本发明属于家畜分子标记技术领域，具体涉及1个与母鸡储精能力相关的snp分子标记及其应用。
背景技术：
母鸡的储精能力是指母鸡在自然交配或者人工授精(artificialinsemination，ai)之后能够储存精子并持续产受精蛋的能力(durationoffertility)。在许多品种或品系的群体中，研究者发现母鸡的储精能力均会存在明显的个体差异，反映为一次自然交配或者人工授精后母鸡产受精蛋个数(fn，thenumberoffertileeggsafterai)或持续天数(dn，thedayspost-inseminationuntilthelastfertileegg)的差异。在家禽育种和种蛋生产过程中，母鸡的储精能力长短是决定进行人工授精频率的关键因素，如火鸡的储精性状长达一至两个月，因此在火鸡种蛋的生产过程中，对其人工授精只需要一个月进行一次，甚至对于即将要开产的火鸡，可提前半个月进行人工授精来提高种蛋的获得(bakst,2010)。而白来航(whiteleghorn)和京红母鸡(jinghongbrownlayers)的储精性状一般只有两周左右，麻鸭(anasplatyrhynchadomestica)的储精性状也只有13天左右(lakeandstewart,1978；blackburnetal.,2009；liuetal.,2015)，生产上为了保证90％以上的种蛋受精率，对它们进行人工授精一般需要一周进行一次。在目前大规模集约生产中人工授精技术被普遍采用的情况下，选择储精能力长的母鸡，对母鸡储精性状进行改良，能够有效地降低种蛋生产过程中人工授精的频率，进而减少种公鸡的饲养量，从而减少饲养成本，同时减少母鸡对人工授精产生的应激反应，增加生产效益。利用全基因组关联分析(gwas)检测与性状相关联的snps及基因组区域，可大大提高工作效率和统计效力。本研究是利用鸡全基因组snp芯片(600k，affymetrix)对鸡储精能力进行全基因组关联分析，在全基因组范围内检测与母鸡储精性状相关联snps及基因组区域的报道。该项研究工作在国家基金(项目编号：31372301，项目名称：鸡贮精能力差异相关新基因的筛选及其分子机制初探)和西藏自治区重点研发及转化计划(项目编号：cgzh2017000237)及自主创新基金重大培育项目：利用吐-莱资源群体发掘鸡抗热高产基因及其组合(项目编号：2662018py088)资助下完成。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一个与母鸡储精能力相关的snp分子标记及其应用，通过全基因组关联分析在母鸡基因组3号染色体上找到1个与储精能力关联的snp分子标记。
本发明通过以下技术方案实现：
一种与母鸡储精能力相关的snp分子标记，位于3号染色体，该分子标记的核苷酸序列(seqidno.1)如下所示：
ctgatgctgcccaatcctgagtggargcaacttcccacagtgccaaaacct
上述序列第26位的碱基r是a或g，导致多态性。
通过下述方法筛选获得：
1)实验样品采集：采集试验鸡血样用于dna提取；
2)母鸡储精能力的测定：测量试验鸡一次人工授精后母鸡产受精蛋个数(fn)和持续天数(dn)，重复测量三次，取三次所测结果的平均值，作为该试验鸡的储精能力；
3)鸡基因组dna的提取与检测：从试验鸡血样中提取鸡基因组dna，制备母鸡全基因组dna样品；
4)基因型判定及基因型与鸡储精能力的关联分析：
将试验鸡血样中提取的基因组dna在与鸡600k高密度snp芯片(affymetrixaxiom)杂交，然后采用plink软件对所有个体的原始基因型数据进行质控检验，利用tassel统计分析软件将试验储精能力与基因型进行关联分析，从中选取达到全基因组的基因组水平显著的snp。
上述snp位点的多态性与储精能力dn(授精一次至母鸡产出最后一枚受精蛋之间间隔的天数)和fn(授精一次后母鸡所产受精蛋的个数)显著关联(p<0.05)，gg基因型是母鸡储精能力的不利标记，这个snp分子标记可以用于母鸡储精性状的筛选及改良。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
本发明运用全基因组关联分析(gwas,genomewideassociationstudy)技术方法在母鸡全基因组范围内筛选得到与鸡储精能力(durationoffertility)相关的snps分子标记，进一步采用限制性内切酶长度多态性(pcr-rflp，restrictedfragmentlengthpolymorphism)分析方法在扩大的群体里对这个snp与鸡储精能力(durationoffertility)相关性进行了验证。为利用分子标记辅助育种对母鸡储精能力进行选择和改良提供了1个新的snp分子标记。
具体实施方式
实施例1与母鸡储精能力相关的snp分子标记的筛选
1)实验样品采集：
试验群体为701只健康母鸡，来源于“京红1号”蛋鸡核心育种鸡场，父母代群体(200日龄)，所有母鸡同批次孵化而来。饲养于武汉峪口禽业有限公司，执行单笼饲养，14小时光照制度，自由采食及饮水。在饲养期间，温度、湿度、通风、光照等条件均相同，为常规方法。
2)储精能力的测定：
以20天为一个周期，对公鸡一次采精，精液中要求无粪便、羽屑、血液污染，否则一律废弃。利用混合精液对母鸡进行输精(20微升/只)，输精时避免输精器械的刺激，同时为避免发生输精感染，做到每输精一次后，更换一次输精器头。具体操作按照《鸡人工授精技术规程》(db12/t290—2006)执行。收集种蛋并标记笼号。同批次种蛋恒温孵化(37.8℃，相对湿度50％)7天后照蛋，记录受精与未受精的种蛋。
测量每只母鸡一次人工授精后产受精蛋的个数(fn，thenumberoffertileeggsafterai)和持续天数(dn，thedayspost-inseminationuntilthelastfertileegg)，重复测量fn和dn三次，取三次所测结果的平均值，作为该试验鸡的储精能力。
母鸡的储精性状测定实验结束后，对试验鸡群翅下静脉采血0.5ml，置于1.5ml事先加入0.3ml抗凝剂的ep管中，混匀后-20℃保存以备dna提取。
3)dna的提取与检测：
采用苯酚-氯仿法从试验鸡血样中提取鸡基因组dna，再用凝胶电泳判断dna的完整性；对提取后的dna进行质量检测；调整浓度至50ng/μl，制备母鸡全基因组dna样品。
4)基因型判定及基因型数据与鸡储精能力的关联分析：
根据前一部分中701只母鸡群体的储精能力，筛选储精能力长和短的母鸡各60只，将它们的基因组dna与鸡600k高密度snp芯片(affymetrixaxiom)杂交。在全基因组范围内成功检测到552395个snps位点的基因型信息，通过质量控制(剔除检出率(callrate)小于90％的snps；剔除最小等位基因频率(minorallelefrequency，maf)小于5％的snps)，最后剩下的snps数目为341176个。申请人利用tassel统计分析软件将试验鸡群的储精能力与基因型数据进行关联分析，关联分析模型为混合线性模型：
y＝s+k+e
其中y表示表型值；s表示基因型效应；k表示亲缘关系矩阵，作为模型的随机效应；e为残差效应。
当某个snp与母鸡储精性状关联p值小于4.18e-06时，我们就认为这个snp与母鸡储精性状显著关联。
5)分析结果
关联分析发现1个与母鸡储精性状显著关联的snp(ax-76413026，p<4.18e-06)，见表1。
表1与母鸡储精能力显著关联的snp位点
*p<4.18e-06；
实施例2验证该snp分子标记的有效性
为了验证对全基因组关联分析结果的可靠性，我们利用已测定储精能力的母鸡群体，对全基因组关联分析中与储精性状显著关联的snp(ax-76413026)进行限制性片段长度多态性分析(pcr-rflp)，并对该群体中不同基因型个体的储精能力dn和fn进行比较，结果见表2。结果显示这个snp位点的多态性与储精能力dn和fn显著关联(p<0.05)。
表2snp位点与母鸡储精能力关联分析结果。
注：dn＝授精(一次)至母鸡产出最后一枚受精蛋之间间隔的天数；fn＝授精(一次)后母鸡所产受精蛋的个数；同一性状中具有不同肩标的snp基因型之间表示差异显著(p<0.05)。*表示差异显著，p<0.05；**表示差异极显著p<0.01；表中性状值为平均数±标准误。
通过pcr-rflp分析，得到了719只母鸡snp位点ax-76413026基因型信息，其中aa基因型有228个，gg基因型有33个，ag基因型有458个。snp位点ax-76413026多态性与鸡储精能力fn和dn都呈显著相关(p<0.05)，gg基因型的母鸡授精(一次)后母鸡所产受精蛋的个数显著少于aa和ag基因型的母鸡(p<0.01)。同时gg基因型的母鸡授精(一次)至母鸡产出最后一枚受精蛋之间间隔的天数显著少于aa和ag基因型的母鸡(p<0.05)，因此gg基因型是母鸡储精能力的不利标记，可以用于母鸡储精性状的筛选及改良。
序列表
<110>华中农业大学
<120>与母鸡储精能力相关的snp分子标记及其应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>51
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
ctgatgctgcccaatcctgagtggargcaacttcccacagtgccaaaacct51