一种定向聚合的荧光探针PCR的制作方法
本发明属于分子生物学及核酸扩增pcr检测领域，具体涉及定向引物对5’端互补结合、增敏和水解探针3’端聚合、解链的荧光探针pcr技术。
背景技术：
核酸扩增pcr技术是随着现代分子生物学的进步而一起发展、成熟的，早在1953年，核酸dna双螺旋模型及半保留复制开启了现代分子生物学时代及奠定了聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)的基础，甚至khorana于1971年就直接提出了核酸体外扩增的模式：“经过dna变性，与合适的引物杂交，用dna聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆trna基因”。1985年，美国pe-cetus公司人类遗传研究室的karymullis在研究单向核酸测序时产生了核酸扩增的灵感:于试管中模拟天然dna双向扩增的指数复制。提供一种合适的条件---模板dna，寡核苷酸引物，dna聚合酶，合适的缓冲体系，dna变性、复性及延伸的温度与时间，就可以成几何级数地扩增已知两端序列的一段dna分子。经过一系列探索、发展和耐热聚合酶、热循环仪的发明、应用，cetus公司于1987年申请了首个pcr发明专利(uspatent4,683,202)。
pcr技术以其独有的高灵敏度、强特异性、简便快速和纯度要求低的特点而成为生命科学研究的核心基础技术。但传统的pcr(又称为终末pcr)需将产物凝胶电泳检测进行结果分析，传统的pcr由于pcr产物量变异大的局限性，只能检测反应终末产物的定性而不能精确定量，同时也没有解决气雾胶污染、引物二聚体、非特异性扩增等难题，因此传统的pcr结合产物凝胶电泳检测或和印迹方法不适用于临床检验等应用检测。1992年higuchi等首次提出了采用动态pcr方法和封闭式荧光检测方式对目的基因数量进行分析，为解决传统pcr的难题提出了新思路。1996年由美国appliedbiosystems公司推出实时荧光定量pcr技术，所谓实时荧光定量pcr技术(biotechniques1997,22:130-138)，是指实时荧光pcr定量分析是通过实时检测扩增产物量(产物标记荧光强度)与起始靶基因量直接相关而定量。扩增产物量增加的荧光信号达到对数期的循环数ct值(cyclethreshold)与靶模板起始拷贝数的对数存在负相关线性关系。即起始模板稀释一倍达到同样对数期荧光强度所需的扩增循环就要增加一个循环数(ct)。该技术实行完全闭管式操作，避免了传统pcr开盖引起的产物污染问题，减少了假阳性结果的出现，同时也避免了对环境的污染。相比于传统pcr电泳的方法，该技术操作简便，检测结果以更直观的曲线数据展现，从而对样本进行阳性、阴性和可疑的判定，保证了结果的准确性。
实时荧光定量pcr扩增产物增加的信号既可通过染料法来显示，又可采用带淬灭基团的荧光探针法来检测。染料法即在pcr反应体系中，加入适量荧光染料(如sybrgreenⅰ)，荧光染料非特异性地掺入dna双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与pcr产物的增加完全同步。非特异的染料法成本较低，但面临着类似于传统pcr非特异性扩增产物干扰的假阳性问题。探针法即pcr扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团
吸收；pcr扩增时，taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切水解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条dna链，就有一个荧光分子形成，实现荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步。与染料法相比，探针法在一定程度上避免假阳性问题的出现，其特异性有引物和探针双重保证，进一步增加结果的可信度。
被淬灭的荧光探针即可以通过降解而激活，如1995年美国pe公司研制出了taq酶水解的荧光标记探针及实时荧光定量pcr技术(livakkj,etal.,1995,genomeres:4:357-362)，于1997年申请了水解探针(商品名:taqman)pcr发明专利(uspatent6,485,903)，以及epoch公司在水解荧光探针基础上增加小沟结合基团的mgb探针(uspatent7,205,105)。相较于taqman探针，该探针改善了本底信号的干扰，其较短的探针设计不但增强淬灭效果，降低了荧光背景，同时能够较好地区分等位基因，可以检测单核苷酸多态性(snp)。2009年，美国的igorv.kutyavin提出了一种新的pcr检测技术-snake系统(nucleicacidsres.2010,38(5)e29)，该系统通过在一条引物5’端添加一段与该条引物扩增产物探针5’端结合位点前面序列相同的特定碱基片段，使再一次扩增的产物自身3’端能够形成茎环状二级结构，再延伸、水解探针为taq酶5’→3’外切酶活性最佳底物，增强了扩增产物荧光强度。不同于taqman，snake系统可以使用较短的探针来改善荧光背景，在信号的产生和序列检测，尤其是单核苷酸检测方面有较强的优势。
被淬灭的荧光探针也可以通过二级结构改变而激活，分子信标molecularbeacon(tyagis,etal,1996,natbiotechnol14:303-308)正是这样一种茎环或/锅柄样结构的杂交探针，于1999年申请了molecularbeacon发明专利(uspatent05925517)，这一结构使荧光基团与淬灭基团紧密接触，从而有效的解决了taqman较高的背景荧光问题，但产物信号由于淬灭解除不彻底而太弱。其它双杂交(fret)探针，蝎形(scorpion)探针，sunrise-primer，luxpimers等使用范围局限于一定的应用，不明显优于水解探针taqman方法，且与taqman、mgb探针路线、原理不同。目前临床检验使用最广的还是水解探针taqman实时荧光pcr。
然而实时荧光pcr灵敏度仍稍显不够，探针法实时荧光pcr多一道信号转换，每一个产物至多产生一个荧光基团而灵敏度更低一些。检测飞克fg/ml水平或个位数靶分子拷贝需要扩增至38个循环，随后开始出现外侧与内侧引物两步扩增的巢式pcr(jmedvirol,30-2:85)，其采用外侧引物预扩增15-30个循环来提高灵敏度,再加以内侧引物继续扩增25-30个循环以超过40个循环指数扩增的极高灵敏度甚至为单个靶分子检出提供了可能；且随着巢式pcr新反应成份的补充，也推迟了从指数形式或对数期进入所谓“停滞效应”平台期的时间，保持了2n级数的几何扩增效率。然而巢式pcr外侧引物增加了系统复杂性进而增加了两轮pcr非特异性，外引物的残留促进内侧引物非特异扩增，将一般常规引物本底ct值30个循环的非特异性提升至ct值﹤25个循环以前的本底非特异性；巢式或两轮pcr增加的非特异性抵消了第一轮或外侧引物预扩增的放大作用。预扩增需要取出至少稀释20-50倍以上或通过凝胶电泳纯化靶产物以除去外侧引物的影响才能消除系统增加的非特异性，不但增加操作复杂性而且pcr后处理亦带来产物气雾胶交叉污染风险。
常规pcr检测终末反应-平台期扩增产物，一般只需扩增25至30个循环；而实时荧光pcr检测的是对数初期的循环数ct值，taqman等标记探针pcr定量需要扩增40个循环，基于荧光染料sybrgreeni的实时荧光pcr为了检验非特异性本底有时需要增至45个循环。一般pcr反应体系中，既存在引物与靶模板结合的特异性扩增，亦存在过量引物与过量非特异模板，包括引物与引物，或引物与探针等短oligo杂交、延伸的聚合体非特异性扩增；但仅一条引物非特异性远远追不上指数非特异性，只有过量的一对引物3’末端互补延伸才产生指数非特异性扩增。引物二聚体一般借助3’末端多个互补碱基配对、互为引物延伸形成二聚体，引物对之间连续反向互补序列可通过常规引物设计方法避免，但末端有1-2个碱基互补不可避免，由于dna单链可弯曲转向，引物对3’末端1-2个互补碱基虽不够独立形成稳定氢键，但仍可借助引物转向后3’末端外的多个互补碱基包括多个不连续互补碱基的氢键合力而结合，延伸数个碱基后产生稳定的互补序列，进而产生完整的引物二聚体，在随后热循环中以二聚体为模板结合引物大量非特异性扩增、并结合染料。在不加模板的基于染料sybrgreeni实时荧光pcr实验中，绝大多数一对引物产生二聚体的循环阈值(ct值)一般在30个循环左右(janninebrownie,etal,1997,nucleicacidsresearch25:3235-3241)，严重干扰低浓度靶分子定量或误读；还有忽略的是taqman等探针实时荧光pcr亦存在引物二聚体问题，引物二聚体虽不直接干扰taqman探针结合，不见引物二聚体发射荧光，但其竞争性地消耗pcr试剂成份包括引物、聚合酶、酶底物等，显著竞争性抑制低浓度靶特异扩增效率，进一步降低taqman探针实时荧光pcr检测灵敏度。
taqman等探针实时荧光pcr反应中，过量的一对引物还会与过量的较长探针杂交聚合，首先产生两种引物与探针序列杂交、部分延伸的不完整二聚体，两种不完整二聚体再在pcr热循环反应中互为引物而杂交、延伸并被大量非特异性指数扩增，产生带部分探针序列的“引物-部分探针-引物”聚合体。一般探针序列两末端的标记率均只有70％-80％左右，剩余20％的3’末端羟基游离的探针oligo会直接与两种引物3’末端杂交、延伸并大量指数式扩增，产生非特异性扩增的“引物-探针”聚合及假阳性反应(夏乾峰.二聚体突变引物定量pcr技术的研发及其临床应用[d].重庆医科大学,2011.)。在不加模板，任意一对引物与taqman探针的本底荧光pcr均产生约ct值33～35个循环的非特异性扩增曲线，且随着反复重复同一pcr扩增,其扩增平台期荧光吸收峰值越来越高,本底ct值也逐渐前移，产生一定的样本检测假阳性。部分探针序列的二聚体、三聚体会与特异性靶分子竞争探针，反而减弱其5’端标记荧光基团水解，降低系统检测灵敏度或弱阳性标本不被检出、多重聚合扩增加了系统复杂性。
taqman—分子信标的创新，一定程度上解决了基线荧光问题，但其首尾端直接杂交反而干扰探针5'水解特性，也没有杜绝引物与探针的聚合现象(孔德明等,2003,化学学报,755-759)。鉴于荧光探针pcr对单分子检测灵敏度明显不够，目前增敏法有限、需要增加预处理步骤；同时又受制于引物-引物、引物-探针聚合非特异性干扰、抑制，甚至内标系统、多重荧光探针pcr极其复杂的多重聚合非特异性。为了控制或消除这些不确定的多种聚合复杂性，本专利“一种定向聚合的荧光探针pcr”采用靶序列特异引物、探针设计，同时增设人为定向的引物添加5'端反向互补序列；荧光探针3'加长末端与探针中部反向两-两自身互补；使引物、探针除与靶序列特异强力杂交外，稍弱的定向各自互补、结合而排除不确定的胡乱聚合杂交。引物5'端序列互补的pcr扩增，带来扩增产物间末端互补，靶产物3'末端还可以互为模板、互为引物而增加扩增效率，以＞2n级数放大策略而增敏；另一面引物自身5'端互补不会延伸反而削弱了原引物对3'末端间的聚合非特异性；荧光探针5’端同taqman探针标记荧光基团，仅3'末端添加一段与其中部反向互补碱基再标淬灭基团，探针类似分子信标3'末端与自身中部结合，淬灭基团与荧光基团自身互补更加靠近一起而抑制了发光，不仅降低基线水平也减少与引物聚合的非特异性。以及a结尾引物、探针联合udg和矿物油封闭来彻底杜绝引物二聚体及产物气雾胶非特异性扩增。
参考文献信息：
[1]khoranah.g.,etal.j.molec.biol.,1971,56(2):341-361.
[2]sykesp.j.；etal.,1992,biotechniques,13:444-449.
[3]livakkj,etal.,1995,genomeres:4:357-362
[4]ivkutyavin,nucleicacidsres.,2010,38(5)e29.
[5]tyagis,etal,1996,nat.biotechnol,14:303-308
[6]wittwer,c.；etal.,1997,biotechniques,22:130-138.
[7]browniej.,etal,1997,nucleicacidsres.,25(16):3235-3241.
[8]夏乾峰.二聚体突变引物定量pcr技术的研发及其临床应用[d].2011,重庆医科大学.
[9]孔德明等.2003,化学学报,755-759.
技术实现要素：
多聚酶链反应pcr指数扩增或几何级数放大带来检测超级灵敏度，但对数个甚至单个分子检出仍显灵敏度还不够，荧光探针pcr加一道探针转换信号虽提高了特异性反而损失一倍量级灵敏度；同时又限制于引物-引物、引物-探针聚合非特异性干扰、抑制，甚至内标系统、多重荧光探针pcr极其复杂的多重聚合非特异性。同时指数或几何放大亦带来本底引物二聚体pd及复杂非特异性扩增，小分子pd/pcr产物气雾胶二次污染再扩增，实时荧光pcr“闭管”操作并不密闭，即使矿物油密闭pcr反应情况下油层面上残留微量反应指数扩增也是难以克服的泄露污染源；线性检测常规领域一些思维、观念也不适用于指数放大范畴。
本专利“一种定向聚合的荧光探针pcr”，其特征是引物、探针特异序列基础上设置定向的引物对5’端互补结合、增敏和荧光探针3’尾定向聚合、解链pcr，引物设计采用对侧原引物5'端5-10b反向碱基序列，按5'-3'方向加至引物对前面，形成“5'反向互补序列”嵌合引物对而定向聚合，借助5'互补使扩增产物3'尾也互为模板、互为引物扩增，以＞2n几何级数放大而增加灵敏度和竞争降低引物3'二聚体pd非特异性，还可以减少扩增反应循环数；常规水解荧光探针3'末端添加与探针中部反向互补的5-8b尾序列，形成两探针分子间借尾部-中部两处靠近的相互杂交而定向聚合，探针分子两端荧光素-淬灭基团靠近而降低反应基线荧光，中部互补区离5’端远近可调整扩增基线高低，探针自身聚合还抑制与引物间聚合非特异性；一旦长序列靶分子链竞争杂交引物、探针链，相对结合力弱的两两聚合引物对、探针解链而结合靶分子模板进行扩增、探针被聚合酶水解产生荧光。
所述的“一种定向聚合的荧光探针pcr”，其特征在于，采用较短的5-7b对侧原引物5'反向序列作为添加人工序列加至相对引物前面，人工添加的序列与原引物序列间插入一短4b序列限制酶切位点，使扩增产物酶切后长度一致以便于电泳检测，同时预设的限制酶切+udg酶解措施以防止扩增产物交叉二次污染。
所述的“一种定向聚合的荧光探针pcr”，其特征在于，所述的引物联合采用中部6-8个碱基同序的引物对以进一步减少引物二聚体pd程度/推后引物二聚体本底扩增ct值，从而间接减少pd对靶扩增的竞争性抑制，提升系统灵敏度。
所述的“一种定向聚合的荧光探针pcr”，其特征在于，所述的荧光探针是指模板序列探针5'端标记荧光素且在pcr中可被dna聚合酶的外切酶活性水解，探针3'末端添加与其中部反向互补的5-7b碱基，最末尾额外加一个a碱基结尾，尾a之后再标记淬灭基团；后加3'尾与中部反向互补序列之间变一个碱基为“反义”碱基，包括2'-fluororna、2'-o-methylrna、2'-o,4'-c-methylenebridgerna(lna锁核酸)；阻止漏标记的探针3'末端非特异聚合延伸，两两探针加尾与其中部预设互补区两段杂交而定向聚合；不仅加强抑制基线荧光，也规避了探针与过量引物间杂交非特异性。
所述的“一种定向聚合的荧光探针pcr”，其特征在于，所述的引物设计在常规引物选取基础上修改和增补一些减少本底、5'端定向互补引物设计原则：
1)选取一对靶特异性(保守)基因跨度100-300bp两端序列18-24个核苷酸碱基长度作为上下游引物且3'末端间不能有连续反向互补；
2)选取靶基因跨度300bp以内6-8b“倒置重复”置于一对引物离3'端2-6个碱基以外的中部作为中部同序引物；
3)5'端反向互补—采用5-8b对侧原引物5'反向序列作为添加人工序列加至相对引物前面，人工添加的序列与原引物序列间插入一短4b序列限制酶切位点；
4)一对引物的3'最末碱基选择a/ac结尾使扩增产物对应du位于二聚体的原引物连接中间处；不要选氢键强“错配”多的g结尾,亦尽量不选氢键弱/特异性差的t结尾,更不要采用重复双gg/tt结尾。
所述的“一种定向聚合的荧光探针pcr”，其特征在于，所述的探针设计在遵守一般常规荧光探针设计原则基础上的定向聚合荧光探针设计原则:
1)首先选取靠近一端引物但序列不重叠的一段小于35nt的靶荧光探针序列但tm值比引物tm值要高10℃以上，且探针5'端不能是g碱基；
2)探针5'端完全同taqman水解探针，可选择标记荧光素fam，hex、joe、vic或tet，rox/texas-red，cy5；
3)探针3'末端添加与其中部反向互补的5-7b碱基作为人工定向聚合3'末尾；
4)探针3'最末尾额外再加一个a碱基结尾，尾a之后再标记淬灭基团tamra(6-羧基-四甲基-罗丹明rhodamine)、bhq1或dabcyl；
5)后加3'末尾至中部需变一个碱基为反义“死”碱基，其保留watson配对杂交性能而失去扩增模板和引物聚合作用,包括2'-fluororna、2'-o-methylrna、2'-o,4'-c-methylenebridgerna(lna锁核酸)；“反义”碱基、不互补a结尾、3'最末淬灭基团封闭三重设置阻止漏标记的探针3'末端非特异聚合延伸。
根据以上所述的“一种定向聚合的荧光探针pcr”，其特征在于，所述的改良mgb荧光探针，缩短模板杂交序列的探针5'端标记荧光素并被taq酶水解，mgb3'末端变一个反义“死”碱基如：2'-o-m-rna/2'-f-rna后加一个额外a尾，尾a标记非荧光淬灭剂nfq再加一dna小沟结合分子，促进探针与模板紧密结合，小沟结合分子也阻碍其3'末端非特异性聚合；非荧光淬灭作用强而降低本底荧光背景，同时能够较好地区分等位基因，可以检测单核苷酸多态性(snp)。
所述的“一种定向聚合的荧光探针pcr”，其特征在于，所述的引物使用浓度为3-5μm为40×倍浓度，荧光探针相应地减半浓度/用量2-3μm为40×倍浓度，随不同样本最低浓度检测要求及系统本底值而调整最佳的引物、探针使用浓度。
所述的“一种定向聚合的荧光探针pcr”，其特征在于，pcr反应液添加含甜菜碱(betain)和聚阴离子多聚磷酸(ppa)通用pcr增效剂，双向增强靶扩增效率和抑制引物二聚体pd非特异性扩增。
所述的“一种定向聚合的荧光探针pcr”，其特征在于，所述的pcr反应液加矿物油代替使用热盖，封闭pcr反应液条件下，采用一侧引物与探针含10％蔗糖分层延时释放-热混匀、启动pcr以减少气雾胶产量或产生无效扩增气雾胶。
所述的“一种定向聚合的荧光探针pcr”，其特征在于：为防止靶分子气雾胶造成微量污染试剂，pcr试剂成分/各组份混合前还加入0.2％-2％v/v大肠杆菌udg酶，加入不影响靶扩增的稀浓度0.1％-1.0％(v/v)靶序列限制内切酶2种或以上混合酶液，利用pcr成分混合前室温rt0.5-2小时—或37℃二十分钟至四十分钟酶切消化靶模板分子交叉污染。
所述的“一种定向聚合的荧光探针pcr”，其特征在于：pcr用水和缓冲液使用便宜的化学法替代酶法消化污染,新鲜纯化水采用加0.1‰-0.2‰(v/v)即万分之一、二稀释的10％次氯酸钠液室温1-2天消化污染dna，再开盖煮沸除去次氯酸钠；10×taq缓冲液加0.05‰-0.1‰(v/v)外切酶exoiii冷藏待用。
所述的“一种定向聚合的荧光探针pcr”，其特征在于，使用物理空间隔离的密闭独立配液、加样、扩增室，于独立配液室混合所述pcr试剂成分/组分,并在分隔的加样室进行样本dna纯化及加样,加样使用过滤芯吸头及用后丢入次氯酸钠废液内，实验室定期用纯的1-2％次氯酸钠消化、清洁后使用，实验前后用紫外灯和臭氧轮换消毒。
所述的“一种定向聚合的荧光探针pcr”，其所述的荧光探针pcr方法操作步骤如下：
1)每个pcr反应管中先加入2μl所述含蔗糖的缓释引物+探针于管底；
2)混合其余pcr反应试剂，并吸取反应混合液18/28μl于pcr反应管管壁中部；
3)沿pcr管管壁上部加入40μl矿物油，瞬时离心，可置37℃至多20-40分钟；
4)加20/10μl提取样本的dna溶液、定量标准品、阴性对照品或阳性对照品于矿物油层表面下，加样吸头采用过滤芯吸头，每一管换一吸头；
5)避免混匀，以免破坏缓释层，盖紧pcr反应管管盖，高速短时离心，尽快或立即进行pcr反应，热变性混匀缓释层而启动pcr，扩增35-40个热循环。
综合所述的“一种定向聚合的荧光探针pcr”，其特征在于，所述的pcr用于基因检测试剂盒，盒成份包括：核酸提取试剂，5mmdntps及dutp，taqdna聚合酶及其10×缓冲液，荧光探针，上游引物f/下游引物r，标准品对照物，通用pcr增效剂，纯化水dh2o，矿物油；或增设内标引物对、内标荧光探针。试剂成分/组分预先加入0.2％-2％v/v大肠杆菌udg酶，加入不影响靶扩增的稀浓度靶序列限制内切酶0.1％-1％v/v1-2种或以上混合液，利用pcr试剂配液时酶切消化核酸分子交叉污染，pcr热变性灭活预置酶。
实时荧光pcr定量分析是pcr时同步于固定循环时间点上检测扩增产物量(产物指示荧光强度)与起始靶基因量直接相关而定量。扩增产物量增加的荧光信号达到对数期的循环数ct值(cyclethreshold)与靶模板起始拷贝数的对数存在负相关线性关系；即起始模板稀释一倍达到同样对数期荧光强度所需的扩增循环就要增加一个循环数(ct)。实时荧光扩增曲线是以实时检测到产物结合探针产生的荧光强度为纵坐标，扩增热循环数为横坐标，实时荧光强度随反应循环进行所做的动力参数曲线；由于荧光探针扩增最初1-3个循环荧光不稳和增敏提前5个循环，故pcr仪设定扩增初始3-10个循环荧光值曲线作为本底基线，定义以基线荧光强度的10倍标准差为阈值，当荧光强度达阈值时的循环数为ct值。以一系列倍比稀释的已知浓度梯度标准品校正待测样本dna定量，以起始拷贝对数值为纵坐标，ct值为横坐标做绝对定量校正曲线。
水解探针taqman是一种实时荧光pcr检测寡核苷酸探针，它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对并尽量靠近一端引物，但又不重叠(间隔一个碱基以上)的一段寡核苷酸(总长<40nt)，其5’末端标记报告荧光基团，淬灭剂tamra(6-羧基-四甲基-罗丹明rhodamine)则连接在3’末端。当探针完整时，通过
本专利“一种定向聚合的荧光探针pcr”不仅继承了pcr的指数放大、灵敏度高的优点，荧光探针特异序列还绕开了引物二聚体扩增的主要非特异性，增加了一份精准杂交的可靠性。除可采用外标准浓度梯度扩增曲线绝对定量，也可以使用目标管家基因同步/同时作为内标准品而间接靶分子定量；由此推广使用不同波长荧光标记探针可进行多重荧光pcr；以及单个碱基的点突变探针做单核苷酸snp多态性分析，或亚型分型测定。但荧光探针pcr扩增产物信号多一个(道)探针转换-水解荧光基团信号而有所损失，且每一个分子扩增产物至多仅产生一个水解荧光基团，探针法荧光信号明显弱于染料法荧光pcr数十倍至上百倍，最终探针法灵敏度较染料法荧光pcr还低一倍量级。对于一些单分子/个位数分子检测及倍比稀释法数字化绝对定量，目前荧光探针pcr灵敏度显得明显不够；另一方面，荧光探针pcr多了过量的长链探针，内标引物、探针，多重引物及探针，过量过多条寡核苷酸dna不确定的引物-引物、引物-探针聚合非特异性干扰、抑制，甚至内标系统、多重荧光探针pcr系统复杂的聚合非特异性诸多乱象导致荧光探针pcr质量难以控制。
本专利“一种定向聚合的荧光探针pcr”，采用定向“5'端互补”引物增敏降非特异性；一对“5'端互补序列”引物设计采用一侧(如下游)引物5'原本/自身5-10b反向互补序列作为“人工序列”按5'→3'方向添加到对侧(上游)引物5'前面，反之，对侧引物5'端一段反向“人工序列”加到一侧引物5'前面，产生一对嵌合引物。在引物5'端添加的5-10b反向“人工序列”与对侧引物自身原5'端小段反向互补，这样新生成的“5'端互补序列”包括后加的对侧引物原5'反向“人工序列”+原引物5'自身序列，引物与“5'端互补序列”共用了一段引物原5'自身序列，两侧嵌合引物新5'一半即“5'端互补序列”自然两两间反向互补；从而5'端反向互补引物可设置长约30base左右。(引物5'端添加人工序列一般不影响pcr扩增)，以一对“5'端互补序列”嵌合引物pcr，一对新复制链3'末端间对应地也互相间互补；扩增产物3'末端不仅为后续循环结合引物的模板，扩增产物3'末端人工序列间也可以互为模板、互为引物结合、指数扩增；比单纯的一对引物指数扩增多了产物间的互相扩增，或逐步增加的3'末端互补产物弥补了pcr进程中引物消耗，放大效率超过＞2n指数或几何级数，实现增强pcr扩增灵敏度；也象snake技术一样增加扩增产物荧光强度。另一面引物“5'端互补序列”略短于引物-靶结合序列而不影响特异扩增，定向自身5'端反向互补不会延伸反而抑制了原引物3'末端间的聚合非特异性，排除不确定的引物-引物、引物-探针杂乱聚合。
在添加人工序列较短如5-7b情况下，人工后加的序列与原引物序列间还可插入一短4b序列限制酶切位点，使扩增产物酶切后长度一致以便于电泳鉴定，同时预设限制酶切+udg酶解措施还可以防止扩增产物交叉污染。荧光pcr非特异性不仅来自内源pd产生，外源pd产物气雾胶再污染也产生干扰、相互影响。由于尿嘧啶-dna糖基化酶udg酶解普通引物二聚体pd的缺/脱du产物仍是引物结合模板，或非a结尾引物二聚体酶解pd“碎片”带互补碱基更易聚合而无效；所以采用引物3'a结尾对应du位于二聚体引物连接处，其pd产物中间脱du处既缺碱基可配对又无模板可复制而使外源气雾胶pd失去模板作用。
荧光探针设计在taqman基础上，综合水解荧光探针taqman和借鉴分子信标molecularbeacon自身杂交原理并将杂交区移至中部，随扩增产物杂交而解链的taqman荧光探针技术。探针3'末端添加与探针中部反向互补的5-7b碱基，最末尾额外加一个a碱基结尾，腺嘌呤a之后再标记淬灭基团；人工加尾碱基至3'最末a序列须变一个碱基为反义“死”碱基，其保留watson配对杂交性能而失去扩增模板和引物聚合作用,包括2'-fluororna、2'-o-methylrna、2'-o,4'-c-methylenebridgerna(lna锁核酸)；“反义”碱基、不互补a结尾、3'最末淬灭基团封闭三重设置阻止漏标记的探针3'末端非特异聚合延伸；探针加尾与自身中部预设互补区或两两探针预设互补间定向聚合、杂交，中部杂交区与5’端远近决定扩增基线高低。荧光探针5’端同taqman探针标记荧光基团，利用taq酶5’-3’外切酶活性水解与靶序列杂交的探针而切割释放报告荧光基团；仅3'末端添加5-7b与其中部反向互补序列再标淬灭基团，一方面探针3'添加的结尾类似分子信标折返与自身中部预设互补区分子内局部杂交；另一面杂交较短使自身较难形成锅柄样结构，一探针3'添加的结尾与另一游离探针中部反向互补，反过来其中部也与另一游离探针3'加尾杂交形成更稳定的分子间两两结合杂交，两探针间两段结合力大而更容易稳定结合；这样不仅使淬灭基团与荧光基团互补靠近一起加强抑制本底荧光，也规避了探针与过量引物间形成非特异性杂交延伸的聚合体，兼容了molecularbeacon基线/本底荧光低和taqman水解释放出荧光基团而不受淬灭基团近距离干扰的优点。
下面再以卡通图形象地描述引物、探针特异结合模板与各自定向聚合的竞争关系。原理图1示意引物结合模板指数扩增并借助5'端互补使产物3'尾也互为模板、互为引物扩增，增加灵敏度、降低非特异性的机理。以长线条代表靶模板dna双链，短箭头代表上游、下游原引物，箭头指示3'端及延伸、合成方向；斜向5'端碱基字母代表与靶模板不杂交的人为添加的“5'端互补序列”，(此处字母只是示意“5'互补”状态，而不固定特指现在表示的碱基)。“5'互补序列”采用对侧原引物5'端5-10b反向碱基序列，按5’-3’方向加至原引物前面；形成“5'反向互补序列”嵌合引物。嵌合引物3'端靶结合段杂交后延伸、复制链以虚线表示，两分子产物间不仅5'端(字母端)是反向互补的，对应的新合成复制链3'端(虚线端)间也是反向互补，互为模板、互为引物热循环扩增，无需游离引物而产物自身也指数扩增。
卡通图2示意一种能两两分子定向自身聚合的taqman水解探针，随着特异模板和扩增产物竞争结合而解链、水解而产生荧光。原探针加一小段与自身中部互补的尾序列使两两探针间杂交使尾端淬灭基团更加靠近5'端荧光基团，不仅增强淬灭作用降低基线荧光强度，也减少探针与引物间聚合非特异性。两端带圆环—黑点的粗长线代表探针，空心圆环示意5'首端荧光基团，实心黑点代表3'尾淬灭基团；探针主要序列包括5'端碱基与靶模板序列完全互补，探针3'端折弯线代表不与靶模板杂交的尾序列；利用添加的5-7b尾与探针中部反向互补序列，形成两探针分子间一尾部与另一探针中部互补结合，同时其中部又与另一尾部杂交的两处靠近的互补杂交而定向聚合，一旦长链靶分子竞争杂交探针链，较弱的两两聚合探针解链而结合靶分子被聚合酶水解产生对应荧光。
实时荧光探针pcr虽然采用探针绕开了主要的引物二聚体扩增，本发明引物、探针各自定向聚合进一步削弱了引物二聚体、引物-探针聚合非特异性。但任何一丁点非特异性产物甚至标准品质粒、纯化样本dna游离分子都会产生气雾胶交叉污染，这在常规线性放大检测可以忽略；而分子一旦进入pcr扩增109-12指数放大污染就失控了，这导致宏观世界观念及常规线性放大检测惯性思维阻碍了从分子水平杜绝污染。荧光pcr非特异性不仅来自内源一对引物3'末端聚合pd产生，外源pd产物气雾胶反复污染也产生干扰、相互影响，内生pd非特异性之源不消除就难以杜绝产物气雾胶,反之外源气雾胶不控制也无法研究内源pd非特异性。由于尿嘧啶-dna糖基化酶udg酶解普通引物二聚体pd的缺/脱du产物仍是引物结合模板，或非a结尾引物二聚体酶解pd“碎片”带互补碱基更易聚合而无效；以及产物气雾胶极其过量情况下酶解反应还做不到100％百分百有效；所以采用引物3'a结尾使产物对应du位于二聚体的原引物连接中间处，udg酶解引物末端a对应pd产物中间脱du处既缺碱基可匹配结合又无模板可复制使引物延伸，所以udg酶对a/a结尾引物的二聚体产物才有效。联用矿物油密闭pcr条件下采用一成分如一条引物含10％蔗糖分层以延时缓释—热混匀启动以减少气雾胶产量或气雾胶缺完全成分为无效扩增，如此简单一步确是分子水平彻底解决指数放大交叉污染的最有效必要手段，矿物油层不会影响荧光光路或荧光强度。
实验室气雾胶污染除小分子pd主要污染源，还包括纯化靶dna游离分子尤其定量标准品质粒也是分子水平污染源，使用普通滤膜是过滤去除不了的，容易交叉污染pcr试剂；放置的纯化水也易融溶气雾胶分子；并随冰箱冻存而长期污染。为防止这类气雾胶交叉污染，生产pcr试剂必须无菌无核酸环境，新鲜纯化水配制试剂成分/组分预加入0.2％-2％v/v大肠杆菌udg酶；﹙加入不影响靶扩增的稀浓度靶序列限制内切酶0.1％-1％v/v1-2种或以上混合液﹚，利用pcr试剂分装时酶切消化核酸分子交叉污染。大量pcr用水还可加0.1‰约万分之一体积的次氯酸钠原液(10％)长时间消化，高压消毒/煮沸除去次氯酸钠；配制10×taqbuffer缓冲液加0.05‰-0.1‰体积的外切酶exoiii。应用检测时必须配液、加样、扩增分隔独立空间，pcr配液混合至加样前可置室温30-60分钟利用预置酶切消化分子污染；加样后即pcr热变性灭活预先加入的预置酶。
初期pcr多用矿物油密闭渐渐被仪器热盖所代替，然而荧光pcr热盖“闭管分析”情况下并不完全密闭，大多数0.2mlpcr试管或96孔板，在热循环95℃变性时，高温高压下会有一些气雾胶沿热软化的管盖边缘溢(挤)出，一个气雾胶颗粒就含有106个分子拷贝,气雾胶不仅含高浓度已扩增阳性靶分子，更多的是过量一对引物间产生的小分子引物二聚体pd扩增,几乎每一个检测反应管/孔都会产生pd非特异性指数扩增,且小分子pd扩增产物气雾胶再污染仅靠过滤、gmp是隔绝不了的。随着重复同一pcr，泄漏的污染物会得到反复地指数扩增、积聚，随后的实时荧光pcr不是从0循环开始而是从上次pcr结束循环数开始，更禁不住反复pcr放大，污染物越积越多；产物气雾胶不仅污染实验室环境也进入一切开盖的试剂包括实验用水中,随试剂冷藏而长期保存；一对引物pd产物污染也于30ct/循环非特异性扩增,经反复pcr而逐渐提前。矿物油联合使用热盖时，在反应的过程中，矿物油表面的残留反应液不被蒸发至热盖而继续残留在矿物油表面，随着反应条件的变化，也会经历循环的过程，产生较多的含有扩增产物的气雾胶。而不使用热盖时，矿物油表面的残留液会蒸发至管盖，离矿物油下面的反应液较远，其较低温度易退火但不易热变性而无扩增，产生的气雾胶也较少。所以，在实时荧光定量pcr检测时，pcr反应液加矿物油代替使用热盖，封闭pcr反应液条件下，采用一侧引物与探针含10％蔗糖分层延时释放-热混匀、启动pcr以减少气雾胶产量或产生无效扩增气雾胶。但发射光源位于顶部管盖的仪器必须矿物油加热盖，因为矿物油表面的残留液蒸发至管盖冷凝液会一定程度阻档光路。
本专利“一种定向聚合的荧光探针pcr”引物设计原则：
在目前引物选取原则基础上，(1)一般选取靶特异性(保守)序列18-24个核苷酸碱基长度,上下游引物长度差别不能大于3base碱基,两者tm值相差不能大于5℃,上下游引物跨度以100-300bp为宜；(2)g+c含量应在40％-60％,4种碱基分布/配要均匀,避免出现4个以上碱基同一重复、序列反向重复(发夹结构)、和序列简单重复的二级结构；(3)一对引物间不能有3base或3base碱基以上的连续反向互补,特别是引物间3'末端的反向互补；(4)引物的3'末端碱基,尤其是最末和倒数第2个碱基应正确与靶配对,尽可能使每个引物的3'最末碱基为g/c,但不能为nncg或nngc末端(所谓cg/gc夹),亦不能为特异性差的t结尾。
现有引物选取原则还存在一定的认知差别而需要修改和增补一些新的减少本底、定向互补细则：1)中部同序—选取靶基因跨度100-300bp以内6-8b“倒置重复”置于一对引物离3'端3-5个碱基以外的中部；2)5'端反向互补—采用5-8b对侧原引物5'反向序列作为添加人工序列加至相对引物前面，人工添加的序列与原引物序列间插入一短4b序列限制酶切位点；3)一对引物3'末端倒数第1或第2位碱基选择a结尾使产物对应du位于二聚体的原引物连接中间处，尿嘧啶-dna糖基化酶udg酶解引物末端a对应pd产物中间脱du处缺乏复制模板碱基而无法pd扩增；4)每个引物的3'最末碱基最好选择a/ac结尾,既不要选氢键强“错配”多的g结尾亦不要选氢键弱/特异性差的t结尾,更不要采用重复双gg/tt结尾。
taqman探针设计尊循以下一般原则：
在现有探针选取原则基础上，(1)探针的tm值比引物的tm值要高10℃以上；(2)探针5'端不能是g碱基，被酶切降解的g仍具有淬灭报告荧光作用；(3)探针中的g不能多于c；(4)避免单一核苷酸成串,尤其是g；(5)探针退火时，其5'端应尽可能接近引物，同时又不重叠，离引物的3'端至少一个碱基远；(6)探针的3'端必须淬灭剂封闭以防止pcr扩增时延伸。定向聚合的探针还必需增补一些新原则：1)探针3'末端添加与其中部反向互补的5-7b碱基；2)探针3'最末尾额外再加一个a碱基结尾，尾a之后再标记淬灭基团；3)后加3'尾部序列需变一个碱基为反义“死”碱基，其保留watson配对杂交性能而失去扩增模板和引物聚合作用,包括2'-fluororna、2'-o-methylrna、2'-o,4'-c-methylenebridgerna(lna锁核酸)；“反义”碱基、额外不互补a结尾、3'最末淬灭基团封闭三重设置阻止漏标记的探针3'末端非特异聚合、延伸。
本专利“一种定向聚合的荧光探针pcr”，首先需要确立有效的试验方法工具及试验出各种定向聚合的引物、荧光探针pcr实验条件与作用范围；荧光水解探针pcr本身就是测试荧光探针pcr及定向聚合荧光探针pcr条件、范围的锋利工具，利用试验目的或目标pcr成分变化及不同试验条件可试验确立荧光pcr条件及边界范围。采用上海生工生物工程有限公司dntps，taqdna聚合酶，合成的荧光探针，上游引物/下游引物等pcr成分配制pcr反应液，于上海宏石slan-96p实时荧光pcr仪进行35-40个热循环94℃变性20秒、58°-62℃退火、延伸40秒两步热循环荧光探针pcr反应，并对实验结果进行分析。
以下配方为标准程序定向聚合的荧光探针pcr反应液配制方法，单次(/个)反应为pcr各成分浓度及配制加入量,缓释引物含重比重10％蔗糖，配方10次/×10倍反应便于一组试验反应液计算配制，相对应的单次(/个)反应25倍或50倍体积pcr成分为试剂盒组分。
※10×taqbuffer：0.6mtris-cl(ph8.3),100mmkcl,50mm(nh4)2so4。
缓释引物+探针﹦1.0体积4μm引物+﹙0.5体积4μm探针+0.5体积20％蔗糖﹚混匀。
本探针法荧光pcr以一系列标准品dna梯度稀释液和待测靶分子样本纯化dna液20/10μl体积分别加入一组标准40μl反应体系荧光pcr，也可以加入水代替扩增模板来测试无靶模板的pcr体系引物二聚体pd本底及影响本底扩增情况。
按以下次序加样,
(1)每个pcr反应管中先加入2μl缓释的引物+探针于管底(不必换吸头)；
(2)加入18/28μl余下反应混合液于pcr反应管管壁中部(小心不必换吸头)；
(3)再沿pcr反应管管壁上部小心加入40μl矿物油,瞬时离心，可置rt/37℃至多60分钟；
(4)最后加入20/10μl提取样本的dna溶液/定量标准品/阴性对照品/阳性对照品于矿物油液面下(用过滤芯吸头，每一管必须换一吸头,用后吸头丢入5％次氯酸钠废液缸内，密闭)；
(5)不要混匀，以免破坏缓释层，盖紧pcr反应管管盖，瞬时高速离心，立即/尽快进行pcr反应，热变性混匀缓释层而启动pcr，扩增36个热循环。
仪器标准pcr程序设置：首先进行94℃变性3-5分钟后，再运行35-40个热循环94℃变性20秒,58°-62℃退火、延伸40秒并读取荧光值；或35-40循环94℃变性20秒,54℃退火10秒、60℃延伸35秒并读取荧光值的油封闭pcr无热盖扩增。为特殊试验目的如测试优化引物pcr本底可增加热循环次数。仪器基线设定在初始的3-10个循环以避开增敏后前移5个循环的检测窗口，以基线荧光值的10倍标准差定为阈值，荧光达阈值的循环数为ct值。样本ct值小于30个循环为阳性，大于32循环为阴性；ct值介于30-32灰区的样本复测。以下采用实例一引物、探针序列预先测试定向聚合探针pcr实验条件与作用范围：
常规hbv引物如下：
hbvf:5'-aatgcccctatcttatcaac-3'
hbvra:5'-agattgagatcttatgcgac-3'
定向5'互补引物对序列如下：
5’thbvf:5'-tcaatctccggaaatgcccctatcttatcaa-3'
5’thbvra:5'-ggcatttccggagattgagatcttatgcgac-3'
(粗黑体字母代表限制酶hpaii位点，细线字母代表hbv序列，下划线部分为同序)，及常规探针和定向3'互补探针如下：
taqmanhbv:5’-fam-cgtctgcgaggcgagggagttcttcttctaa-bhq1-3’
解链tqmnhb:5’-fam-cgtctgcgaggcgagggagttcttcttctccc/i2omet/ca-tamra-3’
(粗黑斜体字母与下划线部分代表两探针间反向互补，/i2omet/为反义碱基)，
按以下简表快速配制×n次单个pcr反应混合液，×n代表单次乘上所有pcr反应管数目或总检测数目。这次测试10次反应：以下游引物r+探针作为缓释引物探针，其配1.0×体积4μm引物+﹙0.5×体积4μm探针+0.5×体积20％蔗糖﹚混匀。依次每管加2μl缓释引物探针、28μlpcr反应液、40μl矿物油，最后分别加标i-标vi样品10μldna于油层下，瞬时高速离心后即刻荧光pcr。首先进行94℃变性3分钟后，再运行36循环94℃变性20秒,54℃退火10秒、60℃延伸35秒并读取荧光值的油封闭pcr无热盖扩增。
测试引物5'定向聚合的荧光探针pcr检测窗口/范围边界最大值、最小值的增敏效果，采用引物5’thbvf/5’thbvra荧光taqmanhbv探针pcr测定phbc(3.36kb，分子量mw＝2.1×106，计1μg＝2.8×1011copy分子)质粒标准品10×倍稀释梯度标i(10ng/ml)、ii、iii、iv、v和标vi(0.1μg/ml×10-6)；对比常规引物hbvf/hbvra荧光taqmanhbv探针pcr测标i和标vi。因5'反向互补的引物由于其随扩增逐渐增加的扩增产物末端弥补了引物消耗，5'定向互补引物荧光pcr所需引物量较常规pcr略少，仅3-5μm(作为40×，终浓度0.1μm)引物足够扩增单分子检出，本试验引物按以上配方简表采用4μm(作为40×)浓度引物，上样标准品标i—标vi质粒10μl，进行39个热循环实时荧光pcr。结果见附图3和下表3，对应5'定向互补聚合引物标准品标i—标vi扩增ct值分别标i为11.0、14.4、17.7、21.0、24.0、标vi为27.1；较常规引物ct值标i为16.4、标vi为32.5；分别提前约5个循环ct值，折算5'定向互补引物pcr较常规引物增敏近5.5循环ct值≈放大近50倍。每稀释10倍间隔约3.3个循环ct值，标准品梯度间隔基本没有改变，不影响标准曲线梯度。
附图说明:
图1.5'互补引物定向聚合示意图，以长线条代表靶模板dna双链，短箭头代表上游、下游原引物，箭头指示3'端及延伸、合成方向；斜向5'端碱基字母代表与靶模板不杂交的人为添加的“5'端互补序列”，示意嵌合引物5'反向互补而使两分子产物3'端(虚线端)间也是反向互补，互为模板、互为引物扩增。
图2.解链式水解探针3'定向聚合示意图，长线条代表模板序列，两端带圆环—黑点的粗长线代表探针，空心圆环示意5'首端荧光基团，实心黑点代表3'尾淬灭基团；探针主要序列包括5'端碱基与靶模板序列完全互补，探针3'端折弯线代表不与靶模板杂交的尾序列，利用添加的5-7b尾与探针中部反向互补序列，形成两探针分子间一尾部与另一探针中部互补结合，同时其中部又与另一尾部杂交的两处靠近的互补杂交而定向聚合一种能两两分子定向自身聚合的taqman水解探针，随着特异扩增产物竞争结合而解链、水解产生荧光。
图3.引物5'定向聚合的荧光探针pcr标准品扩增曲线，对应标准品标i—标vi扩增ct值分别标i为11.0、14.4、17.7、21.0、24.0、标vi为27.1；较常规引物ct值标i为16.4、标vi为32.5；分别提前约5个循环ct值，检测范围边界最大值、最小值均增敏近5.5循环ct值≈放大近50倍；每稀释10倍仍间隔约3.3个循环，标准梯度间隔基本没有改变。
图4.乙型肝炎病毒常规引物水解探针实时荧光pcr检测标准品phbcore10倍稀释标准曲线，结果标i﹙10ng/ml﹚—标vii检测ct值依次为15.6，19.1，23.2，26.4，29.3，31.5，35.4，本底对照ct值在40循环内基本为一直线。
图5.乙型肝炎病毒hbv定向聚合引物荧光探针pcr结果：7个标准品10倍稀释曲线浓度梯度对应的梯度扩增曲线，引物5'hbvcf/5'hbvcra梯度标i-标vii对应ct值10.0、13.8、17.4、21.0、24.3、27.7、31.2循环。
图6.加入β-globin内标exon2定向聚合引物荧光探针pcr平均ct值为23.5循环。
图7.结核分枝杆菌定向聚合引物荧光探针pcr结果：7个标准品10倍稀释曲线浓度梯度对应的梯度扩增曲线，引物5’ttbf/5’ttbr梯度标i-标vii对应ct值11.5、15.1、18.5、21.8、25.0、27.6、30.0循环。
具体实施例：
以下实例进一步说明本专利内容，但不应理解为对本专利的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本专利方法、条件、步骤及应用所作的修改或替换，均属于本专利范围。实例一：人乙型肝炎病毒-定向聚合的荧光探针pcr：
乙型病毒性肝炎(简称乙肝)由乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus,hbv)感染的一种世界性iii类传染性疾病，据世界卫生组织who报道全球约20亿人携带乙肝病毒。我国人群中乙肝感染率非常高(近10％)，主要由肝炎病毒引发的肝癌已位列肿瘤首位，极大的危害了人民的身体健康。目前乙肝的检测方法主要有酶免疫法5项/7项、化学发光法、免疫荧光法、核酸扩增(pcr)荧光定量法等。传统酶免疫法应用较广，但灵敏度不足；实时荧光pcr定量和数字定量pcr法可以精确测定乙型肝炎病人的病毒载量,对感染者病毒复制水平的判断,病情传染性及抗病毒药物疗效监测具有无法替代的重要作用。核酸扩增目标区域大多选择乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus,hbv)s区一段保守序列和hbvc区一段保守序列，但s区二级结构阻碍和其引物本底高；我们选择hbvc区一段序列(nt:1901-2497)克隆至puc19载体质粒phbc(mw2.1×106)作为乙型肝炎病毒阳性模板序列；精选乙型肝炎病毒(hbv)核心core区(cdr:2306-2444)一段序列作为hbv常规引物和5'端反向互补引物的核酸扩增靶特异序列，展示两端各20碱基core区(nt:2306-2444)序列如下：
ab540584core区(nt:2306-2444)
caaatgcccctatcttatcaac––––––gtcgcagaagatctcaatctc
根椐一般引物选取原则以尽量减少引物二聚体和中国专利(一对部分同序引物减少其二聚体的方法:中国,cn201010105371.8)部分同序引物综合考虑，选取hbvc段保守区一段倒置重复/“引物同序”碱基置于引物对中部，因中部同序碱基5个数目不太够，试验不影响靶扩增效率情况下变异一个碱基以增加“同序”碱基数，中部7b同序能选择性减低引物二聚体pd非特异性超10个ct值，荧光探针法pcr常规hbv引物如下：
hbvf:5'-aatgcccctatcttatcaac-3'
hbvra:5'-agattgagatcttatgcgac-3'
hbv核心抗原c区5'端反向互补引物：
将上游引物5'反向序列ggcattt加到下游引物5'端前面间隔ccgg，下游引物5'反向序列tcaatct加到上游引物5'端前面间隔ccgg，形成嵌合引物对，且以a/ac结尾；
定向5'互补引物对序列如下：
5’thbvf:5'-tcaatctccggaaatgcccctatcttatcaa-3'
5’thbvra:5'-ggcatttccggagattgagatcttatgcgac-3'
(粗黑体字母代表限制酶hpaii位点，细线字母代表hbv序列，下划线部分为同序)，hbv核心抗原c区定向聚合探针设计：
采用解链式taqman水解探针，选取靶基因(临近下游一端引物)的一段代表性序列(nt:2368-2397)，靶特异性序列(/互补序列)5’端标记报告荧光染料fam，利用taq酶5’-3’外切酶活性水解与靶序列杂交的探针而切割释放荧光基团；探针3'末端添加与其中部gagggag反向互补的5-7b碱基作为人工定向聚合3'末尾；探针3'最末尾额外再加一个a碱基结尾，尾a之后再标记淬灭基团tamra(6-羧基-四甲基-罗丹明rhodamine)、bhq1；后加3'末尾序列需变一个碱基为“反义”碱基2'-o-methylrna；“反义”碱基、不互补a结尾、3'最末尾淬灭基团封闭三重设置阻止漏标记的探针3'末端非特异聚合延伸。
由于探针内杂交结合部分较短使自身较难形成锅柄样结构，但两探针间两段结合力大而很容易互补结合，这样不仅加强抑制本底荧光，也规避了探针与过量引物间形成非特异性杂交延伸的聚合体，兼容了molecularbeacon本底低和taqman游离荧光强的优点，从而消除或减少了引物和探针聚合出现指数扩增而干扰检测结果。
常规探针和定向3'聚合探针序列如下：
taqmanhbv:5’-fam-cgtctgcgaggcgagggagttcttcttctaa-bhq1-3’
解链tqmnhb:5’-fam-cgtctgcgaggcgagggagttcttcttctccc/i2omet/ca-tamra-3’
(粗黑斜体字母与下划线部分代表两探针间反向互补，/i2omet/为反义碱基)，
因乙型肝炎病毒载量比一般疾病感染源大多高出不少，加之引物5'定向互补的pcr较常规pcr灵敏度高出50倍，所以乙型肝炎病毒hbv的5'定向互补引物pcr可作为超敏检测。
(1)临床血标本dna提取：
血液标本中含过量血红蛋白、血红素、免疫球蛋白igg等pcr强抑制剂，必须纯化dna。柱离心方法：取血浆200μl，加等体积的饱和酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)抽提一次，再氯仿抽提一次，上清加3倍的dna结合缓冲液(6m碘化纳nai)移至商业dna纯化柱(质粒小提纯化柱,详细步骤按qiagen/tiagen说明书进行)，洗涤缓冲液(含70％etoh的2mnai液)洗柱两次，加40μldh2o洗脱收集纯化的样本。大量体积酚-氯仿抽提液须加1/10体积的3m乙酸钠(ph5.2)和2.5倍无水乙醇或等体积的异丙醇沉淀。
peg沉淀方法：取血清100μl，加100μl的16％peg盐液，悬涡混匀，高速离心10分钟，弃上清，剩余浓缩沉淀中加入50μl煮沸裂解液，轻混，置沸水或金属浴中煮沸10分钟，高速离心10分钟，上清即提取的dna溶液。
2×煮沸裂解液:0.02nnaoh,0.02％sds(w/v),25mmkoac,10mm(nh4)2so4,0.5％g25(v/v),0.5mbetaine,0.5％glycerol(v/v)和0.05％gelatin(w/v)。
微磁珠方法：采用盐酸胍/异硫氰酸胍裂解，核酸在高浓度4m胍盐条件下结合至聚苯乙烯微磁球硅烷化表面羟基(melzaketal,1996)，用小于ph6.0的缓冲液洗涤，大于ph8.5缓冲液洗脱。﹙微磁球法已经越来越多地取代酚-氯仿抽提液体方法和硅吸附膜离心柱方法)。取血清100μl于1.5mlep管中，加等体积的胍盐裂解液5分钟，加0.8ml稀释中和液后再加25μl顺磁纳米硅化微球结合，将试管置于磁分离试管架吸附固定磁微球，弃液后，加0.8ml洗液洗涤一次，最后磁微球加50μl洗脱液收集dna。
(2)标准梯度及样本检测taqman荧光pcr反应：
由于taqman探针pcr每个模板每次循环最多释放一个荧光基团，其反应荧光强度远低于sybrgreeni荧光染料法(每3-4bpdna能结合一个sybrgreeni分子)，所以taqman法必须采用较大体积的40μl反应体系，以使pcr仪器能接受到足够强度的荧光信号。按以下简表快速配制×n次单个pcr反应混合液，×n代表单次乘上所有pcr反应管数目或总检测数目。这次测试10次反应：以下游引物r+探针作为缓释引物探针，其配1.0×体积4μm引物+﹙0.5×体积4μm探针+0.5×体积20％蔗糖﹚混匀。依次每管加2μl缓释引物探针、28μlpcr反应液、40μl矿物油，最后分别加标i-标vii样品10μldna于油层下，瞬时高速离心后即刻荧光pcr。缓释引物热启动有效防产物气雾胶污染。
所配的反应混合液共0.56ml分装于预加缓释引物的pcr反应管/或8联排管，每管28μl分装20管；缓慢地沿管壁加上40μl矿物油封闭，小心于油层下按顺序加入10μl待检dna后，其中一管加10μl纯化水dh2o作为pcr系统阴性对照，短瞬离心，切记不要混匀！以防破坏缓释层。为了检测结果的可靠性，每次检测必须设立实验阳性、阴性对照和定量校准品(根据是否定量需要)。
反应管上实时荧光pcr仪(调整仪器激发光波长fam:480nm,检测光波长fam:520nm)。按使用说明书设置运行程序，首先进行94℃变性3分钟后，再运行36-39循环94℃变性20秒,58°-60℃退火、延伸40秒并读取荧光值的油封闭pcr无热盖扩增。
每个检测可平行2份×40μl计平均ct值，分析统计结果。
定量梯度标准曲线:
乙肝病毒hbv核心抗原c基因克隆质粒phbc(0.1μg/ml)为模板作10×(倍)稀释系列梯度标i(0.1μg/ml×10-1)、×10-2、×10-3、×10-4、×10-5、×10-6、×10-7。以puc-hbcore(3.36kb，分子量mw＝2.1×106，计1μg＝2.8×1011copy分子)计算，相应标准品梯度分子拷贝数为，标i：2.8×109copies/ml，ii：2.8×108copies/ml，iii：2.8×107copies/ml，iv：2.8×106copies/ml，v：2.8×105copies/ml，vi：2.8×104copies/ml和标vii：2.8×103copies/ml。
实验结果分析：7个标准品10倍稀释曲线浓度梯度对应的梯度扩增曲线见附图5，引物5'hbvcf/5'hbvcra梯度标i-标vii对应ct值ct值10.0、13.8、17.4、21.0、24.3、27.7、31.2；内标ct值为23.5见附图6。hbv核心抗原质粒对照puc-hbcore标准定量曲线的最左边第一条扩增曲线约为2.8×109copies/ml，随之作10倍稀释，扩增曲线梯度间隔均匀重复性好，最后一条扩增曲线为没有模板的本底对照，结果本底对照ct值在36循环内基本为一直线，在pcr反应内完全没有扩增ct值。对比常规荧光探针pcr标准品标i—标vii扩增曲线见附图4，5'定向互补引物扩增提前近5个ct值。
购买中检所乙型肝炎病毒(hbv)核酸定量标准品(批号0711)线性灵敏度参考品，采用乙型肝炎病毒定向聚合的荧光探针pcr检测中检所线性灵敏度参考品l0-l63次重复检测，结果线性灵敏度参考品l0-l5检出全部为阳性，定量浓度值也符合给出参考范围，相关系数r2不低于0.98。检测国家阳性参考品p1-p9，检测结果全部为阳性。阴性参考品全为基线反应。线性灵敏度参考品的灵敏度可达ct35-37。
(3)内标β-globin设计与试验：
由于一些dna提取时残留的pcr抑制成分干扰、抑制pcr样本检测而产生假阴性反应，
因此出现不同荧光波长的内标扩增的探针法pcr,通过内标基因扩增监测pcr抑制剂成分所造成的假阴性；近年来采用管家基因等不同靶序列的内标扩增探针法pcr成为常规标准程序。在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则pcr反应变为双重pcr，双重pcr反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，当内标与靶模板竞争性共用相同引物时起始拷贝数相差大于10倍就显著干扰；使用不同引物的非竞争性内标扩增，浓度相差100倍以上两种模板扩增逐渐干扰、抑制。
乙型肝炎病毒hbv定向聚合荧光探针pcr超敏检测试剂盒，选用管家基因人β-globin作为内标基因，突变克隆至质粒puc-globin2作为内标模板。方案一采用临床标本加入内标法：为了综合考虑内标扩增引物与hbv荧光探针pcr引物之间非特异聚合扩增，干扰、抑制hbv定向聚合荧光探针pcr；因此选取β-globinexon2作为模板、引物序列，将hbv引物中部同序atcttat人为插入exon2内标一对引物中部，变异模板及大部不变而中部同序的内标引物：
tβg2f:5'-atgggcatcttataaggtgaa-3'
tβg2r:5'-gaggatcttataggtgagcca-3'
(粗黑斜体字母代表hbv引物中部同序，余为exon2序列，下划线部分为同序)，内标插入中部同序的5’反向互补引物对：
5’tβgf:5'-gatcctccggatgggcatcttataaggtgaa-3'
5’tβgr:5'-gcccatccggaggatcttataggtgagcca-3'
(粗黑体字母代表限制酶hpaii位点，细线字母代表内标引物序列，下划线部分为同序)，人β-globin内标探针taqmanβg序列如下：
5'-hex-ctcatggcaagaaagtgctcggtgcctt/i2omet/aa-bhq1-3'
(4)临床试验结果：
临床研究对比上海克隆生物高技术有限公司检测700份临床样本，包括慢性乙型肝炎332例，急性乙型肝炎156例，乙型肝炎带原者56例，肝癌6例，其中b基因型103例，c基因型436例，d基因型11例；肝硬化8例，肝囊肿7例，丙型肝炎8例，甲肝3例，戊肝2例，健康人102例，糖尿病等其他疾病20例。本研究共包含干扰样本10例(溶血样本4例，脂血样本3例，甘油三酯样本3例)，检测结果均为阴性，表明干扰物质对检测结果无显著影响。与上海克隆生物高技术有限公司试剂相比ct值均提前3-5个循环，阳性定量符合率为99.64％，阴性符合率为98.01％，总体符合率为99.29％。经kappa检验，kappa值为0.966，大于0.8，说明两种试剂的检测结果高度一致。本试剂试剂测量值为y变量，对比试剂测量值为x变量拟合线性回归方程，y＝0.969x+0.373，其斜率为(95％可信区间)为0.969，p<0.001，线性回归方程具有统计学意义(f值46518.951，p<0.001)，相关系数(r)为0.993，p<0.001，r2为0.985。说明两试剂检测结果具有高度相关性。
实例二：肺结核分枝杆菌-定向聚合的荧光探针pcr：
结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性消耗性传染病。可侵及许多脏器，但主要侵犯肺脏，称为肺结核病。人与人之间呼吸道传播是本病传染的主要方式，传染源是接触排菌的肺结核患者。随着艾滋病、吸毒、免疫抑制剂应用、人口流动等因素，结核病发病率越发上升。据who报道，全球每3人就有1人感染过结核杆菌，每年有800万新病例发生，300万死于该病，位列我国第一位疾病死亡原因。目前检测主要痰结核菌镜检/结核杆菌培养、结核菌素ot/ppd试验、酶免elisa、和x线拍片等诊断，但结核杆菌培养周期长，阳性检出率不高，因此应用多聚酶链反应(pcr)技术检测结核杆菌能大大提高检出率和检测特异性。大多选择结核杆菌基因组重复序列，其插入序列有is6110和is986拷贝数1～20个，首选为pcr检测模板有助于进一步提高检出率。
结核分枝杆菌5'端反向互补引物设计：
将上游引物5'反向序列cgccta加到下游引物5'端前面间隔ccgg，下游引物5'反向序列agcgat加到上游引物5'端前面间隔ccgg，形成嵌合引物对，且以ca结尾；
5’ttbf:5'-agcgatccggtaggcgaaccctgccca-3'
5’ttbr:5'-cgcctaccggatcgctgatccggccaca-3'
(粗黑体字母代表限制酶hpaii位点，细线字母代表tb重复序列)，
定向3'聚合探针序列如下：
解链tbtqmn:5’-fam-cacataggtgaggtctgctacccacagccgacc/i2omet/ca-tamra-3’(粗黑斜体字母与下划线部分代表两探针间反向互补，/i2omet/为反义碱基)，
病毒dna沉淀煮沸法提取和标准程序定向聚合荧光探针pcr：
(1)痰液标本dna提取：
简易煮沸裂解法，首先痰液加溶菌酶裂解后，取100μl-200μl加等量的煮沸裂解液(用前充分混匀微珠,剪大口吸头吸取)，轻混,置沸水浴10分钟,经4℃短暂冷确后高速离心10分钟，取上清10μl加样。或大量裂解上清可再经微磁球吸附试剂进一步纯化。2×煮沸裂解液:0.02nnaoh,0.02％sds(w/v),25mmkoac,10mm(nh4)2so4,0.5％g25(v/v),0.5mbetaine,0.5％glycerol(v/v)和0.05％gelatin(w/v)。
(2)标准梯度及样本检测增敏pcr反应：
按以下简表快速配制×n次单个pcr反应混合液，×n代表单次乘上所有pcr反应管数目或总检测数目。这次测试10次反应：以下游引物r+探针作为缓释引物探针，其配1.0×体积4μm引物+﹙0.5×体积4μm探针+0.5×体积20％蔗糖﹚混匀。依次每管加2μl缓释引物探针、28μlpcr反应液、40μl矿物油，最后分别加标i-标vii样品10μldna于油层下，瞬时高速离心后即刻荧光pcr。缓释引物热启动有效防产物气雾胶污染。
或于矿物油表层下加10μl痰液样本dna，瞬时高速离心后尽快荧光pcr。
使用宏石slan-96p荧光pcr仪实时荧光pcr，首先95℃变性3分钟后,再运行36循环94℃变性20秒,58℃—60℃退火、延伸40秒并读取荧光值的油封闭pcr无热盖扩增。
结核分枝杆菌基因克隆质粒puc-tbis(0.1μg/ml)为模板作10×(倍)稀释系列梯度标i(0.1μg/ml×10-1)、×10-2、×10-3、×10-4、×10-5、×10-6、×10-7。实验结果分析：7个标准品10倍稀释曲线浓度梯度对应的梯度扩增曲线见附图7，引物5’ttbf/5’ttbr梯度标i-标vii对应ct值11.5、15.1、18.5、21.8、25.0、27.6、30.0循环。
序列表
<110>澳门帝杰数码基因有限公司
<120>一种定向聚合的荧光探针pcr
<160>15
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
aatgcccctatcttatcaac20
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
agattgagatcttatgcgac20
<210>3
<211>31
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
tcaatctccggaaatgcccctatcttatcaa31
<210>4
<211>31
<212>dna
<213>人工序列
<400>4
ggcatttccggagattgagatcttatgcgac31
<210>5
<211>31
<212>dna
<213>人工序列
<400>5
cgtctgcgaggcgagggagttcttcttctaa31
<210>6
<211>35
<212>dna
<213>人工序列
<400>6
cgtctgcgaggcgagggagttcttcttctccctca35
<210>7
<211>23
<212>dna
<213>人工序列
<400>7
caaatgcccctatcttatcaac…gtcgcagaagatctcaatctc23
<210>8
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<400>8
atgggcatcttataaggtgaa21
<210>9
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<400>9
gaggatcttataggtgagcca21
<210>10
<211>31
<212>dna
<213>人工序列
<400>10
gatcctccggatgggcatcttataaggtgaa31
<210>11
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<400>11
gcccatccggaggatcttataggtgagcca30
<210>12
<211>31
<212>dna
<213>人工序列
<400>12
ctcatggcaagaaagtgctcggtgcctttaa31
<210>13
<211>27
<212>dna
<213>人工序列
<400>13
agcgatccggtaggcgaaccctgccca27
<210>14
<211>28
<212>dna
<213>人工序列
<400>14
cgcctaccggatcgctgatccggccaca28
<210>15
<211>36
<212>dna
<213>人工序列
<400>15
cacataggtgaggtctgctacccacagccgacctca36
- 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞！