本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种海洋石油污水处理微生物菌剂及其制备方法。
背景技术：
石油污染大多发生在海洋环境当中，对海洋及其周边生态环境的危害极其严重，不仅引起大面积海域缺氧，致使鱼、虾、贝类和海鸟死亡，浮油污染海滩，还会造成海滩荒芜，破坏海产养殖和盐田生产，毁坏滨海旅游区，降低海洋生态系统的服务功能和价值；此外，许多石油烃类特别是多环芳烃还可以通过食物链进入鱼、虾、贝类体内，影响其经济价值，并最终通过食物富集进入人体，危害人类健康。因其强烈的持续危害性，石油污染成为了海洋生态环境的最大威胁。
石油污染主要归因于海上溢油漏油事故和船舶污油水的排放。船舶油污水主要由船舶压舱水、含油洗舱水和机舱水构成，据统计目前我国各类港口年产船舶油污水高达2000万吨，imo资料统计，由于石油运输每年进入海洋的147万吨石油中，有70万吨是随着船舶压舱水、洗舱水和机舱水入海造成，其中30万吨是随机舱水排放入海造成的。船舶污油水的去向是一个不容忽视的问题，发展船舶污油水处理技术是减少海洋石油污染的根本措施。
海洋石油污水不仅污染物成分复杂，还含有大量的盐分，且浓度变化频繁，这为污水的处理增添了许多不确定因素。目前，石油污染水体的修复方式分为两种，一种是原位处理(insitu)，即对污染的水体不作搬运或输送，在原场所进行修复的方法。对于被石油烃污染的海域，原位处理方法有围油栏、撇油器、吸油材料、就地燃烧、投放化学氧化剂等方式。这类方法存在油污处理不彻底、容易造成二次污染等问题。另一种是异位处理(exsitu)，即将石油污水移送至污水处理场所进行处理，达标后排放。异位处理方法主要通过物理回收、化学乳化和生物降解协同配合完成。物理和化学的方法虽在石油污染原位处理方面应用较多，但对石油烃的清除能力有限，且容易造成二次污染，而微生物法清除石油烃，则是采用能以石油烃为碳源进行生长代谢的特定微生物菌剂吸收、并通过自身物质代谢降解石油烃，将其转化为菌体组成成分和无污染的co2，从而达到治理石油污染的目的。在微生物处理石油污染过程中，石油烃首先被氧化成醇，在醇脱氢酶的作用下被氧化为相应的醛，醛则通过醛脱氢酶的作用进一步氧化成脂肪酸，进而参与tca循环，被逐步降解。环烷烃的生物降解则是从氧化为一元醇开始的；芳香烃类化合物的降解代谢途径是在氧分子及酶的作用下形成邻苯二酚衍生物的共同代谢中间体，然后再进一步经过氧分子及开环酶的作用，使其形成直链分子，最后再分解进入tca循环，实现长链的降解。对于海洋船舶油污水的异位处理，采用微生物法处理石油污水，是当今世界公认的攻克石油污染难题的理想途径，其优势体现在：(1)石油污染物降解彻底，且不会造成二次污染，(2)无可燃性，使用安全方便，操作简单，(3)成本低廉、无腐蚀性，(4)环境适应性强，可适用于不同的温度条件，并可耐受高盐环境，(5)适用范围广。
目前，发现能降解石油烃的微生物有100余属200多种以上，能够降解石油烃的细菌主要有：假单胞菌属(pseudomonas)、节杆菌属(arthrobacter)、不动杆菌属(acinetobacter)、产碱杆菌属(alcaligennes)、微球菌属(microcoecus)、棒状杆菌属(corynebacterium)、黄杆菌属(flavobacterium)、红球菌属(rhodococcus)、无色杆菌属(acheromobacter)、芽孢杆菌属(bacillus)、黄单胞杆菌属(xanthomonas)等。这些石油烃降解细菌都来自淡水或土壤当中，难以适应海洋或港口石油污水的高盐环境，对于处理船舶油污水具有相当的局限性。另一方面，国内对于海洋石油污水处理及高盐环境下石油烃降解微生物的筛选也做了一定的工作。郑洲等从385株南极海洋细菌中筛选出1株假交替单胞菌和1株科尔韦尔氏菌，二者在15℃时对柴油的降解率分别达到43.95％和62.47％。林学政从中国第二次北极科考采集的海洋沉积物中分离筛选了26株石油降解菌，结果表明其中三株对原油的降解率可分别达到30％-50％，分离到的石油烃降解菌以假交替单胞菌属为优势菌群，占42％。
石油烃成分非常复杂，没有任何一种微生物能降解石油中的所有组分。国际上的研究表明，与单菌降解相比，复合菌群能降解更宽范围的石油烃。deppe等研究了北极海域中分离的9株细菌的共生体对原油的降解潜力，结果表明细菌共生体可以降解不同的烷烃，包括直链烷烃、支链烷烃和芳香烃。这一研究说明复合菌群是石油烃污染物处理的理想工具。同单一菌种体系相比，人工合成的复合菌群具有更好的协作性，适于同时完成多项复杂工作，且菌群间相互作用呈动态平衡，具有更强的环境适应性和功能稳定性；同复杂的天然菌群系统相比，则具有更好的操控性和安全性。
因此，基于系统生物学和生态学的理念，在掌握了不同石油降解菌的功能特性以及菌群间的作用规律的基础上，对适用于石油污染环境修复的复合菌群进行人工设计，开发功能明确、稳定可靠、易于控制的复合菌剂产品，是海洋和港口石油污水生化处理技术发展的新趋势。
技术实现要素：
鉴于此，有必要针对上述问题提供一种高效应对海洋及港口石油污水微生物菌剂的制备方法。此微生物菌剂制备过程简单，设备需求简要，操作简易，需要的环境条件温和。它能同时有效降解石油污水大量存在的直链烃、支链烃及芳香烃。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种用于高效处理海洋石油污水的复合菌剂，其组成包括4种菌株，分别为亚德食烷菌(alcanivoraxjadensis,菌株编号为216l-s13-9)、优雅食烷菌(alcanivoraxvenustensis,菌株编号为216l-s19-12)、威尼斯不动杆菌(acinetobactervenetianus,菌株编号为wp02421)、麦氏交替单胞菌(alteromonasmacleodii,菌株编号为ma-s13-6)；所述4种菌株保藏编号分别为1a08173，1a08174，1a00294，1a08617。
进一步的，所述亚德食烷菌菌株在菌剂中的浓度为1×107-109cfu/ml；所述优雅食烷菌菌株在菌剂中的浓度为1×107-109cfu/ml；所述威尼斯不动杆菌菌株在菌剂中的浓度为1×107-109cfu/ml；所述麦氏交替单胞菌菌株在菌剂中的浓度为1×107-109cfu/ml。四种菌的浓度取值可在所属范围内任取，所述4种菌的浓度取值可以完全相同、部分相同或完全不同，且经实践验证对污水的降解效果与取相同浓度值时相当。
进一步的，所述的菌株的保藏条件分别为：亚德食烷菌(216l-s13-9)及优雅食烷菌(216l-s19-12)所用培养基为1001号培养基，威尼斯不动杆菌(wp02421)培养基为0033号培养基，麦氏交替单胞菌(ma-s13-6)所用培养基为0471号培养基。
进一步的，所述的菌株的保藏方法均为菌液和40％甘油(v/v)1:1-1:1.5混合，置于-80℃冰箱保藏。
进一步的，本发明的用于高效处理海洋石油污水的微生物复合菌剂的生产方法，包括：先将各菌株进行种子液纯培养获得每种株菌的纯种子液，然后再同时将4种菌种接种于菌剂培养基(s培养基)中培养而形成。
进一步的，所述微生物菌剂的制备方法，其中种子液培养基中柠檬酸钠为唯一碳源。
进一步的，所述微生物菌剂的制备方法，其中，所述菌剂培养基的碳源为柠檬酸钠和0#柴油。
进一步的，所述微生物菌剂的制备方法，其中菌株种子培养基和菌剂培养基ph值起始均为5.8-7.8。
本发明有益效果：
本发明菌剂中不同菌株在处理石油污水中发挥不同功能，协同作用，相互促进，从而达到好的处理效果。可以明显降低石油污水中的含油量，包括是石油中大量存在的各种直链烃、支链烃及芳香烃，有助于实现海洋石油污水高效处理的微生物菌剂的产业化和商品化。
附图说明
图1：216l-s13-9处理的含油培养基中剩余油量3天的变化趋势；其中1-13为直链烃(c11-c24，不含c23)；14-15为支链烃(c15和c19)；16-27为芳香烃(c9-c12)。
图2：216l-s19-12处理的含油培养基中剩余油量3天的变化趋势；其中1-13为直链烃(c11-c24，不含c23)；14-15为支链烃(c15和c19)；16-27为芳香烃(c9-c12)。
图3：wp02421处理的含油培养基中剩余油量3天的变化趋势；其中1-13为直链烃(c11-c24，不含c23)；14-15为支链烃(c15和c19)；16-27为芳香烃(c9-c12)。
图4：ma-s13-6处理的含油培养基中剩余油量3天的变化趋势；1-13为直链烃(c11-c24，不含c23)；14-15为支链烃(c15和c19)；16-27为芳香烃(c9-c12)。
图5：本发明复合菌剂处理的含油培养基中剩余油量3天的变化趋势；1-13为直链烃(c11-c24，不含c23)；14-15为支链烃(c15和c19)；16-27为芳香烃(c9-c12)。
图6：216l-s13-9、216l-s19-12和wp02421菌处理的含油培养基中剩余油量3天的变化趋势；其中1-13为直链烃(c11-c24，不含c23)；14-15为支链烃(c15和c19)；16-27为芳香烃(c9-c12)。
具体实施方式
为了更好的说明本发明技术方案所要解决的问题、采用的技术方案和达到的有益效果，现结合具体实施方式进一步阐述。值得说明的是，本发明技术方案包含但不限于以下实施方式。
本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。
本发明所涉及的培养基组成如下：
活化菌株液体培养基(简称为液体hlb)：胰蛋白胨(8-12g/l)，酵母提取物(4-6g/l)，nacl(25-35g/l)，水为去离子水。
活化菌株固体培养基(简称为固体hlb)：胰蛋白胨(8-12g/l)，酵母提取物(4-6g/l)，nacl(25-35g/l)，琼脂粉(1.2-2.0g/l)，水为去离子水。
种子液培养基(简称为s)：二水合柠檬酸钠(15-25g/l)，氯化铵(0.8-1.5g/l)，三水合磷酸氢二钾(0.2-0.8g/l)，磷酸二氢钾(0.1-0.4g/l)，水为人工海水。
菌剂培养基/菌剂处理实验培养基(简称为d)：氯化铵(0.8-1.5g/l)，二水合柠檬酸钠(2-5g/l)，0#柴油(0.2％-1.5％(v/v))，三水合磷酸氢二钾(0.2-0.8g/l)，磷酸二氢钾(0.1-0.4g/l)水为人工合成海水。
1001号培养基：乙酸钠(0.5-1.5g/l)，蛋白胨(8-12g/l)，酵母粉(1-3g/l)，普通肉汁(0.1-0.8g/l)，硝酸铵(0.1-0.3g/l)，柠檬酸三钠(0.1-0.8g/l)，磷酸二氢钾(0.2-0.8g/l)，ph7.0-7.8，水为人工合成海水。
0033号培养基：酵母粉(3-7g/l)，蛋白胨(8-12g/l)，氯化钠(5-15g/l)，ph6.5-7.5，水为去离子水。
0471号培养基：酵母粉(0.5-3g/l)，蛋白胨(2-8g/l)，牛肉膏(0.1-3g/l)，正磷酸铁(0.005-0.3g/l)，ph6.5-7.5，水为去人工合成海水。
人工合成海水：氯化钠(20-28g/l)，六水硫酸镁(8-14g/l)，硫酸钠(3-5g/l)，六水氯化钙(1-3g/l)，氯化钾(0.5-1.0g/l)，溴化钾(0.05-0.2g/l)，硼酸(0.01-0.05g/l)，九水硅酸钠(4-8mg/l)，六水氯化锶(0.02-0.08g/l)，氟化钠(1-5mg/l)，硝酸铵(1-6mg/l)，磷酸铁(0.5-1.5mg/l)，ph6.8-7.8，水为去离子水。
实施例一制备本发明石油污水处理微生物菌剂
菌株活化培养：将-80℃保存的各菌株甘油管菌种接种于装有2-5mlhlb液体培养基的15ml培养管中，置于20-30℃、180-220r/min的振荡摇床中培养48-120h，然后将活化的菌液分别划线于hlb固体培养基中置于20-30℃恒温培养箱中复壮培养24-96h，将平板上的菌落各自接种于装有2-5mlhlb液体培养基的15ml培养管于20-30℃、180-220r/min的振荡摇床中过夜(12-16h)培养，以1％接种量接种于s培养基(种子液培养基)中，置于20-30℃、180-220r/min的振荡摇床中培养12-18h，再按0.5-2.5％接种量转接于s培养基中培养(20-30℃、180-220r/min)10-15h得到各菌株种子液。
本发明石油污水处理微生物菌剂制备：将上述得到的各菌株种子液接种入菌剂培养基(d培养基)中，20-30℃、180-220r/min的振荡摇床中培养8-16h获得菌剂，其中四株菌在菌剂中浓度分别都为1×107-109cfu/ml。
实施例二本发明所述的石油污水处理微生物菌剂功能评价
单菌株功能评价：将发明中所述的4株菌分别按实施例1方法进行菌株活化培养，在5000-8000转/分下离心3-6分钟收集菌体，将收集得到的菌体分别以等体积s培养基重悬，分别以0.5-2.5％比例接种于d培养基，将所述体系置于20-30℃、180-220r/min的恒温摇床中培养。从0h开始，每24h取样，连续取样3次，以有机溶剂萃取后进行gc-ms检测油剩余量。
本发明所述的石油污水处理微生物菌剂功能评价方法是：将发明中所述的4株菌分别按上述菌株活化培养，在5000-8000转/分下离心3-6分钟收集菌体，将收集得到的菌体重悬入s培养基，使四株菌在s培养基中浓度分别都为1×108cfu/ml，再以0.5％-2.5％的转接量接入d培养基，至于20-30℃、180-220r/min的振荡摇床中处理3天。从0h开始，每24h取样，连续取样3次，以有机溶剂萃取后，通过gc-ms方法对被降解物质定性分析，并测定相对剩余油量，得到降解率。
按照本发明所述的石油污水处理微生物菌剂功能评价方法，处理以下2组对照组：
复合菌剂对照组1：制备方法与本发明复合菌剂相同，区别在于：对照组1中四种菌株的浓度均为1×106cfu/ml。并同样的取样，用gc-ms方法对被降解物质定性分析，并测定相对剩余油量，得到降解率。
复合菌对照组2：制备方法与本发明复合菌剂相同，区别在于：对照组2中仅3种菌株，分别为亚德食烷菌(216l-s13-9)、优雅食烷菌(216l-s19-12)和威尼斯不动杆菌(wp02421)，三种菌株的浓度均为1×108cfu/ml。并同样的取样，用gc-ms方法对被降解物质定性分析，并测定相对剩余油量，得到降解率。
其中gc-ms条件为：气相色谱(agilent7890a)；质谱检测器(agilenthp5975c)；色谱柱为hp-5ms(30m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱；进样温度和检测温度分别是300，230℃，进样量1ul，采取不分流进样，辅助加热区、四级杆温度分别为280，150℃，载气为氮气，流速为1ml/min。升温程序：60℃保持1min，以5℃/min速度升温至300℃保持20min。ms采用全扫描，扫描范围(m/z)为40-600。
从gc-ms分析可以得出：
见图1，216l-s13-9菌在相同条件下对烷烃和芳香烃的处理效果最好，接菌72小时后对烷烃的去除率达到92％以上，对芳香烃的去除率达到90％以上。
见图2，216l-s19-12菌在相同条件下对直链烃、支链烃、芳香烃的处理效果接近，接菌48小时后三者去除率在94％以上。
见图3，wp02421菌在相同条件下对直链烃的处理效果最好，接菌48小时后对直链烃的去除率达到95％以上。
见图4，ma-s13-6菌在相同条件下对芳香烃的处理效果最好，接菌72小时后对直链烃的去除率达到92％以上。
单菌株3天后处理烃类平均效率都在85％以上，其中，wp02421和216l-s13-9处理效果最好，所以烃类去除平均效率可高达94％以上。
见图5，本发明所述微生物菌剂对石油污水中直链烃、支链烃及芳香烃的降解效率都高于任何单独菌株，24h内对链烃和芳香烃的去除高达95％以上。
对照组1的复合菌剂在第三天检测时发现各个目标化合物的残留率都大于91％，即去除率不到10％。
见图6，对照组2，216l-s13-9、216l-s19-12和wp02421菌(每种菌浓度都为1×108cfu/ml)混合后处理石油污水的效果，24h后，链烃类的平均去除效率约为82％，芳香烃的平均去除效率约为87％；3天后，对石油污水中直链烃、支链烃及芳香烃的降解效率高于94％。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。