本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及棉花aintegumenta基因ghant在棉花育种中的应用。
背景技术：
棉花是世界上重要的经济作物，棉纤维是纺织工业主要的原材料，棉籽也是重要的油脂和蛋白来源。棉花种子体积的大小、重量、纤维的品质直接关系到棉花的应用及其后加工产品的质量。目前，随着人口数量的增多，人们不仅对棉花的需求量增加，而且棉纺织工业对棉纤维的品质要求也越来越高，如纤维更长、强度更好、纤维更细更整齐。衣分作为一种重要的产量因子，其和铃重、种子大小存在着负相关(zengandmeredith,2009)。本课题组前期通过在胚珠表皮中时空调控生长素合成使转基因棉花(fbp7：iaam)的纤维产量和品质有了显著提高，但同时也发现转基因棉花种子体积明显变小(zhangetal.,2011)。较大的种子器官有利于为种子发育提供更多的养分，如在改良棉花纤维的同时，以牺牲种子重量换取纤维产量限制了纤维产量的进一步提高，不利于棉花种子的综合利用。因此，有必要利用基因工程的手段，改良棉花种子大小，在不减小甚至增大种子体积的同时，实现棉花种子-纤维的协同改良。
通过研究aintegumenta(ant)基因的拟南芥t-dna插入突变体发现，其编码一个具有ap结构域的转录因子(elliottetal.,1996)，与除了根以外所有原基细胞起始有关，并通过保持组织分生能力来增加细胞数量(mizukamiandfischer,2000)。最初发现ant基因在拟南芥中与胚珠，花器官生长发育有关，ant基因缺失的突变体细胞数目减少使花器官和叶变小(klucheretal.,1996)，反之过量表达导致增加细胞分裂的持续时间，引起总细胞数目变化，增加了叶、花器官以及角果的大小(krizeketal.,1999)。同时还发现强ant突变体具有胚珠，但是缺少珠被或雌配子体；外面的3轮花器，除有可能随机缺失外，还会表现出其它不正常的形态；弱ant突变体含有内外珠被，但是不能产生具有繁衍功能的雌配子，因此ant突变体是雌性不育的(mizukamiandfischer,2000)。
ant被argos蛋白诱导，当其异位表达时会促使组织产生更多细胞而使器官增大(huetal.,2003)，其在成熟器官中的表达可能通过一个器官生长抑制因子auxinresponsefactor2(arf2)来负向调节(schruffetal.,2006)。拟南芥不同组织的原位杂交显示，antmrna在胚珠的子叶原基细胞、花器官、珠被，胎座都能检测到(krizek,1999)，且存在于所有侧枝的原始细胞。ant在金鱼草和拟南芥的功能和表达时间位置在花器官中是一致的。antmrna在金鱼草花的分生组织和早期的花原基细胞中表达，当花器官成熟，ant表达在萼片的早期阶段和雄蕊的后期阶段降低(delgado-benarrochetal.,2009)，但在烟草中很难在花器官发育后期检测到(rieuetal.,2005)。mdant1和mdant2的表达在苹果生长的早期高表达，在细胞分裂后期快速衰减，在苹果发育后期保持低水平表达(dashetal.,2012)。ant还引起cycd3:1表达增强(mizukamiandfischer,2000)，过量表达cycd3:1也大大增加了叶片细胞数目，但是并不影响ant的表达(dwitteandmurray,2003)。
前人在拟南芥中利用组成型启动子35s超量表达来源于拟南芥的atant基因的确可以增加种子大小，但是在本专利中我们使用到的来源于棉花的ghant是否可以促进器官大小，在我们的研究之前是不确定的；另外，在拟南芥中组成型超量表达atant会导致雌性不育(mizukamiandfischer,2000)，为了不影响棉花植株正常生长，我们利用番茄果实特异启动子构建棉花内源ghant基因表达载体。结果证明，在陆地棉胚珠中组织优势表达该基因的特异片段，获得的转基因棉花长势正常，籽指增加。
技术实现要素：
本发明的目的在于为棉花育种提供一种新选择。
本发明的技术方案是棉花aintegumenta基因ghant在棉花育种中的应用。
具体的，所述的应用为棉花aintegumenta基因ghant在改良棉花种子大小中的应用。
具体的，所述的应用为棉花aintegumenta基因ghant在改良棉花纤维品质中的应用。
具体的，所述的棉花aintegumenta基因ghant编码的蛋白质具有seqidno.2所示的氨基酸序列。
具体的，所述的棉花aintegumenta基因ghant的cdna具有seqidno.1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了改良棉花种子的制剂，其主要活性成分为棉花aintegumenta基因ghant编码的蛋白质，表达该蛋白质的元件，表达该蛋白质的载体，或表达该蛋白质的宿主细胞。
具体的，所述的棉花aintegumenta基因ghant编码的蛋白质具有seqidno.2所示的氨基酸序列。
具体的，所述的棉花aintegumenta基因ghant的cdna具有seqidno.1所示的核苷酸序列。
具体的，所述表达该蛋白质的元件从5’-3’方向依次包含特异启动子ptfm7，aintegumenta基因ghant和终止子。
具体的，所述的特异启动子ptfm7，其具有如seqidno.3所示的核苷酸序列。
这个基因只是根据拟南芥中的ant在棉花中根据蛋白同源性找出的同源基因，其功能还没有验证过。棉花是木本植物，种子的形成和产量的构成因素远比十字花科的模式植物拟南芥复杂，调节种子器官发育的基因有可能只是增大了棉铃，而与产量相关的种子并没有增加，或者增大了种子却又减少了种子数量，最终种子产量并没有增加。另外，在拟南芥中组成型超量表达atant会导致雌性不育(mizukamiandfischer,2000)，为了不影响棉花植株正常生长，利用番茄果实特异启动子构建棉花内源ghant基因表达载体。本发明采用了来源于番茄果实的特异启动子ptfm7，其具有如seqidno.3所示的核苷酸序列。ptfm7供体生物为番茄，长2642bp，可在果实部位特意调控目的基因，在棉花中的表达模式如图1所示，在棉花胚珠发育中期优势表达。
本发明的有益效果：本发明采用了来源于番茄果实的特异启动子ptfm7，可在果实部位特意调控目的基因，在棉花胚珠发育中期优势表达。本发明是通过在棉花胚珠中优势表达一种陆地棉aintegumenta基因，以增加棉花种子重量。结果证明，在陆地棉中组织优势表达该基因的特异片段，转基因棉花种子籽指增加的幅度在2.3％-18％之间，平均提高了10％，达到了显著差异水平(p<0.05)；种子产量平均增幅达到了7.6％；纤维品质方面，马克隆值降低，纤维强度增强，伸长率提高，纤维品质得到了提高。本发明为棉花育种提供了一种新选择。本发明方法简便易行，效果显著，可以提高棉花种子产量，能提高棉花的经济效益。
附图说明
图1：ptfm7在棉花中的启动子活性分析
如图1所示，为了确定ptfm7：gus的表达模式，将ptfm7启动子连gus报告基因，将表达载体ptfm7:gus转入棉花，棉花胚珠发育中期优势表达(relativeexpressionlevel即相对表达量)。
图2：陆地棉ghant基因在陆地棉不同组织及胚珠各个发育阶段的表达量(relativeexpressionlevel即相对表达量)。
利用实时定量rt-pcr检测了ghant基因在陆地棉冀棉14(wt)的茎、叶、花等不同组织以及不同时期的胚珠和纤维中的表达，结果显示ghant基因在花器官中的雄蕊和雌蕊以及叶中的表达水平极低，在胚珠中的表达水平比花高3倍。进一步检测了ghant基因在棉花胚珠-2～19dpa发育时期的表达水平，结果表明该基因在-2～2dpa表达量呈现一个小高峰，4～10dpa表达量较低，而在13～19dpa表达较高。
图3：陆地棉tfm7-ghant特异表达载体的构建流程图。
载体主要元件标示，gus:nptii：β-葡萄糖酸苷酶与新霉素磷酸转移酶的融合基因；nos：终止子；kanamycin：卡那霉素抗性基因；ptfm7：来源于番茄果实的特异性启动子；camv35spolya：35s终止子；t-border：t-dna插入边界。
图4：转基因棉花胚珠中ghant基因的表达量检测
提取转基因植株和野生型冀棉14(wt)的18dpa胚珠的rna，反转录成cdna，用于比较分析ghant基因在不同植株中的表达量。实时定量pcr分析结果表明：与野生型棉花的ghant基因表达水平相比，除了d4株系其余株系都有所上调，尤其是g4、e7株系上调了3倍，e4、g6、d7株系上调了2倍。转基因株系ghant-g4在胚珠发育不同时期的ghant基因的表达量均高于wt(图4a)。ghant基因在g4转基因株系不同发育时期的胚珠种表达量均高于野生型(图4b)。
图5：转基因棉花种子大小的变化
转基因株系g4与野生型棉籽大小比较，由图可见转基因棉花种子和种仁均大于野生型(图5a)。转基因株系g4不同时期棉籽的长宽与野生型相比，均大于野生型(图5b)。
图6：产量和纤维品质分析
不同转基因株系的百粒重均高于野生型(图6a)，转基因植株的纤维品质与野生型相比，伸长率和纤维强度提高，马克隆值降低(图6b、c、d)。
具体实施方式
以下结合附图对本发明进行进一步的详细说明，但以下说明并不对本发明进行限定,任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。
本发明实例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(sambrook和russell,2001)。实施例中所使用的引物序列件表1。
表1引物序列
实施例一陆地棉aintegumenta基因(ghant)的克隆
利用easyspin植物rna快速提取试剂盒(aidlab)提取陆地棉冀棉14胚珠的rna。参照takara说明书进行cdna的合成，用作ghant基因克隆的模板。最后用设计合成的该基因的特异引物，以上述的cdna为模板，扩增该基因的完整cdna序列。扩增条件如下：10×pcrbufferforkodplus5μl，25mmolmgso45μl，2mmol/ldntps2μl，引物1(5μmol/l2μl，引物2(5μmol/l)2μl，kodplus聚合酶1u/μl，陆地棉cdna约60ng，双蒸水补足至50μl。扩增程序为：94℃，2min；94℃，15sec，56℃，30sec，68℃，1.5min，35个循环。扩增完成后，琼脂糖电泳并回收相应dna条带，克隆至平端载体peasy-blunt(transgenbiotech)后寄至华大公司测序验证。
实施例二dna片段回收，载体构建，大肠杆菌转化
紫外灯下，用洁净的刀片切下含目的片段的琼脂糖凝胶块，按照试剂盒(aidlab)的方法回收相应的dna片段。载体构建流程见图3。所有限制性内切酶购自roche公司,按照使用说明书操作。回收的片段与载体建立如下连接体系:10×t4dna连接缓冲液1μl，载体dna片段1μl，外源连接产物dna片段1μl，t4dna连接酶1μl，用双蒸水补足体积至10μl的连接体系。载体dna片段与外源连接产物dna片段摩尔比为1:3，16℃连接12h。之后将连接产物转化大肠杆菌dh5α。
本研究用于棉花转化的表达载体质粒的整个t-dna区段约17.8kb(结构见图3)，包括筛选标记基因和报告基因的融合基因(gus:nptii)和目的片段(ghant)两个表达元件。确定筛选标记基因特性可以采用pcr进行检测，确定报告基因gus，可通过组织化学染色确定。筛选目的片段是否已经整合到棉花dna可通过pcr进行检测。目的基因ghant构建入植物表达载体plgn的流程见图3。在p5骨架载体的基础上，其t-dna区段(rb和lb之间区域)替换成特意表达启动子ptfm7(chenetal.,2016)控制的报告基因gus和标记基因nptii的融合基因表达盒，并在p5表达盒两端各添加了一个loxpfrt重组酶识别位点，以及另一个由camv35s-p控制的表达盒。根据表达载体的构建流程图，采用相应的限制性内切酶消化，按照上述的链接反应，构建ghant基因的特异表达载体。
实施例三农杆菌及棉花的遗传转化
1.用电激法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌lba4404。
参考bio-radmicropulser用户说明书，将上述植物表达载体通过电激转化法导入农杆菌lba4404。
2.特异表达载体整合到陆地棉基因组
采用农杆菌介导的方法对棉花进行遗传转化(luoetal.，2007)，将获得的转基因棉花植株通过gus染色的方法进行筛选，将gus染色呈阳性的幼苗置于清水中，22℃培养1周后移栽至温室中，进行正常管理。
实施例四陆地棉各个组织rna的提取及定量pcr分析
利用easyspin植物rna快速提取试剂盒(aidlab)提取棉花各个组织的rna。参照revertaidfirststrandcdnasynthesiskit(mbi)说明书进行cdna一链的逆转录，用作定量rt-pcr分析模板。采用iqsybrgreensupermix(bio-rad)试剂分析目的基因的相对表达量。内标基因选择陆地棉的ghhis1基因(af024716，引物为histone3-1(5’-gaagcctcatcgataccgtc-3’)和histone3-2(5’-ctaccactaccatcatggc-3’)。ghant基因表达量检测所用引物为，ghant定量pcr引物1(5’-acgaggtacgatgtggaacg-3’)和ghant定量pcr引物2(5’-tccagtctggttgagaccca-3’)。其余基因的定量pcr引物见序列表。扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸30s，40个循环。计算各材料中目的基因和内标的比值，既得目的基因在不同器官组织中的相对表达量(图1、图2和图4)。
实施例五ghant基因干扰表达的转基因棉花农艺性状的测定
棉籽大小的测定：
选取t3代棉籽，其中每个转基因植株选取90粒种子，设置3次重复，利用游标卡尺分别测定转基因的棉籽的大小(图5a)。从转基因植株g4种子的长和宽的柱状图分析，与野生型种子相比，t3代转基因种子长度增加了5.3％～29％，宽度增加了21.9％～24.3％(图5b)。
棉花籽指、衣分、衣指的测定：
选100粒籽棉，轧花后，分别称量100粒棉花纤维重量(也称衣指)和100粒种子重量(也称籽指)，测量棉花的衣分(棉纤维的重量/棉纤维+棉籽的总重)。每个转基因植株选取300粒籽棉，3次重复。将收获的ghant转基因棉花和野生型棉花以不同时期、不同区组选取15g纤维样品送至中国棉花纤维检测中心检测棉花纤维的上半部平均长度、整齐度、马克隆值、伸长率和断裂比强度。根据纤维品质测定的结果，ghant转基因棉花在纤维长度和整齐度上与对照没有明显的差异，而纤维强度、马克隆值与比对照相比，品质得到了提高。
待棉花进入收获期时，统计每株的棉铃数量，并以直径为2cm作为区分棉铃大小的标准，当直径小于2cm的棉铃，由于刚受精不久，棉铃在受精后几天内可能发生脱落情况，因此每三个小于2cm的棉铃算作一个大铃，然后加上直径大于2cm的棉铃作为整株的铃数。当进入收获期(8月中旬)，每10天收获一次，一直收获至10月上旬，然后将全部收获的棉花样品进行产量因子相关性状分析。转基因植株g4三个区组的铃数、铃重、衣分和单铃种子数与野生型无明显差异，然而g4的籽指相比野生型平均提高了10％，均达到了显著差异水平(p<0.05)；g4株系的小区种子产量平均为3.12kg，相比野生型2.90kg，增产了0.22kg，增幅达到了7.6％(见表2)，其他转化子的百粒重也都高于野生型(图6a)。
将收获的转基因株系不同转化子和野生型棉花以同一时期不同区组收获的选取15g纤维样品送至中国棉花纤维检测中心检测棉花纤维的上半部平均长度、整齐度、马克隆值、伸长率和断裂比强度。获得的平均值如表3所示：g4的五项指标与野生型相比，马克隆值降低，纤维强度增强，伸长率提高，并且三个区组之间的检测值也无明显差异，说明特异表达ghant基因实现纤维品质改良。其他转化子纤维品质也优于野生型(图6b、c、d)。
表2t3代转基因棉花ghant-g4与野生型棉花种子产量
表3t3代转基因棉花ghant-g4与野生型棉花种子纤维品质比较
上述实例表明，本发明改良棉花种子性状的方法，能够实现在棉花的特定部位的特定发育阶段特异性地表达ghant基因，进而内源调控棉花种子发育,达到增加种子大小和重量，并同时提高棉花纤维产量和改良纤维品质(如马克隆和强度)的目的。本发明方法简便易行,效果显著，具有很好的市场前景。
以上对本发明的详细描述并不限制本发明,本领域的技术人员可以根据本发明做出各种变形和改变,只要不脱离本发明的精神,均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。
序列表
<110>西南大学
<120>棉花aintegumenta基因ghant在棉花育种中的应用
<130>2018
<160>15
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>2043
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
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