本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种棉花基因ghdtx27在植物耐盐、干旱和冷胁迫方面的新应用。
背景技术
外界压力，如干旱，盐和冷会影响植物生长和作物产量，因此，植物需要适应这种生存压力。干旱和盐胁迫是影响植物发育和限制敏感性植物地理分布的关键因素，据估计，由非生物胁迫造成的农作物损失超过50％，由于环境条件恶化，损失程度将进一步加大。植物已经发展出一种称为胁迫适应的机制来增强对各种非生物和生物胁迫因子的耐受性。诱导各种胁迫相关基因被认为是植物为增强它对胁迫因子的适应性而采用的机制之一。
植物处于干旱或盐胁迫条件下会导致细胞失水，渗透压升高，诱导植物的应激反应，产生次生代谢物以参与生物和非生物胁迫下的保护功能。aba是植物最重要的次生代谢物之一，在植物生长和发育的各个方面发挥重要作用，包括对非生物胁迫的反应。干旱、冷和盐胁迫是最具破坏性的非生物胁迫因素，对全球作物生产力产生严重的负面影响，当植物受到这些胁迫时，植物中的aba含量迅速增加，导致气孔关闭和诱导应激基因表达以应对应激反应。由于aba合成的部位是在根部组织中，因此，它需要一个精密的运输系统将aba运输至靶器官或组织。研究发现，多药和有毒化合物排出(multidrugandtoxiccompoundextrusion,mate)转运蛋白家族是与植物中aba易位有关的蛋白质之一。
棉花基因ghdtx27的基因id为gh_d06g0281，该基因的cds全长为1479bp，编码多药和有毒化合物排出(mate)转运蛋白，功能域为pf01554，分布于细胞膜。到目前为止，还没有关于该基因的功能的相关报道。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供了一种棉花基因ghdtx27在植物耐盐、干旱和冷胁迫方面的新应用，拓展基因ghdtx27的应用范围。
本发明的技术方案为：棉花基因ghdtx27在提高植物耐盐、干旱和冷胁迫能力上的应用，所述棉花基因ghdtx27的基因id是gh_d06g0281。
进一步地，所述应用为通过在植物中过表达棉花基因ghdtx27，从而提高植物耐盐、干旱和冷胁迫能力。
本发明还公开了一种提高植物耐盐、干旱和冷胁迫能力的方法，将外源基因利用植物表达载体，经农杆菌介导转化到植物中获得耐盐、干旱和冷胁迫的转基因植物；所述外源基因为：棉花基因ghdtx27或棉花基因ghdtx27的cds序列或由ghdtx27基因或其cds序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的衍生核苷酸序列；所述棉花基因ghdtx27的基因id是gh_d06g0281。
本发明利用高通量测序研究棉花耐盐、干旱和冷胁迫的主效基因。从转录组水平，我们发现编码多药和有毒化合物排出(mate)转运蛋白的基因ghdtx27具有显著差异的表达水平。植物中mate转运蛋白具有转运底物特异性，在次生代谢物转运中发挥重要作用，对处于非生物胁迫中的植物具有保护作用。我们分析并构建了mate功能基因成员ghdtx27(gh_d06g0281)的转基因纯合系。ghdtx27基因在盐、干旱和冷胁迫下具有显著的调节作用，表明它是mate基因中一个重要的功能成员。
本发明的优点及积极效果为：
本发明通过转基因技术获得的转ghdtx27基因的拟南芥纯合系对盐、干旱和冷胁迫的耐受性显著提高，通过盐、干旱和冷处理后表型变化、叶绿素含量测定、叶片相对含水量测定、离子电导率测定、离体叶片失水测定、发芽率统计、根长伸长量的比较、幼苗鲜重变化、逆境胁迫响应基因的表达分析、抗氧化酶活性和氧化剂含量测定多种验证。以上结果说明，ghdtx27在植物耐盐、干旱和冷胁迫中扮演重要角色。
附图说明
图1是本发明实施例提供的盐、干旱和冷胁迫下棉花根、茎和叶中的ghdtx27基因相对表达量示意图。a：在250mmnacl条件下ghdtx27基因在根、茎和叶中的相对表达量；b：在15％peg-6000条件下ghdtx27基因在根、茎和叶中的相对表达量；c：在4℃条件下ghdtx27基因在根、茎和叶中的相对表达量。
图2是本发明实施例提供的转ghdtx27拟南芥t1和t2代的筛选情况。a：pcr检测t1代转基因拟南芥的转化结果，m为marker2000，1-11为转化系，12为阳性对照(pwm101-ghdtx27)，13为阴性对照(wt)；b：通过qrt-pcr分析t2代转基因拟南芥中ghdtx27的表达水平。
图3是本发明实施例提供的在0，0.5，1和2μmaba条件下野生型(wt)和转ghdtx27基因系(oe-2，oe-3和oe-9)根长和鲜重比较分析。其中a、b分别为发芽表型及发芽率数据统计，c、d、e分别为根长表型、根长伸长量和鲜重变化。
图4是本发明实施例提供的在0，100，200和300mm甘露醇条件下野生型(wt)和转ghdtx27基因系(oe-2，oe-3和oe-9)根长和鲜重比较分析。其中a、b分别为发芽表型及发芽率数据统计，c、d、e分别为根长表型、根长伸长量和鲜重变化。
图5是本发明实施例提供的在0，100，150和200mmnacl条件下野生型(wt)和转ghdtx27基因系(oe-2，oe-3和oe-9)根长和鲜重比较分析。其中a、b分别为发芽表型及发芽率数据统计，c、d、e分别为根长表型、根长伸长量和鲜重变化。
图6是本发明实施例提供的在4℃和正常条件下(22℃)条件下野生型(wt)和转ghdtx27基因系(oe-2，oe-3和oe-9)根长和鲜重比较分析。其中a、b分别为发芽表型及发芽率数据统计，c、d、e分别为根长表型、根长伸长量和鲜重变化。
图7是本发明实施例提供的野生型和转ghdtx27基因拟南芥在盐、干旱和冷胁迫下的生理特性。a：盐、干旱和冷胁迫下野生型和转基因系的表型；b：盐、干旱和冷胁迫下野生型和转基因系的叶绿素含量；c：盐、干旱和冷胁迫下野生型和转基因系的叶片相对含水量；d：盐、干旱和冷胁迫下野生型和转基因系的离子电导率；e：盐、干旱和冷胁迫下野生型和转基因系的离体叶片失水。
图8是本发明实施例提供的盐、干旱和冷胁迫下转基因系mda和h2o2的含量示意图。
图9是本发明实施例提供的野生型和转基因拟南芥中抗氧化酶(pod、sod、cat)活性示意图。
图10是本发明实施例提供的野生型和转基因拟南芥中逆境胁迫响应基因(atabf4，atsos1，atcbl1和atrd29b)的表达水平示意图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明均可从商业途径获得。
实施例1植物转化和过表达ghdtx27拟南芥筛选
通过特异性引物(f：cggatccatggatggtgcccatcgg(seqidno.1)；r：ggtcgactcatttcgcccaccttttaac(seqidno.))，克隆目的基因ghdtx27，并构建pwm101-35s:ghdtx27重组载体，转化农杆菌gv3101感受态细胞，通过蘸花法侵染野生型拟南芥(col-0)。用于转化的渗透培养基包含ms4.3g/l，蔗糖50g/l(5％)，mes0.5g/l，silwet-77200μl/l(0.02％)，6-ba0.01mg/l，ph5.7。t0代转基因系在含有50mg/l潮霉素的1/2ms培养基进行阳性筛选，为最大限度地提高发芽率，首先在4℃条件下春化3天打破种子休眠，后将幼苗转移至光照培养箱，条件设定为22℃，16h光照/8h黑暗。选择培养基中培养一周后，当幼苗发育至3-4片子叶时，将幼苗移栽到以土壤为生长培养基的小盆中，幼苗(t0)生长到成熟，收获t1代种子。t1代种子在潮霉素选择培养基上发芽，通过检查选择培养基中幼苗存活与死亡的分离比(3:1)鉴定单拷贝系。然后t2代种子再次在潮霉素选择培养基上萌发，通过检查选择培养基中所有幼苗存活来鉴定单拷贝系。在t2代幼苗，通过qrt-pcr，对基因ghdtx27(f:atggtgtagaaggaaagg(seqidno.3)；r:cgactgatgattgaaggt(seqidno.4))的表达株系进行筛选，得到三个高表达的纯合株系(oe-2，oe-3和oe-9)，t2代幼苗生长成熟后，收获t3代种子，进行表型调查。
实施例2发芽率和根伸长测定
检验转基因系和野生型拟南芥种子对aba、盐、干旱和冷胁迫的耐受性。t3代种子经消毒，4℃春化，播种至分别含有浓度为0、0.5、1和2μmaba的1/2ms固体培养基，分别含有浓度为0、100、200和300mm甘露醇的1/2ms固体培养基和分别含有浓度为0、100、150和200mmnacl的1/2ms固体培养基，进行aba、干旱及盐胁迫处理，此外播有转基因纯合系及野生型拟南芥种子的1/2ms固体培养基置于4℃进行冷胁迫处理，10天后对野生型和转基因株系的发芽率进行统计。
检验转基因系和野生型拟南芥幼苗对aba、盐、干旱和冷胁迫的耐受性。转基因纯合系及野生型拟南芥种子经消毒，4℃春化，播种至1/2ms固体培养基，培养6天后，记录幼苗根长及鲜重。将幼苗移至分别含有浓度为0、0.5、1和2μmaba的1/2ms固体培养基，分别含有浓度为0、100、200和300mm甘露醇的1/2ms固体培养基和分别含有浓度为0、100、150和200mmnacl的1/2ms固体培养基，进行aba、干旱及盐胁迫处理，此外移有转基因纯合系及野生型拟南芥幼苗的1/2ms固体培养基置于4℃进行冷胁迫处理，垂直生长6天后测定野生型和转基因拟南芥根长伸长量及鲜重变化。
实施例3过表达ghdtx27拟南芥对盐、干旱和冷胁迫耐受性的响应及叶绿素含量、叶片相对含水量、离子电导率、离体叶片失水测定
t3纯合转基因系用10％漂白剂溶液(v/v)灭菌10min并用无菌水洗涤3次。然后将灭菌的种子铺在1/2ms培养基上，在4℃下春化3天，移至22℃，16h光照/8h黑暗的光周期生长室。8天后，将幼苗移栽到含有营养土的小盆中，其中蛭石与腐殖质的混合比例为1:1。对生长3周的幼苗，分别进行盐(250mmnacl)、干旱处理，在处理的第8天，对对照组及处理组的野生型和转基因拟南芥的叶绿素含量、叶片相对含水量、离子电导率、离体叶片失水进行测定，并在处理后的第8天及第12天记录野生型和转基因拟南芥的表型；对生长4周的幼苗，在-10℃低温下处理3h，后转移至4℃处理4h，对对照组及处理组的野生型和转基因拟南芥的叶绿素含量、叶片相对含水量、离子电导率、离体叶片失水进行测定，并记录野生型和转基因拟南芥的表型。
从处理和对照组样品中获得500mg的叶片，置于5ml乙醇(99.9％)中，并在80℃的水浴加热20min，使用合适的消光系数，检测总叶绿素含量，叶绿素含量(mg/gfw)＝100×a654/(39.8×fw)。测定处理和对照组样品中叶片相对含水量(rlwc)，取适量样品确定鲜重(fw)后，将叶片浸入dh2o2中24h，并记录其饱和重(sw)，在80℃下干燥48h，记录叶片干重(dw)，rlwc(％)＝(fw-dw)/(sw-dw)×100。离子电导率(il)测定，取处理和对照组样品的转基因株系和野生型拟南芥叶片0.5g，用ddh2o2冲洗，放入盛有5mlddh2o2的无菌试管中，对照组中未放入叶片，室温下放置24h，颠倒摇匀试管，使用电导率仪(ec)测得电导率t1，对照组为t2，而后将叶片在70℃下水浴20min，冷却至室温测得电导率t3，对照组为t4，离子电导率(il)＝(t1-t2)/(t3-t4)。离体叶片失水(elwl)测定，取适量叶片，测定其鲜重(fw)，在室温下放置24h后测定其萎蔫重(ww)，而后在80℃烘箱干燥48h得到干重(dw)，elwc＝(fw-ww)/dw。
实施例4过氧化氢酶(cat)、超氧化物歧化酶(sod)、丙二醛(mda)提取和测定
从野生型及过表达拟南芥的处理组和对照组中，收获0.5g新鲜叶样品并速冻于液氮中，-80℃保存备用。每个样品用含有50mm磷酸钾缓冲液和0.1mmna2edta(ph7.6)的5ml提取缓冲液涡旋。混合物以15000rpm离心15min，上清液用于分析各种酶。制备酶提取物的所有步骤均在4℃下进行。通过监测h2o2的下降水平来确定cat活性。
从处理组和对照组拟南芥植株获得三组重复叶片样品，每个样品1g，收集后在液氮中冷冻。将样品在含有50mmhepes和0.1mmna2edta(ph7.6)的10ml缓冲液的研钵中研磨2min。将匀浆在4℃以10000rpm离心20min，上清液用于sod分析，通过监测硝基蓝四唑(nitrobluetetrazolium，nbt)光化学还原的抑制来测定sod活性。为测定总sod，制备5ml反应混合物，其包含50mmhepes(ph7.6)，0.1mmedta，50mmna2co3(ph10.4)，13mmmet，0.025％(w/v)tritonx-100，75μmnbt，2μmvb2和等量的酶提取物，在350μmol/m2/s的光照强度下照射10min。在对照反应中，除了用等体积的磷酸盐缓冲液(ph7.8)代替粗酶之外，所有步骤和组分与上述相同。在560nm，以抑制50％nbt光化学还原所需的酶量，作为sod的酶活性单位。
实施例5拟南芥rna提取，逆境胁迫响应基因qrt-pcr分析
分析转基因拟南芥中逆境胁迫响应基因的表达，对生长3周的幼苗，分别进行盐(250mmnacl)、干旱处理，在处理的第4天，取对照组及处理组的野生型和转基因拟南芥的适量叶片样品；对生长25天的幼苗，在-10℃低温下处理3h，后转移至4℃处理4h，取对照组及处理组的野生型和转基因拟南芥的适量叶片样品。使用rna试剂盒(easyspinplusplantrnakit，aidlab)提取样品总rna。利用琼脂糖凝胶电泳和nanodrop2000分光光度计测定每个rna样品的质量和浓度。利用反转录试剂盒transcript-all-in-onefirst-strandcdnasynthesissupermix(transgenbiotech,beijing,china)将提取的rna反转录成cdna，使用荧光染料(fastastartuniversalsybr-greenmaster，rox，roche)，以拟南芥atactin2(f:ttgtgctggattctggtgatgg(seqidno.5)；r:ccgctctgctgttgtggtg(seqidno.6))作为内参基因，通过逆境胁迫响应基因的特异性引物，进行qrt-pcr分析。qrt-pcr反应体系：总体积为20μl，包含10μlsybr荧光染料，2μlcdna模板，6μlddh2o2和2μl引物(上下游引物各1μl)。pcr反应程序为：95℃10min；循环阶段：95℃5s，60℃30s和72℃30s，40个循环；溶解曲线阶段：95℃15s，60℃1min，95℃30s和60℃15s。采用2-△△ct法计算相对表达量，每个样品进行3次生物学重复和3次技术重复。
本发明比较了野生型拟南芥(wt)及过表达ghdtx27转基因拟南芥对盐、干旱和冷胁迫的耐受性，比较盐、干旱和冷处理后的植株，结果显示盐、干旱和冷胁迫下野生型拟南芥表现出明显的叶片失绿，生长发育受阻，而过表达的转基因系显示出更好的生长态势，表明该基因对植物耐盐、干旱和冷胁迫起到显著的作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>申请人名称中国农业科学院棉花研究所
<120>名称棉花基因ghdtx27在植物耐盐、干旱和冷胁迫方面的应用
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
cggatccatggatggtgcccatcgg25
<210>2
<211>28
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
ggtcgactcatttcgcccaccttttaac28
<210>3
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
atggtgtagaaggaaagg18
<210>4
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
cgactgatgattgaaggt18
<210>5
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
ttgtgctggattctggtgatgg22
<210>6
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
ccgctctgctgttgtggtg19