酯型儿茶素吡咯烷生物碱及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物碱类化合物领域，具体地说涉及一种酯型儿茶素吡咯烷生物碱及其制备方法和应用。

背景技术：

茶叶中含有丰富的生物碱，占茶叶干物质的3％-5％。其中，大部分是嘌呤类生物碱，以及少量的嘧啶类生物碱。其中咖啡碱占3％-4％，可可碱占0.15％-0.2％，茶碱占0.02％-0.04％。研究表明，咖啡碱是茶叶中重要的滋味物质。而且，咖啡碱还具有强心、利尿、解毒、平喘等药理功能。

大叶茶，为云南特有的茶种，原产于云南西双版纳、普洱等地，是制作普洱茶的原材料，尤其是云南大叶种古树茶昔归、紫鹃加工制成的晒青毛茶，晒青毛茶是取茶树一芽一叶或者一芽二，三叶的鲜叶加工而成，加工只有晒青工序，最大程度地保持了大叶种茶的“天然性、原始性”，古树茶昔归，开汤，汤色淡黄清亮，入口即香，无杂味，味甘；三泡后回甘更明显，香气高锐，两颊与舌底生津，舌面感觉微涩，化得很快；四至六泡，香气如兰，冰糖香渐显，深受当地居民喜爱。

如果能从大叶茶中发现新型物质及开发出功能性活性成分，将有助加深我们对茶树在演化过程中，物质转化形成机制的认识，并且对合理开发利用大叶种茶提供重要参考，也会对农业和医药等领域作出重要贡献。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题之一是提供一种能够拮抗高糖所致细胞衰老的酯型儿茶素吡咯烷生物碱。酯型儿茶素吡咯烷生物碱，由式ⅰ或式ⅱ或式ⅲ或式ⅳ或式ⅴ或式ⅵ所示结构表示：

本发明所要解决的技术问题之二是提供上述酯型儿茶素吡咯烷生物碱在制备拮抗高糖所致细胞衰老药物中的用途。

具体可提供一种拮抗高糖所致细胞衰老药物，由上述酯型儿茶素吡咯烷生物碱和药用辅料制成。

上述拮抗高糖所致细胞衰老药物的药物剂型包括口服型、外用型和注射型。

所述口服型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂；所述外用型包括栓剂、捈剂、洗剂、膏剂、透皮贴剂；所述注射型包括注射液、混旋液、冻干粉。具体制备方法参照制药领域的常规方法制备，所用药用辅料根据剂型不同选择制药领域通用的辅料。

本发明所要解决的技术问题之三是提供上述酯型儿茶素吡咯烷生物碱的制备方法，包括以下步骤：

(1)原料粉碎

取大叶茶，对其粉碎处理，得到大叶茶粉末；

(2)浸提、萃取

用石油醚对大叶茶粉末进行浸提，过滤得到石油醚浸提滤渣，再用乙酸乙酯对石油醚浸提滤渣进行浸提，过滤得到乙酸乙酯浸提滤渣，再用甲醇对乙酸乙酯浸提滤渣进行浸提，过滤得到甲醇浸提滤液，甲醇浸提滤液经浓缩后溶于甲醇水溶液中，得到浸提产物甲醇水溶液，最后用二氯甲烷对浸提产物甲醇水溶液进行萃取，上层为甲醇部位水溶性成分，取甲醇部位水溶性成分，浓缩后得到甲醇部位水溶性成分膏状提取物；

(3)分离纯化

对甲醇部位水溶性成分膏状提取物进行分离纯化，得到所述酯型儿茶素吡咯烷生物碱。

进一步地，所述大叶茶选用古树茶昔归晒青毛茶或紫鹃绿茶晒青毛茶。这两种茶都在民间广为流传或经报道具有很好的健康功效，并且经质谱检测含有较多这一类的儿茶素衍生物。

进一步地，所述甲醇水溶液的体积浓度为10％。待分离的物质极性较大，采用这个浓度，提取效果更好。

进一步地，步骤(2)中，石油醚浸提滤渣和乙酸乙酯浸提滤渣在被浸提前均预先经过干燥处理。这样处理，能够防止在浸提时由于残留溶剂而出现乳化。

进一步地，分离纯化处理包括将甲醇部位水溶性成分膏状提取物溶解后依次经过mci柱层析、toyopearl柱层析、sephadexlh-20凝胶柱层析和高效液相色谱柱洗脱。

进一步地，所述大叶茶选用古树茶昔归晒青毛茶，分离纯化的具体过程为：将甲醇部位水溶性成分膏状提取物用<10％的甲醇水溶液溶解后过mci柱，mci柱使用meoh-h2o体积比0:100到100:0作为梯度洗脱，收集50％甲醇水洗脱得到的组分过toyopearl柱，toyopearl柱使用meoh-h2o体积比0:100到100:0作为梯度洗脱，收集40％甲醇水洗脱得到的组分过sephadexlh-20凝胶柱，sephadexlh-20凝胶柱使用meoh-h2o体积比0:100到100:0作为梯度洗脱，收集50％甲醇水洗脱得到的组分用高效液相半制备分离，分离色谱柱为prepc18(10×250mmi.d.,5μm,waters,ireland)柱，流速2毫升/分钟，洗脱剂为乙腈水，洗脱条件为35分钟：19％乙腈水等度洗脱，28.761分钟洗脱液经浓缩干燥后得到式ⅰ所示的酯型儿茶素吡咯烷生物碱，30.668分钟洗脱液经浓缩干燥后得到式ⅱ所示的酯型儿茶素吡咯烷生物碱，26.469分钟洗脱液经浓缩干燥后得到式ⅲ和式ⅳ所示的酯型儿茶素吡咯烷生物碱，33.874分钟洗脱液经浓缩干燥后得到式ⅴ和式ⅵ所示的酯型儿茶素吡咯烷生物碱。

进一步地，所述大叶茶选用紫鹃绿茶晒青毛茶，分离纯化的具体过程为：将甲醇部位水溶性成分膏状提取物用<10％的甲醇水溶液溶解后过mci柱，mci柱使用meoh-h2o体积比0:100到100:0作为梯度洗脱，收集50％甲醇水洗脱得到的组分过toyopearl柱，toyopearl柱使用meoh-h2o体积比0:100到100:0作为梯度洗脱，收集50％甲醇水洗脱得到的组分过sephadexlh-20凝胶柱，sephadexlh-20凝胶柱使用meoh-h2o体积比0:100到100:0作为梯度洗脱，收集50％甲醇水洗脱得到的组分用高效液相半制备分离，分离色谱柱为prepc18(10×250mmi.d.,5μm,waters,ireland)柱，流速2毫升/分钟，洗脱剂为乙腈水，洗脱条件为35分钟：19％乙腈水等度洗脱，28.766分钟洗脱液经浓缩干燥后得到式ⅰ所示的酯型儿茶素吡咯烷生物碱，30.672分钟洗脱液经浓缩干燥后得到式ⅱ所示的酯型儿茶素吡咯烷生物碱，26.471分钟洗脱液经浓缩干燥后得到式ⅲ和式ⅳ所示的酯型儿茶素吡咯烷生物碱，33.877分钟洗脱液经浓缩干燥后得到式ⅴ和式ⅵ所示的酯型儿茶素吡咯烷生物碱。

本发明所要解决的技术问题之四是提供上述酯型儿茶素吡咯烷生物碱的检测方法，利用uplc-ms检测方法，流速0.18毫升/分钟；流动相：a相0.1％甲酸水，b相含0.1％甲酸的乙腈；洗脱条件：0-1.5分钟，6％乙腈水；1.5-4分钟，6％乙腈水-12％乙腈水；4-8分钟，12％乙腈水-25％乙腈水；8-10分钟，25％乙腈水-35％乙腈水；10-14分钟，35％乙腈水-45％乙腈水；14-18分钟，45％乙腈水-55％乙腈水；18-20分钟，55％乙腈水-90％乙腈水；20-22分钟，90乙腈水；22-23分钟，90％乙腈水-6％乙腈水；23-25分钟，6％乙腈水；

式ⅰ所示的酯型儿茶素吡咯烷生物碱的去质子化离子分子量为552.1551，保留时间为12.49分钟；式ⅱ所示的酯型儿茶素吡咯烷生物碱的去质子化离子分子量为552.1551，保留时间为12.54分钟；式ⅲ和式ⅳ所示的酯型儿茶素吡咯烷生物碱的去质子化离子分子量为552.1551，保留时间为12.35分钟；式ⅴ和式ⅵ所示的酯型儿茶素吡咯烷生物碱的去质子化离子分子量为552.1551，保留时间为13.12分钟。

本发明的有益效果体现在：

1.本发明提供的具有生物活性的酯型儿茶素吡咯烷生物碱对高糖所致人脐静脉内皮细胞(huvecs)衰老有拮抗作用，可以用于制备抗衰老药物，对农业和医疗健康具有重要意义，为保护大叶茶资源尤其是云南古树茶昔归及紫鹃绿茶，并最大程度开发利用大叶茶尤其是云南古树茶昔归和紫鹃绿茶提供了更为广阔的应用前景。

2.本发明酯型儿茶素吡咯烷生物碱的制备流程简单，容易实施，性价比高。

3.本发明酯型儿茶素吡咯烷生物碱的制备产率高，可以推广大规模工厂化制备。

4.本发明酯型儿茶素吡咯烷生物碱的检测方法准确、简单、高效，适用于寻找含有本发明酯型儿茶素吡咯烷生物碱的生物资源，增加本发明酯型儿茶素吡咯烷生物碱获取路径，提高其利用度。

附图说明

图1是酯型儿茶素吡咯烷生物碱对高糖所致人脐静脉内皮细胞(huvecs)衰老的拮抗作用图。

图2(a)云南古树茶昔归的总离子流图及etc-pyrrolidinonee，f，g，h，i和j提取eic；(b)昔归素的碎片离子峰；(c)etc-pyrrolidinone碎片离子峰的推断裂解途径。

图3(a)etc-pyrrolidinonee，f的实测cd；(b)etc-pyrrolidinonee，f的5″′位置构型示意图；(c)etc-pyrrolidinoneg、h、i、j、cg、ecg的实测cd谱；(d)etc-pyrrolidinoneg和i的5″′位置构型示意图。

图4(a)etc-pyrrolidinonee、f、g、h、i、j的hplc制备；(b)etc-pyrrolidinone在278nm下的紫外检测图。

图5酯型儿茶素吡咯烷生物碱对高糖所致人脐静脉内皮细胞(huvecs)衰老的拮抗作用的电镜图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

本部分对本发明实验中所使用到的材料以及实验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料、设备和操作方法是本领域公知的。

本发明首次从大叶茶中提取出酯型儿茶素吡咯烷生物碱，其由式ⅰ或式ⅱ或式ⅲ或式ⅳ或式ⅴ或式ⅵ所示结构表示：

式ⅰ，ⅱ，ⅲ，ⅳ，ⅴ和ⅵ所示酯型儿茶素吡咯烷生物碱按顺序依次是：

(-)-6-(5″′s)-n-ethyl-2-pyrrolidinone-epicatechin-3-o-gallate；

(-)-6-(5″′r)-n-ethyl-2-pyrrolidinone-epicatechin-3-o-gallate；

(-)-8-(5″′s)-n-ethyl-2-pyrrolidinone-epicatechin-3-o-gallate；

(-)-8-(5″′r)-n-ethyl-2-pyrrolidinone-epicatechin-3-o-gallate；

(-)-8-(5″′s)-n-ethyl-2-pyrrolidinone-catechin-3-o-gallate；

(-)-8-(5″′r)-n-ethyl-2-pyrrolidinone-catechin-3-o-gallate；

分别命名为etc-pyrrolidinonee，f，g，h，i和j。

下面介绍两种分别以云南古树茶昔归和紫鹃绿茶为原料制备酯型儿茶素吡咯烷生物碱的实施例。

实施例1

古树茶昔归晒青毛茶中酯型儿茶素吡咯烷生物碱的制备

(1)取5.0公斤干燥的古树茶昔归晒青毛茶，对其粉碎处理，得到古树茶昔归晒青毛茶粉末；

(2)用20l石油醚对古树茶昔归晒青毛茶粉末进行浸提，浸提先在常温下浸提48小时，然后在70hz下超声浸提3小时，之后通过过滤得到滤液；按上述步骤浸提3次，合并滤液并减压浓缩得到古树茶昔归晒青毛茶石油醚部位，并对剩下的石油醚浸提滤渣进行干燥处理待下一步浸提；

然后再用20l乙酸乙酯对上述剩下的干燥后的石油醚浸提滤渣进行浸提，浸提先在常温浸提48小时，然后在70hz下超声浸提3小时，之后通过过滤得到滤液；按上述步骤浸提3次，合并滤液并减压浓缩得到古树茶昔归晒青毛茶乙酸乙酯部位，并对剩下的乙酸乙酯浸提滤渣进行干燥处理待下一步浸提。

之后用20l甲醇对上述剩下的干燥后的乙酸乙酯浸提滤渣进行浸提，浸提先在常温浸提48小时，然后在70hz下超声浸提3小时，之后通过过滤得到滤液；按上述步骤浸提3次，合并滤液并减压浓缩得到古树茶昔归晒青毛茶甲醇部位膏体；

随后将上述古树茶昔归晒青毛茶甲醇部位膏体溶于体积浓度为10％的甲醇水至体积3l；

最后用9l二氯甲烷对上述用10％甲醇水溶解的古树茶昔归晒青毛茶甲醇部位膏体进行常温萃取，震荡摇匀静置后，上层为古树茶昔归晒青毛茶甲醇部位水溶性成分，按上述步骤萃取5次，合并上层古树茶昔归晒青毛茶甲醇部位水溶性成分，并减压浓缩得到甲醇部位水溶性成分膏状提取物800g，并保留这一目标提取物。

(3)取500g上述甲醇部位水溶性成分膏状提取物用<10％的甲醇水溶液溶解后过mci柱，mci柱使用meoh-h2o体积比0:100到100:0作为梯度洗脱，收集合并得到21个组分，然后将其中50％甲醇水洗脱得到的第7个组分过toyopearl柱，toyopearl柱使用meoh-h2o体积比0:100到100:0作为梯度洗脱，收集得到25个组分，然后将其中40％甲醇水洗脱得到的第13个组分过sephadexlh-20凝胶柱，sephadexlh-20凝胶柱使用meoh-h2o体积比0:100到100:0作为梯度洗脱，其中将其中50％甲醇水洗脱得到的第6组分用高效液相半制备分离，分离色谱柱为prepc18(10×250mmi.d.,5μm,waters,ireland)柱，流速2毫升/分钟，洗脱剂为乙腈水，洗脱条件为35分钟：19％乙腈水等度洗脱。依次得到etc-pyrrolidinonee(28.761分钟，质量85mg)，etc-pyrrolidinonef(30.668分钟，质量80mg)，etc-pyrrolidinoneg和etc-pyrrolidinoneh(26.469分钟，质量105mg)，etc-pyrrolidinonei和etc-pyrrolidinonej(33.874分钟，质量116mg)。

实施例2

紫鹃绿茶晒青毛茶中酯型儿茶素吡咯烷生物碱的制备

(1)取8.0公斤干燥的紫鹃绿茶晒青毛茶，对其粉碎处理，得到紫鹃绿茶晒青毛茶粉末；

(2)用30l石油醚对紫鹃绿茶晒青毛茶粉末进行浸提，浸提先在常温浸提48小时，然后在70hz下超声浸提3小时，之后通过过滤得到滤液；按上述步骤浸提3次，合并滤液并减压浓缩得到紫鹃绿茶晒青毛茶石油醚部位，并对剩下的石油醚浸提滤渣进行干燥处理待下一步浸提；

然后再用30l乙酸乙酯对上述剩下的干燥后的石油醚浸提滤渣进行浸提，浸提先在常温浸提48小时，然后在70hz下超声浸提3小时，之后通过过滤得到滤液；按上述步骤浸提3次，合并滤液并减压浓缩得到紫鹃绿茶晒青毛茶乙酸乙酯部位，并对剩下的乙酸乙酯浸提滤渣进行干燥处理待下一步浸提；

之后用30l甲醇对上述剩下的干燥后的乙酸乙酯浸提滤渣进行浸提，提先在常温浸提48小时，然后在70hz下超声浸提3小时，之后通过过滤得到滤液；按上述步骤浸提3次，合并滤液并减压浓缩得到紫鹃绿茶晒青毛茶甲醇部位膏体；

随后将上述紫鹃晒青绿茶甲醇部位膏体溶于10％甲醇水至体积近4l；

最后用12l二氯甲烷对上述用10％甲醇水溶解的紫鹃绿茶晒青毛茶甲醇部位膏体进行常温萃取，震荡摇匀静置后，上层为紫鹃绿茶晒青毛茶甲醇部位水溶性成分，按上述步骤萃取5次，合并上层紫鹃绿茶晒青毛茶甲醇部位水溶性成分，并减压浓缩得到甲醇部位水溶性成分膏状提取物1200g，并保留这一目标提取物。

(3)取1000g上述甲醇部位水溶性成分膏状提取物用<10％的甲醇水溶液溶解后过mci柱，mci柱使用meoh-h2o体积比0:100到100:0作为梯度洗脱，收集合并得到18个组分。然后将其中50％甲醇水洗脱得到的第6个组分过toyopearl柱，toyopearl柱使用meoh-h2o体积比0:100到100:0作为梯度洗脱，收集得到30个组分，然后将其中50％甲醇水洗脱得到的第15个组分过sephadexlh-20凝胶柱，sephadexlh-20凝胶柱使用meoh-h2o体积比0:100到100:0作为梯度洗脱，其中将其中50％甲醇水洗脱得到的第8组分用高效液相半制备分离，分离色谱柱为prepc18(10×250mmi.d.,5μm,waters,ireland)柱，流速2毫升/分钟，洗脱剂为乙腈水，洗脱条件为35分钟：19％乙腈水等度洗脱。依次得到etc-pyrrolidinonee(28.766分钟，质量41mg)，etc-pyrrolidinonef(30.672分钟，质量35mg)，etc-pyrrolidinoneg和etc-pyrrolidinoneh(26.471分钟，质量52mg)，etc-pyrrolidinonei和etc-pyrrolidinonej(33.877分钟，质量58mg)。

实施例3

酯型儿茶素吡咯烷生物碱的性状验证

etc-pyrrolidinonee的特性如下：

1)、可溶于甲醇和dmso，白色无定型粉末；

2)、nm：207，278；

3)、ir(kbr)νmax(cm^-1)：3397，1694，1620，1529；

4)、hr-esi-ms(负离子模式)：m/z＝552.1551([m-h]^-，c28h26no11^-理论计算值为552.1506)；

5)、核磁共振光谱数据见表1。

etc-pyrrolidinonef的特性如下：

1)、可溶于甲醇和dmso，白色无定型粉末；

2)、nm：207，278；

3)、ir(kbr)νmax(cm^-1)：3405，1691，1620，1517；

4)、hr-esi-ms(负离子模式)：m/z＝552.1551([m-h]^-，c28h26no11^-理论计算值为552.1506)；

5)、核磁共振光谱数据见表1。

etc-pyrrolidinoneg，h的特性如下：

1)、可溶于甲醇和dmso，白色无定型粉末；

2)、nm：207，278；

3)、ir(kbr)νmax(cm^-1)：3378，1702，1609，1529；

4)、hr-esi-ms(负离子模式)：m/z＝552.1551([m-h]^-，c28h26no11^-理论计算值为552.1506)；

5)、核磁共振光谱数据见表2。

etc-pyrrolidinonei，j的特性如下：

1)、可溶于甲醇和dmso，白色无定型粉末；

2)、nm：207，278；

3)、ir(kbr)νmax(cm^-1)：3454，1715，1609，1528；

4)、hr-esi-ms(负离子模式)：m/z＝552.1551([m-h]^-，c28h26no11^-理论计算值为552.1506)；

5)、核磁共振光谱数据见表2。

表1etc-pyrrolidinonee，f的核磁共振光谱数据

表2etc-pyrrolidinoneg，h，i，j的核磁共振光谱数据

注：¹hnmr在600mhz，¹³cnmr在150mhz条件下测试，δ单位为ppm，耦合常数j单位为hz，溶剂为氘代二甲亚砜。

另外，请参见图2至图4，可以看出，所有新化合物均通过紫外光谱uv、红外光谱ir及¹hnmr、¹³cnmr、esi-hr-ms、¹h-¹hcosy，hsqc、hmbc和rosey等二维核磁共振谱归属，证明了所得化合物的结构。

实施例4

酯型儿茶素吡咯烷生物碱对高糖所致人脐静脉内皮细胞(huvecs)衰老的拮抗作用试验

生长良好的huvec细胞，无菌条件下移入细胞培养瓶中，加入10％fbs的dmem培养基置于通有5％co2培养箱中37℃静置培养。每1-2天换培养液1次，接种后3-5天，细胞呈单层密集生长，出现融合及岛状连接。待细胞生长至融合期时用0.25％胰蛋白酶消化传代，按1：4传代培养。

将酯型儿茶素吡咯烷生物碱在dmso中溶解，然后用培养基稀释至所需的浓度，dmso的最终浓度不超过0.1％。取对数生长期的huvec细胞，消化成单细胞悬液，10％fbs的dmem培养基重悬，接种于6孔板中。分为正常组，模型组以及各个化合物组，各个化合物浓度设置为10μm,正常组为huvecs的自然培养，模型组为huvecs与33mm葡萄糖共培养，药物组分别为各个化合物与huvecs及高糖共培养。共培养48h后，弃培养上清，每组按照β-半乳糖苷酶染色试剂盒说明书进行操作，最后通过倒置荧光显微镜观察细胞衰老情况，结果见图1和图5，图中1，2，3，4分别对应etc-pyrrolidinonee、f、g和h、i和j；metformin给药浓度300μm。

β-半乳糖苷酶定位在细胞质，阳性产物呈蓝色。细胞衰老模型组β-半乳糖苷酶阳性细胞率明显高于正常组(p＜0.05)，实验结果表明，etc-pyrrolidinonee、f、g和h、i和j对高糖所致细胞衰老有显著的保护作用(p＜0.05)。

现今，糖尿病已成为严重危害人类健康的全球流行性疾病，其血管并发症是患者致残、致死的主要原因。与非糖尿病人群相比,糖尿病人群中动脉粥样硬化性疾病的患病率高、发病年龄轻、病情进展较快、多脏器同时受累较多。研究指出，高血糖可以加速细胞的衰老，而内皮细胞衰老是动脉粥样硬化的早期病理改变，因此，发展有效阻断药物,保护高糖所致细胞衰老是防治糖尿病大血管病变的有效途径。

而本发明酯型儿茶素吡咯烷生物碱可应用于抗衰老药物及食物、护肤品添加剂的制备。具体说是将本发明酯型儿茶素吡咯烷生物碱按医学上可接受的剂量和药学上所通用的辅料制成一种抗衰老药物及按食品添加物使用限量制成食物、护肤品添加剂。该药物剂型包括口服型、外用型和注射型等。所述口服型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂等；所述外用型包括栓剂、捈剂、洗剂、膏剂、透皮贴剂等；所述注射型包括注射液、混旋液、冻干粉等。具体制备方法参照制药、食品领域的常规方法制备。

实施例5

酯型儿茶素吡咯烷生物碱的检测方法

检测仪器设备：安捷伦uplc6545系列q-tof液质谱联用仪(安捷伦科技中国有限公司)，acquitybehshieldrp18柱(2.1×150mm，1.7μm)。

茶样制备：将大叶种晒青毛茶尤其是古树茶昔归、紫鹃绿茶晒青毛茶用粉碎机粉碎，过0.45毫米筛子得粉末状茶样。称取茶样各0.5克，用70％甲醇水定容至20毫升，浸提12小时，期间超声两次，每次超声15分钟。浸提结束后将茶样浸提液过两次0.22微米滤膜后即得待分析样品液。

流速0.18毫升/分钟，流动相：a相0.1％甲酸水，b相含0.1％甲酸的乙腈，洗脱条件：0-1.5分钟，6％乙腈水；1.5-4分钟，6％乙腈水-12％乙腈水；4-8分钟，12％乙腈水-25％乙腈水；8-10分钟，25％乙腈水-35％乙腈水；10-14分钟，35％乙腈水-45％乙腈水；14-18分钟，45％乙腈水-55％乙腈水；18-20分钟，55％乙腈水-90％乙腈水；20-22分钟，90乙腈水；22-23分钟，90％乙腈水-6％乙腈水；23-25分钟，6％乙腈水。

实验结果：如图2所示可以在大叶种茶中检测到上述黄烷醇类生物碱etc-pyrrolidinonee去质子化离子分子量552.1551，保留时间为12.49分钟；etc-pyrrolidinonef去质子化离子分子量为552.1551，保留时间为12.54分钟；etc-pyrrolidinoneg，h去质子化离子分子量为552.1551，保留时间为12.35分钟；etc-pyrrolidinonei，j去质子化离子分子量为552.1551，保留时间为13.12分钟。

应当理解本文所述的例子和实施方式仅为了说明，并不用于限制本发明，本领域技术人员可根据它做出各种修改或变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。