本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种植物组织中高效提纯病毒双链rna基因组的方法及其应用。
背景技术
植物病毒中大部分病毒是rna病毒，尤其是双链rna(dsrna)病毒。高浓度、高纯度提纯dsrna病毒的双链rna基因组，是对dsrna病毒遗传、变异进行分析的基础。由于病毒粒子提纯困难，且在寄主体内含量低、易降解等原因，使从提纯病毒粒子中提取病毒基因组dsrna的方法效率低下。例如，属于呼肠孤病毒科斐济病毒属的水稻黑条矮缩病毒(riceblackstreakeddwarfvirus，rbsdv)可侵染水稻、大麦、小麦、玉米、高粱、马唐、白草和稗草等多种禾本科作物和杂草，引起水稻的黑条矮缩病和玉米的矮缩病。该病毒粒子呈直径70～75nm的球形，含10条dsrna病毒基因组。但该病毒粒子含量低且不稳定，目前无法从植物组织中分离高质量的病毒粒子用于双链rna的提取。而dsrna在热条件下稳定，对rna酶的降解抗性强，所以直接从植物叶片组织中纯化双链rna是一个较好的替代方案。
目前dsrna提纯方法主要有以下几种：1)是用trizol试剂提纯动植物组织中的总rna，然后用dna酶和rna酶消化总rna，除去dna和单链rna而获得dsrna。但这种方法提取dsrna的质量和效率非常低，往往达不到下游基因组分析的要求；2)提取的总rna用氯化锂或氯化铯进行密度梯度离心的方法提取纯化dsrna；但这种方法由于提取dsrna的数量有限、操作繁琐、费用昂贵而限制其推广应用3)用纤维素粉吸附dsrna的纯化方法。1966年franklin等第一次用纤维素粉和一定浓度的乙醇将噬菌体r17的核糖体rna中分离出dsrna形式的复制中间体。作者将细胞破碎后除去蛋白质等杂质，留下总核酸。然后加入将总核酸吸附在纤维素粉上，用含有15％乙醇的ste溶液洗去dna、核糖体rna以及单链rna，再用不含乙醇的ste洗脱可以得到dsrna形式的复制中间体。morris和dodds于1979年用酚和氯仿变性蛋白提取植物和真菌总核酸，然后用纤维素粉吸附成功从感染病毒的植物和真菌中提取出了病毒基因组dsrna。然而，这些用纤维素粉纯化dsrna的方法因目前该类型的纤维素粉(cf-11)停产而无法再进行，且该纯化方法使用纤维素粉提取dsrna的过程发生在离心管内，需要反复悬浮、离心纤维素粉后吸除上清的方式去除纤维素粉上吸附的ssrna和dna，得到相对纯净的dsrna。这个过程耗时较长、操作繁琐、且在反复悬浮吹打纤维素粉的过程中会损失较多dsrna，故其纯化dsrna的效率很低。本发明克服目前技术困难，筛选到一种新的高效吸附dsrna纤维素粉--c6288纤维素粉，并使用开发的制备管对纤维素粉进行固定，通过将纤维素粉固定于制备管中制作为便捷的成品纯化柱，再将制备柱套入2ml离心管可以实现吸附dsrna以及之后清洗纯化步骤只要通过离心的方式就可以完成，从而大大简化了实验操作步骤、降低实验难度、缩短实验时间、减少了dsrna在提取过程中的损耗。通过使用本方法针对水稻叶片中rbsdv基因组dsrna进行了提取纯化，采用250mgc6288纤维素粉制备的纯化柱，提取80mg感染rbsdv的水稻样品中的dsrna效果最佳。该提纯方法提取到高质量的10条rbsdv病毒基因dsrna，以提纯的rbsdv基因组dsrna为模板用第一至第三代核酸测序技术进行基因组测序，根据测序的数据结合生物信息学技术，分析了该病毒的基因组准种结构、遗传变异，并利用基因组测序数据进行rt-pcr和qrt-pcr引物设计和方法建立，从而为该病毒病的致病机制的阐明和准确检测提供技术手段。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种植物组织中高效提纯病毒双链rna基因组的方法及其应用。本发明具体采用的技术方案如下：
用于植物组织中高效提纯病毒双链rna基因组的dsrna过滤纯化柱，该纯化柱由离心管、双层miracloth膜、滤片以及带盖子的中心过滤柱组成，双层miracloth膜置于所述中心过滤柱底部，所述滤片置于双层miracloth膜上；所述中心过滤柱嵌套式置于离心管内。
上述dsrna过滤纯化柱中，各部件的具体参数可采用如下：离心管采用外直径1.0cm、内直径0.9cm、高度4.2cm的2ml塑料离心管；所述双层miracloth膜的直径为0.75cm；所述滤片直径0.75cm，厚度0.1cm，孔径20μm；所述中心过滤柱采用外直径0.8cm、内直径0.7cm、高度3.1cm的塑料中心过滤柱。
一种植物组织中高效提纯病毒双链rna基因组的方法，其采用上述特制的dsrna过滤纯化柱实现。
该方法的具体实现步骤依次如下：
1)取80mg感染双链rna病毒的植物叶片组织，在研钵中加液氮后研磨成泛白的粉末状，快速转移至rnasefree的2.0ml离心管中；
2)上述离心管中加入500μlph8.0的含1％sds(十二烷基硫酸钠，sodiumdodecylsulfate)、0.1％β-mercaptoethanol、2mmol/ledta和200mmol/lnacl的20mmol/ltris-hcl核酸提取液和10mg聚乙烯吡咯烷酮，震荡涡旋1min；
3)加入500μl体积比为25:24:1的酚:氯仿:异戊醇，涡旋1min，20000g离心5min，若上清浑浊，重复此步骤；
4)取离心后的上清移至新1.5mleppendorf离心管管中，加入无水乙醇使其终浓度为16.6％，上下颠倒混匀，20000g离心3min；
5)在所述的dsrna过滤纯化柱的中心过滤柱底部放置好双层miracloth膜和滤片后，加入250mgsigma公司的c6288纤维素粉，然后将装有纤维素粉的中心过滤柱套入过滤纯化柱的2ml的离心管中，将步骤4)中的上清移至有纤维素粉的中心过滤纯化柱中，将带有中心过滤柱的离心管整体于10000g离心5sec；
6)加入400μlph8.0含16％无水乙醇、1mmedta和100mmnacl的10mmtris-hcl核酸清洗液，10000g离心5sec，弃去2.0ml离心管中的滤液，重复该洗涤步骤三次；然后10000g离心5sec彻底除去中心过滤纯化柱中的核酸清洗液；
7)将有纤维素粉的中心过滤柱置于新的1.5mleppendorf离心管中，加入400μlph8.0含1mmedta和100mmnacl的10mmtris-hcl核酸洗脱液，10000g离心5sec，收集洗脱液，重复此步三次；
8)在含有dsrna的核酸洗脱液中加入1/10倍体积ph5.2的3mol/l乙酸钠和2.5倍体积的无水乙醇；
9)-20℃静置10min后，20000g离心5min沉淀dsrna；
10)去上清，加入预冷的1ml75％乙醇洗涤沉淀，20000g离心5min，去上清，重复此步骤1次；
11)去上清，室温静置干燥后加入30μlph8.0含2mmol/ledta和200mmol/lnacl的20mmol/ltris-hcl核酸溶解液溶解dsrna，得到dsrna提取液。
12)取1μldsrna提取液用nanodrop检测浓度，取15μl进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，分析提取dsrna的浓度和效果。
上述植物组织中高效提纯病毒双链rna基因组方法的用途，该方法提纯的病毒基因组dsrna可用于病毒基因组的第一代核酸测序和第二、第三代核酸的深度测序，并进而用于病毒群体结构、变异进化分析和病毒检测引物的设计和病毒rt-pcr、qrt-pcr建立。
本发明与现有技术相比具有的有益效果：1)本发明筛选到一种新的高效吸附dsrna纤维素粉--c6288纤维素粉，并结合开发的制备管对纤维素粉进行固定，制作成便捷的提取纯化柱，大大简化了dsrna提取的实验操作步骤、降低实验难度、缩短实验时间、提高了dsrna提取效率。2)利用本发明的dsrna提纯方法纯化的dsrna病毒基因组更适应用于病毒基因组的常规测序和深度测序及病毒基因组的群体结构、变异进化分析，并利用基因组测序数据进行rt-pcr和qrt-pcr引物设计和方法建立，从而为该病毒病的致病机制的阐明和准确检测提供技术手段。
附图说明
图1dsrna过滤纯化柱的组成结构示意图；图中附图标记为：中心过滤柱1、滤片2、双层miracloth膜3、离心管4；
图2四种不同纤维素粉对病毒基因组dsrna提取效率比较
a：四种不同纤维素粉提取dsrna的0.8％琼脂糖凝胶电泳结果；b：四种不同纤维素粉提取的dsrna浓度。
图3不同纤维素粉含量的纯化柱对病毒基因组dsrna提取的影响
a：分别用含纤维素粉50mg、100mg、150mg、200mg、250mg或300mg的纯化柱提取的dsrna的0.8％琼脂糖凝胶电泳结果；b：分别用含纤维素粉50mg、100mg、150mg、200mg、250mg或300mg的纯化柱提取的dsrna浓度检测。图4水稻样品量对纯化柱提取病毒基因组dsrna的影响
a：分别用20mg、40mg、60mg、80mg、100mg水稻样品提取的dsrna的0.8％琼脂糖凝胶电泳结果；b：分别用20mg、40mg、60mg、80mg、100mg水稻样品提取的dsrna浓度检测。
具体实施方式
植物组织中高效提纯病毒双链rna基因组的方法需要本发明特制的dsrna过滤纯化柱。
dsrna过滤纯化柱由外直径1.0cm、内直径0.9cm、高度4.2cm的2ml塑料离心管，millipore公司直径0.75cm的双层miracloth膜，直径0.75cm、厚度0.1cm、孔径20μm的滤片，以及外直径0.8cm、内直径0.7cm、高度3.1cm带盖子的塑料中心过滤柱组成。其结构如图1所示，双层miracloth膜3置于中心过滤柱1底部，滤片2置于双层miracloth膜3上，带有滤片2和双层miracloth膜3的中心过滤柱1以嵌套式的方式放置于离心管4内。该过滤纯化柱可直接整体进行离心，并且离心完毕后可将过滤纯化柱1重新取出。滤片2上具有过滤孔，不影响滤液通过，但双层miracloth膜3能够起到阻挡纤维素粉流出的作用，因此滤液则能够在离心力作用下，通过滤片2和双层miracloth膜3后从中心过滤柱1底部进入离心管4中。该特制的dsrna过滤纯化柱，可以实现吸附dsrna以及之后清洗纯化步骤只要通过离心的方式就可以完成，从而大大简化了实验操作步骤、缩短实验时间、减少了dsrna在反复悬浮吹打纤维素粉的过程中的损耗。
植物组织中高效提纯病毒双链rna基因组的方法包括如下步骤，各步骤没有特殊说的情况下均顺次执行。
1)取80mg感染双链rna病毒的植物叶片组织，在研钵中加液氮后研磨成泛白的粉末状，快速转移至rnasefree的2.0ml离心管中；
2)上述离心管中加入500μlph8.0的含1％sds(重量/体积，g/ml)、0.1％β-mercaptoethanol(体积浓度)、2mmol/ledta和200mmol/lnacl的20mmol/ltris-hcl核酸提取液和10mg聚乙烯吡咯烷酮，震荡涡旋1min；
3)加入500μl体积比为25:24:1的酚:氯仿:异戊醇，涡旋1min，20000g离心5min，若上清浑浊，重复此步骤；
4)取离心后的上清移至新1.5mleppendorf离心管管中，加入无水乙醇使其终浓度为16.6％(体积浓度)，上下颠倒混匀，20000g离心3min；
5)在开发的过滤纯化柱的中心过滤柱底部先加入双层miracloth膜，再垫上滤片后，加入250mgsigma公司的c6288纤维素粉，然后将装有纤维素粉的中心过滤柱套入开发的过滤纯化柱的2ml的离心管中，将上一步中的上清移至有纤维素粉的中心过滤纯化柱中，然后将带有中心过滤柱的离心管整体于10000g离心5sec；
6)加入400μlph8.0含16％无水乙醇、1mmedta和100mmnacl的10mmtris-hcl核酸清洗液，10000g离心5sec，弃去2.0ml离心管中的滤液，重复洗涤该步骤三次；10000g离心5sec彻底除去中心过滤纯化柱中的核酸清洗液；
7)将有纤维素粉的中心过滤柱置于新的1.5mleppendorf离心管中，加入400μlph8.0含1mmedta和100mmnacl的10mmtris-hcl核酸洗脱液，10000g离心5sec，收集洗脱液，重复此步三次；
8)在含有dsrna的核酸洗脱液中加入1/10倍体积ph5.2的3mol/l乙酸钠和2.5倍体积的无水乙醇；
9)-20℃静置10min后，20000g离心5min沉淀dsrna；
10)去上清，加入预冷的1ml75％乙醇洗涤沉淀，20000g离心5min，去上清重复此步骤1次；
11)去上清，室温静置干燥后加入30μlph8.0含2mmol/ledta和200mmol/lnacl的20mmol/ltris-hcl核酸溶解液溶解dsrna；
12)取1μldsrna提取液用nanodrop检测浓度，取15μl进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，分析提取dsrna的浓度和效果。
该方法提纯的病毒基因组dsrna可用于病毒基因组的第一代核酸测序和第二、第三代核酸的深度测序，并进而用于病毒群体结构、变异进化分析和病毒检测引物的设计和病毒rt-pcr、qrt-pcr建立。
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
一、dsrna过滤纯化柱的制备
目前报道的dsrna提取方法中，使用纤维素粉提取dsrna的过程发生在离心管内，需要反复悬浮、离心纤维素粉后吸除上清的方式去除纤维素粉上吸附的ssrna和dna，得到相对纯净的dsrna。但这个过程耗时较长、操作繁琐、且在反复悬浮吹打纤维素粉的过程中会损失较多dsrna而得率低。本发明开发的dsrna过滤纯化柱如附图1所示，其由由外直径1.0cm，内直径0.9cm、高度4.2cm的2ml塑料离心管、millipore公司的直径0.75cm的双层miracloth膜、直径0.75cm、厚度0.1cm、孔径20μm的滤片、外直径0.8cm、内直径0.7cm、高度3.1cm带盖子的塑料中心过滤柱组成。使用时先将两层miracloth膜先置于中心过滤柱最底部，再放置滤片于miracloth膜上，并把装有滤片的中心柱套入2ml离心管中，通过这两种垫片材料实现阻挡纤维素粉流出，同时不影响滤液下流至2ml离心管。本发明提供的dsrna过滤纯化柱，通过将纤维素粉固定于中心过滤柱中，再将中心过滤柱套入2ml离心管可以实现吸附dsrna及之后清洗纯化步骤只要通过离心的方式就可以完成，这一改进使提取dsrna的操作更为简便，且大大缩短实验时间，大大提高dsrna的质量和提取效率。
二、高效吸附dsrna的纤维素粉的筛选
利用不同品系、规格的纤维素粉纯化rbsdv感染水稻叶片组织中的病毒dsrna基因组，分析它们各自的纯化效果，筛选能最高效吸附dsrna的纤维素粉。具体步骤如下：
1)取4份80mg感染rbsdv水稻叶片，分别加液氮研磨成泛白的粉末状，快速转移至4个rnasefree的2.0ml离心管中；2)每份样品中加入500μl核酸提取液(含有1％sds、0.1％β-mercaptoethanol、2mmedta，200mmnacl、20mmtris-hcl，ph8.0)和10mg聚乙烯吡咯烷酮(pvp)，震荡涡旋1min；3)加入500μl的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，涡旋1min，20000g离心5min；若上清浑浊，重复此步骤；4)取离心后的上清(约400μl)移至新1.5mleppendorf管中，加入80μl无水乙醇(使乙醇终浓度为16.6％，体积浓度)，上下颠倒混匀，20000g离心3min；5)在不同的dsrna过滤纯化柱的中心过滤柱底部加入miracloth膜和滤片后分别加入250mgc6288纤维素粉(sigma公司)、250mgs6790纤维素粉(sigma公司)、250mg50μm纤维素粉(克拉玛尔公司)和250mg90μm纤维素粉(克拉玛尔公司)，然后将装有纤维素粉的中心过滤柱套入2ml的离心管中，将上一步中的上清移至有纤维素粉的中心过滤柱中，10000g离心5sec；6)加入400μl核酸清洗液(含有16％无水乙醇、1mmedta、100mmnacl、10mmtris-hcl，ph8.0)，10000g离心5sec，弃去2.0ml离心管中的滤液，重复洗涤该步骤三次；10000g离心5sec彻底除去核酸清洗液；7)将有纤维素粉的中心过滤柱置于新的1.5ml离心管中，加入400μl核酸洗脱液(1mmedta，100mmnacl、10mmltris-hcl，ph8.0)，10000g离心5sec，收集洗脱液，重复此步三次；8)在含有dsrna的核酸洗脱液中加入1/10倍体积的3m乙酸钠(ph5.2)，2.5倍体积的无水乙醇；9)-20℃静置10min后，20000g离心5min沉淀dsrna；10)去上清，加入预冷的1ml75％乙醇洗涤沉淀，20000g离心5min，去上清重复此步骤1次；11)去上清，室温静置干燥后加入30μl核酸溶解液(2mmedta、200mmnacl、20mmtris-hcl，ph8.0)溶解dsrna。
选取四个型号的纤维素粉(c6288纤维素粉、s6790纤维素粉、50μm纤维素粉、90μm纤维素粉)，在4个中心过滤柱中分别加入250mgc6288纤维素粉、s6790纤维素粉、50μm纤维素粉、90μm纤维素粉，用于提取80mg感染rbsdv水稻样品中的dsrna，将提取出的dsrna溶解于30μl的核酸溶解液中，取1μl用nanodrop检测浓度，取15μl进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。从附图2a中可以看出sigma公司的c6288纤维素粉提取出的dsrna的浓度最高，其次是s6790纤维素粉，而50μm纤维素粉、90μm纤维素粉对样品中dsrna提取效率较低，在0.8％琼脂糖凝胶中dsrna显示条带很淡。提取的dsrna浓度分析显示，用c6288纤维素粉、s6790纤维素粉、50μm纤维素粉和90μm纤维素粉提取的dsrna的浓度分别为110.5ng/μl、118.6ng/μl、48.3ng/μl、80.4ng/μl(图2b)。所提取的dsrna浓度检测结果与电泳结果较为一致，说明dsrna吸附效率最高的是c6288纤维素粉，将用于后续分析。
三、c6288纤维素粉最适用量的确定
确定吸附dsrna纤维素粉类型的基础上，对最适c6288纤维素粉含量的纯化柱进行确定，步骤如下：
1)取6份80mg感染rbsdv水稻叶片，分别加液氮研磨成泛白的粉末状，快速转移至6个rnasefree的2.0ml离心管中；2)每份样品中加入500μl上述核酸提取液(含有1％sds、0.1％β-mercaptoethanol、2mmedta，200mmnacl、20mmtris-hcl，ph8.0)和10mgpvp，震荡涡旋1min；3)加入500μl的酚:氯仿:异戊醇(体积比25:24:1)，涡旋1min，20000g离心5min(若上清浑浊，重复此步骤)；4)取离心后的上清(约400μl)移至新1.5mleppendorf离心管中，加入80μl无水乙醇(使乙醇终浓度为16.6％，体积浓度)，上下颠倒混匀，20000g离心3min；5)在dsrna纯化中心过滤柱底加入miracloth膜和滤片后分别加入50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mgc6288纤维素粉制备成不同纤维素粉含量的纯化柱，然后将装有纤维素粉的中心过滤柱套入2ml的离心管中，将上一步中的上清移至有纤维素粉的中心过滤柱中，10000g离心5sec；6)加入400μl核酸清洗液(含有16％无水乙醇、1mmedta、100mmnacl、10mmtris-hcl，ph8.0)，10000g离心5sec，弃去2.0ml收集管中的滤液，重复洗涤三遍。最后10000g离心5sec彻底除去核酸清洗液；7)将有纤维素粉的中心过滤柱置于新的1.5ml离心管中，加入400μl核酸洗脱液，10000g离心5sec，收集洗脱液，重复此步骤三遍；8)在含有dsrna的核酸洗脱液中加入1/10洗脱液体积的3m乙酸钠(ph5.2)，2.5倍洗脱液体积的无水乙醇；9)-20℃静置10min后20000g离心5min沉淀dsrna；10)去上清，加入预冷的75％乙醇洗涤沉淀，20000g离心5min，去上清重复此步骤一次；11)去上清，室温静置干燥，加入30μl核酸溶解液溶解dsrna。
取15μl提取的dsrna进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，取1μl用nanodrop检测浓度(ng/μl)。从附图3b中可以看出，制备的纯化柱中随纤维素粉量的增加提取的dsrna的浓度上升。0.8％琼脂糖凝胶电泳结果显示(附图3a)，随纤维素粉量的增加提取的dsrna量增加。虽然提高纤维素粉虽然有利于提高dsrna提取效率，但由于本方法中制备管容积有限，加入300mg纤维素粉后纯化柱的上样空间有限，操作不便，所以出于兼顾纤维素粉和样品的上样量，选取250mg为最适的纤维素粉用量。
四、dsrna纯化的最适样品量的确定
取20mg、40mg、60mg、80mg、100mg感染rbsdv水稻叶片，分别加液氮研磨成泛白的粉末状，快速转移至5个rnasefree的2.0ml离心管中。在5个中心过滤柱中分别加入250mgc6288纤维素粉后，根据上述实施例二和三的步骤分别提取20mg、40mg、60mg、80mg、100mg感染rbsdv水稻样品中的dsrna，并将提取出的dsrna溶解于30μl的核酸溶解液中。取15μl提取的液进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，取1μl用nanodrop检测提取液中dsrna浓度(ng/μl)。从琼脂糖凝胶电泳图4a可以发现，随样品量的增加提取的dsrna浓度增加。浓度测定结果如附图4b所示，提取液中dsrna提取量随植物样品量上升而增加，但在植物样品质量到达80mg后dsrna浓度增加幅度明显减少，说明含有250mg纤维素粉的纯化柱已达dsrna的承载上限。