮细胞抗体；cd11b，淋巴细胞抗体；cd140a，成纤维细胞抗体；cd45，淋巴细胞抗体)；
13)内皮细胞混染(阳性标记包括：cd31，cd34；阴性标记包括：cd45)
避光加入抗体和dapi染料后涡旋混匀，4℃避光反应60分钟。每隔15分钟轻弹管壁，以促使其完全反应。孵育后的样品加1mlpbs洗两次，离心1200rpm×4min。弃去上清加入pbs进行流式分选。
12、我们通过流式分析仪(型号bdfacsverse，三激光8色)分析的结构周细胞占整个肿瘤组织的3％左右；内皮细胞占7％左右。
13、周细胞涂层制备：
(1)0.1％(w/v)明胶溶液制备：取猪明胶(货号v900863-100g，sigmavetec)0.4g加milli-q水至400ml，灭菌30min，放至室温后4℃保存。
(2)培养涂层溶液：以制备12ml涂层为例，取90μl30μg/ml胶原蛋白溶液(货号：c3867-1vl，sigma)和30μl纤连因子(货号：fc010，millipore)加入到11.88ml0.1％明胶溶液中。轻微摇晃以铺平板。6孔板每孔加1ml；24孔板每孔加0.5ml。铺上涂层后的培养板置于37℃培养箱中培养30～60min后，放入4℃冰箱凝固16小时以上。在接种细胞之前立即吸出过量的溶液，用少量培养基简单冲洗以中和酸度。
14、流式分选后的周细胞，加入周细胞培养基pm(货号1201，赛恩斯瑟尔sciencell)。置入有涂层的6孔板中，37℃培养7天。注：培养期间不要换液。
15、培养7天后通过显微观察，确定其为周细胞(见图1)，实现了周细胞的仿生培养。
16、肿瘤组织中分离纯化的流式分析结果如图2所示，结果可知，周细胞在总细胞中占3％，纯度为80％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。