本发明涉及遗传育种领域，具体地说，涉及一种加速物种突变的新育种方法。
背景技术
育种技术能提高产品的产量、品质，提高劳动生产率。现代育种大致分为近缘杂交、远缘杂交、回交育种、诱变育种、细胞工程和转基因育种。其中杂交育种利用基因型不同的亲本材料通过有性杂交获得杂种，并对杂种后代进行选择而获得杂种优势的育种方法，是国内外目前广泛应用且卓有成效的一种育种途径。转基因育种是利用现代基因工程技术将某些与高产、优质和抗逆性状相关的基因导入受体物种中培育出具有特定优良性状的新品种技术。
诱变育种对作物的种子、组织、器官进行诱变处理，以诱发基因突变和遗传变异，从而获得新基因、新种质，选育新品种。诱变育种是诱发作物基因组中基因发生突变，从中挑选出突变体，经过选拔、鉴定育成优良品种。诱变育种是较好简便的育种手段，包括遗传变异的发生、有益基因型的选择和比较试验三个重要环节。诱变所产生的变异同物种在自然界进化过程中自发突变所产生的变异没有本质上的差异，只不过自然界植物发生的自发突变频率很低，而各种诱变能产生更高频率的突变体。
常用的诱变育种包括辐射诱变、化学诱变、空间诱变。诱变育种需要用到各种电磁、粒子辐射和化学诱变剂，他们大都对人体有致癌性，因此需要专业的诱变装置、设备和受到良好培训的育种人员小心谨慎的操作。空间诱变需要用到返回式卫星等空间器件，成本特别高。因为需要凭借各种设备、药剂、或者装置，每次诱变育种只能选择小部分种子、原生质体、营养体等材料来进行诱变育种。一般情况下，突变中的有益突变频率较低，变异的方向和性质难以控制。常规诱变育种的对象通常具备相当复杂和完备的dna修复机制，诱变引起的基因损伤和突变(尤其是点突变)容易在作物的选育过程中得到修复。因此，诱变育种中得到优良性状的几率小，育种效率并不高。
dna复制过程中原本有较高的突变率，dna本身也容易受到各种射线、外源和内源化学物、活性氧的攻击而发生改变。但是在长期的生物进化中，物种为了维持其基因稳定性，进化出了一套精巧的维持dna基因稳定性的分子机制，包括复制过程中对dna进行实时校对的错配修复、核苷酸切除修复、碱基切除修复、重组修复、活性氧平衡等。正是这套系统使细胞的自然突变中真正能永久保留下来的不到千分之一，实际突变率只有10-9左右。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种加速物种突变的新育种方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的加速物种突变的新育种方法，通过基因工程手段，对物种中负责dna复制和/或遗传稳定性的基因进行定点突变，使得该基因功能缺失或减弱，从而提高育种对象在生长和发育过程中的突变率(如突变率提高2-4个数量级)，并从中筛选出具备所需性状的突变体；再通过基因工程手段，将突变体中相应的负责dna复制和/或遗传稳定性，且发生功能缺失或减弱的基因进行定点突变，使得该基因的功能重新恢复，即获得具备所需性状的新品种。
所述方法包括以下步骤：
1，通过基因敲除或者基因编辑和修饰的技术手段，对维持dna序列不变和基因稳定性起作用的至少一个基因或者多个基因进行编辑或者敲除，一定程度上削弱育种对象的基因稳定性，从而得以显著提高育种对象在生长和培育过程中的突变率(如突变率提高2-4个数量级)；
2，培育并大量繁殖上述dna和基因稳定性显著削弱和缺陷的育种对象，产生大量的突变体，并从中挑选出具备特定性状的突变体；
3，再利用基因编辑手段把起先敲除或修饰过的维持基因稳定性和dna序列不变的原基因序列重新正确插入并更正，后续经鉴定育成基因稳定性重新得到恢复且已具备新性状的新品种。
本发明述及的育种技术，所述的育种对象包括各种微生物如农业微生物、工业微生物、环境微生物等，植物如各种农作物、花卉、蔬菜、果树、林木、牧草等，动物如提供肉类、鱼、奶制品的饲养经济类动物等。
基因编辑的育种对象包括但不限于如下：微生物细胞，植物的体细胞、愈伤组织、花药和原生质体，动物的胚胎干细胞；供筛选的突变体包括但不限于如下：单个微生物克隆，整株植物或植物的器官、组织、芽、胚、愈伤组织、花药和原生质体，动物个体等。
本发明述及的基因工程手段是指具备一定靶向能力的基因编辑技术，包括但不限于下述几种，如crispr/cas基因编辑技术、锌指核酸酶(zfn)基因编辑技术、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)基因编辑技术等。
本发明述及的负责dna复制和/或遗传稳定性的基因包括但不限于以下几类：涉及dna复制中起校对功能的基因；涉及dna修复的基因如错配修复基因、核苷酸切除修复基因、碱基切除修复基因；涉及细胞活性氧平衡的基因；涉及细胞周期的关卡基因。
本发明述及的删除或编辑涉及dna复制中起校对功能的基因，削弱或去除该基因对物种dna校对的分子和生物学功能，包括但不限于如下基因：原核生物dna聚合酶基因如poli、polii、poliii、poliv、polv；真核生物dna聚合酶基因如polα、polβ、polγ、polδ、polε、polσ、polζ、polλ、polμ、polι、polκ、polη。
本发明述及的删除或编辑涉及dna错配修复的基因，削弱或去除该基因的dna错配修复的分子和生物学功能失去或者削弱，包括但不限于如下基因：原核生物的muts及其同源基因、mutl及其同源基因、muth及其同源基因、增殖细胞核抗原β-滑动钳(pcnaβ-slidingclamp)基因；真核生物的msh(msh1-msh6)及其同源基因、mlh(mlh1-mlh3)及其同源基因、pms(pms1-pms2)及其同源基因。
本发明述及的删除或编辑涉及碱基切除修复(ber)的基因，削弱或去除该基因的碱基切除修复的分子和生物学功能失去或者削弱，包括但不限于如下基因：dna糖基化酶基因如uracil-dna糖基化酶基因家族、nth家族、fgp家族等；ap内切核酸酶基因如xth家族、nfo家族、palf家族；dna聚合酶基因如poli、polγ。
本发明述及的删除或编辑涉及核苷酸切除修复(ner)的基因，削弱或去除该基因的核苷酸切除修复的分子和生物学功能，包括但不限于如下基因：原核生物的uvra、uvrb、uvrc基因；真核生物的gc-ner和tc-ner基因，如csa、csb、rpa、rad、ercc、xpa-xpg等基因。
本发明述及的删除或编辑涉及活性氧(ros)平衡的基因，削弱该基因anti-ros的分子和生物学功能，包括但不限于如下基因：超氧化物歧化酶基因(sod)、过氧化氢酶基因、谷胱甘肽过氧化物酶基因。
本发明述及的删除或编辑涉及细胞周期的关卡基因，削弱或者去除该基因在细胞周期和分裂中所起的关卡作用，包括但不限于如下基因：atm丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因，atr丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因，p53基因。
本发明述及的对维持dna序列不变和基因稳定性起作用的至少一个基因或者多个基因进行基因编辑或者基因敲除，其目的是适当削弱育种对象的dna和基因稳定性，在不影响物种正常培育和繁殖的前提下，显著提高育种对象在生长、培育和繁殖过程中的突变率(如突变率提高2-4个数量级)，从而产生大量的突变体，并从中挑选出适合的突变体。
本发明述及的筛选出适合的突变体后，再次利用基因编辑手段把起先敲除或修饰过的维持dna序列不变和基因稳定性的原基因序列重新正确插入并更正，所采取的技术手段是指具备一定靶向能力的基因编辑技术，包括但不限于下述几种，如crispr/cas基因编辑技术、锌指核酸酶(zfn)基因编辑技术、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)基因编辑技术等。
本发明述及的对维持dna序列不变和基因稳定性起作用的至少一个基因或者多个基因进行基因编辑或者基因敲除，以及筛选出适合的突变体后，再次利用基因编辑手段把起先敲除或修饰过的维持dna序列不变和基因稳定性的原基因序列重新正确插入并更正，其基因编辑的育种对象包括但不限于如下：微生物细胞，植物的体细胞、愈伤组织、花药和原生质体，动物的胚胎干细胞。供筛选的突变体包括但不限于如下：单个微生物克隆，整株植物或植物的器官、组织、芽、胚、愈伤组织、花药和原生质体，动物个体等。
本发明述及的对维持dna序列不变和基因稳定性起作用的至少一个基因或者多个基因进行基因编辑或者基因敲除以后，为了进一步提高育种对象在生长、培育和繁殖过程中的突变率并产生大量的突变体，在对育种对象进行大量培育和繁殖过程中可以辅以低剂量的诱变措施。辅助的辐射诱变措施可包括电磁辐射和粒子辐射，如x射线、γ射线、中子、离子束、同步辐射、紫外线、激光、质子等。辅助的化学诱变措施是指利用各种化学物质诱导生物体遗传特性发生变异的方法，可包括烷化剂如硫芥、氮芥、环氧衍生物、乙烯亚胺、硫酸酯，碱基类似物如5-溴-尿嘧啶，叠氮化物如叠氮化钠，以及其他种类的化学诱变剂如秋水仙素等。
与现有育种技术相比，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)突变体的产生是基于育种对象在基因稳定性被削弱，后续的突变体可以在育种对象生长、培育和繁殖过程中大量产生。
(二)本发明可以不依赖诱变育种中需要用到的各种电磁、粒子辐射和化学诱变剂，不需要专业的诱变装置、设备和诱变操作的专业人员。本发明中维持dna序列不变和基因稳定的至少一个基因或者多个基因被编辑或者被敲除后，育种对象的dna序列和基因稳定性被显著削弱。即便在培养育种对象时辅以诱变措施，其采取的辐射强度和诱变剂浓度显著低于(强度和浓度可低至几个数量级)常规诱变育种技术中需要用到的辐射强度和诱变剂浓度。
(三)育种对象的基因稳定性虽然在一定程度上被削弱，大量突变体可在后续生长、培育和繁殖过程中自然产生。对于整个植株突变体的筛选而言，育种过程可以与该物种的正常培育(或种植)以获得生产经济效益同时进行。这不同于杂交育种技术，其育种过程和生产种植完全分离。常规诱变育种需要各种设备、药剂、或者装置，每次诱变育种只能选择小部分种子、原生质体、营养体等材料来进行诱变育种，得到优良品性的几率很低。本发明提供的育种技术可以做到育种过程与生产种植过程同时进行，因此可供筛选的基数极大，得到优良品种的几率显著提高。
(四)本发明提供的育种技术除了在前后两次基因编辑中需要专业人员以外，在突变株的筛选环节可以不需要专业育种技术人员的参与，可由普通的生产种植人员完成，为此可以大大降低获得优良品种的育种成本。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例下中所用的材料，试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
载体pml104，prgeb31可购自addgene公司。
pml104质粒已在文献“laugherymf,huntert,browna,hoopesj,ostbyetshumakert,wyrickjj.2015,newvectorsforsimpleandstreamlinedcrispr-cas9genomeeditinginsaccharomycescerevisiae.yeast,32(12):711-20”公开。
prgeb31质粒已在文献“xiek，yangy.2013,rna-guidedgenomeeditinginplantsusingcrisper-cassystem.molplant,6(6),1975-1983”公开。
使用基于geminivirus的crisper-cas9系统进行同源重组修复已在文献“wangm,luy,botellajr,maoy,huak,zhuj-k.2017,genetargetingbyhomology-directedrepairinriceusingagerminivirus-basedcrisper/cas9system.molplant,10,1007-1010”公开。
ms培养基成分已在文献“murashiget,skoogf.1962,arevisedmediumforrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissuecultures.physiolplant,15,473-497”中公开。
植物原生质体转化的方法已在文献“xiek,yangy.2013,rna-guidedgenomeeditinginplantsusingacrisper-cassystem.molplant,6,1975-1983”中公开。
实施例1以错配修复基因(mlh1)为靶的酵母突变体获得方法
1、敲除酵母(saccharomycescerevisiae，r64-1-1)错配修复基因(mlh1)的过程和方法
物种名：saccharomycescerevisiaer64-1-1(http://www.e-crisp.org/e-crisp/)
敲除基因名：mlh1
酵母mlh1基因dna全长序列见seqidno:1。
(1)根据crispr-cas9中靶标序列设计原则，该基因1320-1339位具有符合原则的靶标序列(mlh1sgrna)：ccactcccaagaggcagaaaagc
以上靶标序列的反向互补链含有5’-(n)x-ngg-3’结构。其中，下划线部分为5’-(n)x-ngg-3’结构中的ngg的互补链序列。
(2)合成带粘性末端的靶标序列的寡核苷酸链：
该靶标序列包括合成正向寡核苷酸链mlh1sg-f和与之互补的反向寡核苷酸链mlh1sg-r,具体序列为：
mlh1sg-f：5’gatcctcccaagaggcagaaaagcgttttagagctag3’
mlh1sg-r：5’ctagctctaaaacgcttttctgcctcttgggag3’
其中未标记的为该基因的靶标序列，下划线标记的为与质粒上酶切后互补的bcli粘性末端，灰色标记的是sgrna结构片段的5'端(末端为swai的平末端)，导入前用bcli进行酶切和回收。
(3)质粒的酶切连接：在25℃下用swai(平末端)消化质粒过夜，然后在65℃下热灭活20min。随后将bcli加入到消化反应中并在50℃温育至少两小时。酶切后切胶回收质粒。含有20mer指导序列和sgrna的5'末端的杂交寡核苷酸底物随后通常在16℃下过夜连接到切割的sgrna表达质粒中过夜。将杂交的核苷酸插入物以40-100倍摩尔比加入切割的载体中。将连接反应转化到感受态大肠杆菌中，测序鉴定。
(4)感受态酵母与约50-250ng质粒一起温育，另加入12.5-25μg鲑鱼精子dna作为单链载体dna以提高转化效率。将转化反应物在大约45℃温育30分钟并直接涂布在合成完全(sc)尿嘧啶脱失培养基(sc-ura)上，平板于30℃孵育4天。
2、酵母(saccharomycescerevisiae)突变体的筛选(以某一特性为筛选原则)
维持dna序列不变和基因稳定性起作用的至少一个基因(如实施例1中错配修复基因mlh1)或者多个基因经crispr技术敲除后，酵母的基因稳定性显著降低。在10％的普通麦芽汁培养基和30℃正常培养环境下或者在显著低于常规诱变育种技术中辐射强度和诱变剂浓度下(强度和浓度可低至几个数量级)，增菌培育和大量繁殖上述dna稳定机制显著缺陷的酵母菌，产生大量的突变体。选择合适的筛选培养基，经富集、初筛、复筛等常规筛选程序，挑选并培育出具备某一优良性状的突变体(如高产酒精)。
3、以酵母(saccharomycescerevisiae)错配修复基因(mlh1)为例的原位修复(1)合成含上游sacii下游eagi酶切位点及上下游500bp的回补基因(mlh1)。为了防止其被crisper-cas9系统酶切，引入同义突变消除pam位点(1817c→t；1802g→a)。具体序列见seqidno:2。
(2)将mlh1回补基因在37℃酶切2h的条件下进行sacii和eagi的双酶切，将pml104质粒同时于37℃进行sacii和eagi双酶切4h，最后利用t4连接酶对两个双酶切回收后的pcr产物和质粒于16℃连接14-16h。得到重组的pml104质粒。
(3)合成带粘性末端的靶标序列的寡核苷酸链：
1281-1303位点符合原则的靶标序列的sgrna序列为：ccttgggttcactcagttgtcgc
根据该靶标序列合成正向寡核苷酸链mlh1sg2-f和与之互补的反向寡核苷酸链mlh1sg2-r，具体序列为：
mlh1sg2-f：5’gatctgggttcactcagttgtcgcgttttagagctag3’
mlh1sg2-r：5’ctagctctaaaacgcgacaactgagtgaaccca3’
其中未标记的为该基因的靶标序列，下划线标记的为与质粒上酶切后互补的bcli粘性末端，灰色标记的是sgrna结构片段的5'端。
(4)质粒的酶切连接：在25℃下用swai(平末端)消化已经连有mlh1基因的pml104质粒过夜，然后在65℃下热灭活20min。随后将bcli加入到消化反应中并在50℃温育至少两小时。酶切后切胶回收回补重组的质粒。含有20mer指导序列和sgrna的5'末端的杂交寡核苷酸底物随后通常在16℃下过夜连接到切割的sgrna表达质粒中过夜。将杂交的核苷酸插入物以40-100倍摩尔比加入切割的载体中。将连接反应转化到感受态大肠杆菌中，测序鉴定。
(5)感受态酵母与约50-250ng质粒一起温育，另加入12.5-25μg鲑鱼精子dna作为单链载体dna以提高转化效率。将转化反应物在大约45℃温育30分钟并直接涂布在合成完全(sc)尿嘧啶脱失培养基(sc-ura)上，平板于30℃孵育4天。
结果可获得回补了基因mlh1，且具有所需性状的转化株。
实施例2以错配修复基因(mlh1)为靶的水稻突变体获得方法
1、敲除水稻(oryzasativairgsp-1.0.31)错配修复基因(mlh1)的过程和方法
物种名：oryzasativairgsp-1.0.31(http://www.e-crisp.org/e-crisp/)
敲除基因dna序列见seqidno:3。
(1)在第九个外显子上设计出靶标sgrna序列：(mlh1sgrna)：
ccaaatggtcagaacagatccac
以上靶标序列的反向互补链含有5’-(n)x-ngg-3’结构。其中，下划线部分为5’-(n)x-ngg-3’结构中的ngg的互补链序列。
(2)合成带粘性末端的靶标序列的寡核苷酸链：
该靶标序列包括合成正向寡核苷酸链mlh1sg-f和与之互补的反向寡核苷酸链mlh1sg-r，具体序列为：
mlh1sg-f：5’gttttaatggtcagaacagatccac3’
mlh1sg-r：5’gtggatctgttctgaccattaaag3’
其中未标记的为该基因的靶标序列，下划线标记的为与质粒上酶切后互补的bsai粘性末端。
(3)质粒prgeb31通过用bsai内切酶在37℃4h的情况下进行酶切。酶切后切胶回收质粒。含有20mer指导序列和sgrna的5'末端的杂交寡核苷酸底物随后通常在16℃下过夜连接到切割的sgrna表达质粒中过夜。将杂交的核苷酸插入物以40-100倍摩尔比加入切割的载体中。将连接反应转化到感受态大肠杆菌中，测序鉴定。
(4)水稻原生质体的制备和转化：水稻种子在ms培养基中发芽后，从水稻的10日龄幼苗中制备稻原生质体。将原生质体在消化溶液(10mm的mesph值5.7，0.5m甘露醇，1mm的氯化钙，5mm的β-巯基乙醇，0.1％bsa，1.5％纤维素酶r10，和0.75％macerozumer10)消化5小时。在通过尼龙网(35μm)过滤后，收集原生质体并在w5溶液(2mmmes，ph5.7,154mmnacl，5mmkcl，125mmcacl2)在室温(25℃)下保持1小时。然后以300g离心5分钟除去w5溶液，并将稻原生质体重悬于mmg溶液(4mmmes，0.6m甘露醇，15mmmgcl2)中至终浓度为1.0×107ml-1。转化时，将10μl质粒(5-10μg)与100μl原生质体和110μlpeg-cacl2溶液(0.6m甘露醇，100mmcacl2，和40％peg4000)混合，然后在室温下孵育20分钟。加入2倍体积的w5溶液终止转化。然后通过离心收集转化的原生质体并重悬于wi溶液(4mmmes，ph5.7,0.6m甘露醇，4mmkcl)中。将转化的原生质体接种在24孔培养板中。在wi溶液温育24-72h后，收集原生质体进行鉴定。
(5)原生质体转化鉴定：通过加入100μl预热的ctab缓冲液从水稻原生质体中提取基因组dna，并在65℃温育20分钟。然后加入40μl氯仿，并将所得混合物在室温(25℃)下混合温育20分钟。在16000g离心5分钟，将上清液转移到新管中，并用250μl乙醇混合。在冰上10分钟温育后，基因组dna通过在室温下16000g离心10分钟而沉淀。将dna沉淀用0.5ml70％乙醇洗涤并风干。然后将基因组dna溶于100μlh2o中，通过分光光度计测定其浓度。
利用引物(f:ataagcatgtctctcagaataaaagca和r:ttaaagttaacacctctcaaaaacttt)对基因组进行pcr得到的产物进行测序筛选。
2、水稻(oryzasativa)突变株的筛选(以某一特性为筛选原则)
维持dna序列不变和基因稳定性起作用的至少一个基因(如本实施例中错配修复基因mlh1)或者多个基因经crispr技术敲除后，水稻的基因稳定性显著降低。按照常规的水稻种植方式，大田中培育上述dna稳定机制显著缺陷的水稻，产生大量的水稻突变体种子。多次大面积种植选种，筛选性状突出的单株(比如早熟、晚熟、高杆、低杆、抗病性等)。筛选出的具备突出性状的种子再根据所需性状进行分类进行小区种植并收获一定量种子。用上述成熟水稻种子在诱导培养基上诱导愈伤组织，再次利用crispr技术原位修复和回补mlh1基因或者其他敲除过的基因。mlh1基因的原位修复方法参照下述方法进行。
3、以水稻(oryzasativa)错配修复基因(mlh1)为例的原位修复
原位修复利用基于geminivirus的crisper-cas9系统进行同源重组来实现。
(1)设计并合成wdv载体(参见wangm,luy,botellajr,maoy,huak,zhujk.genetargetingbyhomology-directedrepairinriceusingageminivirus-basedcrispr/cas9system.molplant.2017；10(7):1007-10)的t-dna区域。其包括wdv(wheatdwarfvirus)的lir(largeintergenicregion)和sir(shortintergenicregion)，以及用于同源重组修复的mlh1基因(seqidno:4)和选择性标记nptii(neomycinephosphotransferase)基因。mlh1与nptii之间包含自我剪切的肽段2a。该区域还包括cas9基因序列以及grna序列。wdv载体全长序列见seqidno:5，其结构为lir-mlh1-2a-nptii-grna-sir-rep/repa-lir-cas9promoter-cas9-cas9terminator。
(2)在第15个外显子上设计grna所针对的靶向序列为ccaacgtgagtggaccattcagc
(3)为了防止其被crisper-cas9系统酶切，引入同义突变消除pam位点(3966c→t；6068c→a)。具体序列见seqidno:4。
(4)水稻原生质体的制备和转化：水稻种子在ms培养基中发芽后，从水稻的10日龄幼苗中制备稻原生质体。将原生质体在消化溶液(10mm的mesph值5.7，0.5m甘露醇，1mm的氯化钙，5mm的β-巯基乙醇，0.1％bsa，1.5％纤维素酶r10，和0.75％macerozumer10)消化5小时。在通过尼龙网(35μm)过滤后，收集原生质体并在w5溶液(2mmmes，ph5.7,154mmnacl，5mmkcl，125mmcacl2)在室温(25℃)下保持1小时。然后通过300g离心5分钟除去w5溶液，并将稻原生质体重悬于mmg溶液(4mmmes，0.6m甘露醇，15mmmgcl2)中至终浓度为1.0×107ml-1。转化时，将10μlwdv质粒(5-10μg)与100μl原生质体和110μlpeg-cacl2溶液(0.6m甘露醇，100mmcacl2和40％peg4000)混合，然后在室温下孵育20分钟。加入2倍体积的w5溶液终止转化。然后通过离心收集转化的原生质体并重悬于wi溶液(4mmmes，ph5.7,0.6m甘露醇，4mmkcl)中。将转化的原生质体接种在24孔培养板中。在wi溶液温育24-72h后，收集原生质体进行鉴定。
(5)原生质体转化鉴定：通过加入100μl预热的ctab缓冲液从水稻原生质体中提取基因组dna，并在65℃温育20分钟。然后加入40μl氯仿，并将所得混合物在室温(25℃)下混合温育20分钟。在16000g离心5分钟，将上清液转移到新管中，并用250μl乙醇混合。在冰上10分钟温育后，基因组dna通过在室温下16000g离心10分钟而沉淀。将dna沉淀用0.5ml70％乙醇洗涤并风干。然后将基因组dna溶于100μlh2o中，通过分光光度计测定其浓度。
利用引物(f:ataagcatgtctctcagaataaaagca和r:ttaaagttaacacctctcaaaaacttt)对基因组进行pcr得到的产物进行测序筛选。
结果可获得回补了基因mlh1，且具有所需性状的转化株。
上述实施例中仅列举了通过crispr-cas9基因编辑系统对酵母(saccharomycescerevisiae，r64-1-1)和水稻(oryzasativairgsp-1.0.31)的错配修复基因(mlh1)进行敲除、突变体筛选、突变体错配修复基因(mlh1)原位修复而获得优良性状的基本方法和一般流程。上述实施例中所使用的实验方法和流程中如果没有特殊说明，均为该技术领域中等从业人员可以掌握的常规方法。基于同样的原理、一般方法和基本流程，为了在一定程度上降低育种对象的dna序列和基因稳定性，我们还可以对维持dna序列不变和基因稳定性起作用的其他基因进行基因编辑或者基因敲除，这些基因包括但不限于以下几类：涉及dna复制中起校对功能的基因；涉及dna修复的基因如其他错配修复基因、核苷酸切除修复基因、碱基切除修复基因；涉及细胞活性氧平衡的基因；涉及细胞周期的关卡基因。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>北京师范大学
<120>一种加速物种突变的新育种方法
<130>khp181113359.2
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>2310
<212>dna
<213>酵母(saccharomycescerevisiae)
<400>1
atgtctctcagaataaaagcacttgatgcatcagtggttaacaaaattgctgcaggtgag60
atcataatatcccccgtaaatgctctcaaagaaatgatggagaattccatcgatgcgaat120
gctacaatgattgatattctagtcaaggaaggaggaattaaggtacttcaaataacagat180
aacggatctggaattaataaagcagacctgccaatcttatgtgagcgattcacgacgtcc240
aaattacaaaaattcgaagatttgagtcagattcaaacgtatggattccgaggagaagct300
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