本发明属于生物化工技术领域，涉及利用米根霉两阶段发酵分别产富马酸和香草醛的方法。
背景技术
富马酸是一种二元羧酸，是许多微生物代谢中不可缺少的中间体。其具有多个官能团的化学结构使其易于转化为许多其他有用的化学物质。因此，美国能源部选择富马酸作为可能可以由丰富的可再生生物质生产的“十二”化学构建模块之一。目前，富马酸主要用作食品酸化剂和化学品生产造纸树脂原料，不饱和聚酯树脂，醇酸树脂，增塑剂和其他工业，包括润滑油和油田流体的产品，用于苯乙烯丁二烯橡胶的酯，油墨，清漆和羧化剂。它是通过正丁烯到马来酸酐和马来酸，然后通过异构化作用生成富马酸。
虽然石油基化工方法可以达到富马酸的高产，但是油价上涨和伴随的污染问题促使化学工业寻求环境友好，生物为基础使用可再生原料生产富马酸的生产工艺。历史上，富马酸已经通过真菌利用糖发酵生产，直到石油工业的兴起。首次发现了丝状真菌生产富马酸。随后开始了真菌发酵生产富马酸的研究，1910年辉瑞公司在美国的繁荣和商业成功地使用了米根霉。在20世纪40年代，年产富马酸4000吨。然后发酵过程，逐渐被更便宜的石油化工合成方法取代，最终被淘汰。
但是与化学合成法相比，通过发酵生物生产具有以下优点：(1)温和条件下的发酵过程是环境友好的，可以减少温室气体排放和有毒废物；(2)以可再生生物质和农业残留物为原料，可使该过程持续，更经济；(3)生物基产品是绿色的，可安全地用于食品和其他消费品。然而，传统的富马酸发酵工艺产品收率低，生产率低，生产成本高。而且，由于难以控制常规搅拌釜式发酵罐中丝状真菌细胞的形态和生长，因此真菌发酵过程难以扩大用于工业生产富马酸。为了从生物质中经济地生产富马酸，必须提高发酵过程的反应器体积生产率，产物收率和产物浓度。
香草醛是最重要和普遍使用的芳香族之一香料，或者作为食品和饮料中的调味剂使用(82％)，作为香水(5％)或药品中的香料(13％)。香草醛可以从天然来源例如豆荚，但在高成本和不足的金额的情况下不能满足全球需求。因此，香草醛主要是从愈创木酚和木质素合成生产的，成本较低，但是质量较差。根据欧盟理事会指令88/388/eec(ec，1988)和美国立法(fda，2012)的口味可以考虑如果它们是通过生物过程获得的，即酶促或微生物学获得的，则为天然的香草醛。目前“天然”的香草醛的生产主要来自阿魏酸等物质的生物技术过程，但是产量很低，价格昂贵。因此想要获得高品质天然的香草醛，还需要探寻更加经济的工艺途径。
技术实现要素：
本发明所要解决的一个技术问题是提供一种富马酸与香草醛联产发酵的方法，在第一阶段米根霉利用葡萄糖发酵产富马酸，在第二阶段中利用米根霉的废菌体发酵产香草醛的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种富马酸与香草醛联产发酵的方法，包括如下步骤：
(1)利用米根霉发酵生产富马酸；
(2)步骤(1)发酵结束后，通过过滤或离心回收米根霉菌体；
(3)利用步骤(2)得到的米根霉，加入糖的水溶液中，所述的糖为葡萄糖和/或木糖，额外添加可溶性木质素单体阿魏酸，再次发酵生产香草醛。
步骤(1)中，所述的米根霉优选米根霉cicc40351。
步骤(1)中，利用米根霉发酵生产富马酸，所使用的发酵培养基为本领域常规发酵培养基，本领域技术人员可以根据现有技术简单优化得到最适的发酵培养基。优选的培养基配方是：葡萄糖38g/l、(nh4)2so40.71g/l、mgso4·7h2o0.5g/l、kh2po40.6g/l、znso4·7h2o0.01g/l、feso4·7h2o0.004g/l、ph4.8柠檬酸缓冲液5％v/v、caco330g/l。
步骤(1)中，本领域技术人员可以根据现有技术简单优化得到最适的发酵温度，发酵温度优选为30-40℃，最优选35℃。
步骤(1)中，本领域技术人员可以根据现有技术简单优化得到最适的发酵时间，发酵时间优选为60-120h，最优选60h。
步骤(3)中，发酵生产香草醛，所述的糖的水溶液，糖的总浓度为10-60g/l，优选50g/l。
步骤(3)中，额外添加可溶性木质素单体阿魏酸，阿魏酸的添加量为0.5-20g/l(以待添加的反应体系总体积计算)，优选0.9～2g/l，最优选1g/l。
步骤(3)中，回收的米根霉再次发酵生产香草醛的发酵过程中额外添加阿魏酸，或者在香草醛发酵初始将阿魏酸添加到糖的水溶液中。优选在香草醛发酵初始将阿魏酸添加到糖的水溶液中。
步骤(3)中，优选的方式是将米根霉，加入糖的水溶液中。
步骤(3)中，发酵温度为30-40℃，优选35℃。
步骤(3)中，发酵时间48-120h，优选84h。
步骤(3)中，微生物发酵生产香草醛的过程中，微生物利用碳源时，发酵培养基中外源添加的可溶性木质素单体阿魏酸刺激了微生物菌体，打开了一条新的代谢途径，即糖到香草醛的转化。通过实验表明在无糖存在的情况下，并不能打开此代谢途径。并且碳源选用木糖时，产香草醛的量最高。
有益效果：本发明不仅使得米根霉利用纯糖发酵产富马酸，而且再次利用米根霉的废菌体发酵生产香草醛的过程中，外源添加了可溶性木质素单体阿魏酸，刺激了微生物菌体打开新的代谢途径，即糖到香草醛的转化，然而在只有糖和菌体存在的条件下，并没有检测到香草醛的存在。按照本发明的方法，可有效提高香草醛的产量以及增强米根霉产富马酸工艺路线的经济效益。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例所用的米根霉为cicc40351。
以下实施例所用的米根霉发酵产富马酸的种子培养基的配制：所述种子培养基组成：葡萄糖40g/l、(nh4)2so44.4g/l、mgso4·7h2o0.5g/l、kh2po40.6g/l、znso4·7h2o0.018g/l、feso4·7h2o0.0005g/l调ph为2.8后灭菌；
以下实施例所用的米根霉发酵产富马酸的培养基的配制，所述发酵培养基组成：葡萄糖38g/l、(nh4)2so40.71g/l、mgso4·7h2o0.5g/l、kh2po40.6g/l、znso4·7h2o0.01g/l、feso4·7h2o0.004g/l、ph＝4.8柠檬酸缓冲液5％(v/v)、caco330g/l后灭菌。
以下实施例所用的米根霉废菌体发酵产香草醛的培养基的配制，如无特殊说明，则所述发酵培养基组成：葡萄糖与木糖混合糖50g/l(其中葡萄糖40g/l，木糖10g/l)，后灭菌。
灭菌条件统一为121℃，15min
对照实施例1：
用米根霉发酵生产富马酸和香草醛，包括如下步骤：
(1)将-80℃冰箱保存的甘油菌米根霉cicc40351接种至固体培养基上进行培养，连续传代3次，得到米根霉cicc40351菌体，；
(2)将得到的菌体接入装有50ml的种子培养基的摇瓶中，接种量为5％v/v。在摇床上进行培养，培养条件为：转速200rpm，初始ph为2.8，温度为30℃，培养时间为24h；
(3)将步骤(2)得到的种子液接入装有50ml发酵培养基的挡板锥形瓶中，接种量为10％v/v，培养的条件为：转速130r/min，初始ph值为自然ph值，发酵温度为35℃，培养时间为60h，富马酸产量为18g/l。
(4)将步骤(3)发酵完的米根霉菌体回收，接入到只含有糖的发酵培养基中，全部接入，培养的条件为：转速130r/min，温度为35℃，培养时间为48h，香草醛的产量为0g/l。
实施例2：
同实施例1的方法，所不同的是，摇瓶发酵采用添加可溶性木质素单体阿魏酸的策略，培养时间为48h。步骤(4)培养基中添加可溶性木质素单体阿魏酸(0.5g/l)。结果：香草醛产量由0g/l上升为0.60g/l。
实施例3：
同实施例1的方法，所不同的是，摇瓶发酵采用外源添加可溶性木质素单体阿魏酸的策略，培养时间为48h。步骤(4)发酵培养基中添加阿魏酸(0.7g/l)。结果：香草醛的产量由0g/l提高到0.62g/l。
实施例4：
同实施例1的方法，所不同的是，摇瓶发酵采用外源添加可溶性木质素单体阿魏酸的策略，培养时间为48h。步骤(4)发酵培养基中添加阿魏酸(0.9g/l)。结果：香草醛的产量由0g/l提高到1.15g/l。
实施例5：
同实施例1的方法，所不同的是，摇瓶发酵采用外源添加可溶性木质素单体阿魏酸的策略，培养时间为48h。步骤(4)发酵培养基中添加阿魏酸(1g/l)。结果：香草醛的产量0g/l提高到2.12g/l。
实施例6：
同实施例1的方法，所不同的是，摇瓶发酵采用外源添加可溶性木质素单体阿魏酸的策略，培养时间为48h。步骤(4)发酵培养基中添加阿魏酸(1.5g/l)。结果：香草醛的产量由0g/l提高到1.28g/l。
实施例7：
同实施例1的方法，所不同的是，摇瓶发酵采用外源添加可溶性木质素单体阿魏酸的策略，培养时间为48h。步骤(4)发酵培养基中添加阿魏酸(2g/l)。结果：香草醛的产量由0g/l提高到0.99g/l。
实施例8：
同实施例1的方法，所不同的是，摇瓶发酵采用外源添加可溶性木质素单体阿魏酸的策略，培养时间为60h。步骤(4)发酵培养基中添加阿魏酸(1g/l)。结果：香草醛的产量由0g/l提高到2.11g/l。
实施例9：
同实施例1的方法，所不同的是，摇瓶发酵采用外源添加可溶性木质素单体阿魏酸的策略，培养时间为72h。步骤(4)发酵培养基中添加阿魏酸(1g/l)。结果：香草醛的产量由0g/l提高到2.45g/l。
实施例10：
同实施例1的方法，所不同的是，摇瓶发酵采用外源添加可溶性木质素单体阿魏酸的策略，培养时间为84h。步骤(4)发酵培养基中添加阿魏酸(1g/l)。结果：香草醛的产量由0g/l提高到3.01g/l。
实施例11：
同实施例1的方法，所不同的是，摇瓶发酵采用外源添加可溶性木质素单体阿魏酸的策略，培养时间为108h。步骤(4)发酵培养基中添加阿魏酸(1g/l)。结果：香草醛的产量由0g/l提高到1.81g/l。
实施例12：
同实施例1的方法，所不同的是，摇瓶发酵采用外源添加可溶性木质素单体阿魏酸的策略，培养时间为120h。步骤(4)发酵培养基中添加阿魏酸(1g/l)。结果：香草醛的产量0g/l提高到2.14g/l。
实施例13：
同实施例1的方法，所不同的是，摇瓶发酵采用外源添加可溶性木质素单体阿魏酸的策略，培养时间为84h，发酵培养基木糖浓度为10g/l，无葡萄糖。步骤(4)发酵培养基中添加阿魏酸(1g/l)。结果：香草醛的产量0g/上升到0.678g/l。
实施例14：
同实施例1的方法，所不同的是，摇瓶发酵采用外源添加可溶性木质素单体阿魏酸的策略，培养时间为84h，发酵培养基木糖浓度为30g/l，无葡萄糖。步骤(4)发酵培养基中添加阿魏酸(1g/l)。结果：香草醛的产量0g/上升到2.01g/l。
实施例15：
同实施例1的方法，所不同的是，摇瓶发酵采用外源添加可溶性木质素单体阿魏酸的策略，培养时间为84h，发酵培养基木糖浓度为60g/l，无葡萄糖。步骤(4)发酵培养基中添加阿魏酸(1g/l)。结果：香草醛的产量0g/上升到1.53g/l。
实施例16：
同实施例1的方法，所不同的是，摇瓶发酵采用外源添加可溶性木质素单体阿魏酸的策略，培养时间为84h，发酵培养基葡萄糖浓度为10g/l。步骤(4)发酵培养基中添加阿魏酸(1g/l)。结果：香草醛的产量0g/上升到0.42g/l。
实施例17：
同实施例1的方法，所不同的是，摇瓶发酵采用外源添加可溶性木质素单体阿魏酸的策略，培养时间为84h，发酵培养基葡萄糖浓度为30g/l，无木糖。步骤(4)发酵培养基中添加阿魏酸(1g/l)。结果：香草醛的产量0g/上升到1.05g/l。
实施例18：
同实施例1的方法，所不同的是，摇瓶发酵采用外源添加可溶性木质素单体阿魏酸的策略，培养时间为84h，发酵培养基葡萄糖浓度为60g/l，无木糖。步骤(4)发酵培养基中添加阿魏酸(1g/l)。结果：香草醛的产量0g/上升到1.85g/l。
实施例19：
同实施例1的方法，所不同的是，摇瓶发酵采用外源添加可溶性木质素单体阿魏酸的策略，培养时间为84h，发酵培养基葡萄糖与木糖混合糖浓度为40g/l(葡萄糖30g/l，木糖10g/l)。步骤(4)发酵培养基中添加阿魏酸(1g/l)。结果：香草醛的产量0g/上升到2.34g/l。
实施例20：
同实施例1的方法，所不同的是，摇瓶发酵采用外源添加可溶性木质素单体阿魏酸的策略，培养时间为84h，发酵培养基葡萄糖与木糖混合糖浓度为50g/l(葡萄糖25g/l，木糖25g/l)。步骤(4)发酵培养基中添加阿魏酸(1g/l)。结果：香草醛的产量0g/上升到3.57g/l。
实施例21：
同实施例1的方法，所不同的是，摇瓶发酵采用外源添加可溶性木质素单体阿魏酸的策略，培养时间为84h，发酵培养基葡萄糖与木糖混合糖浓度为60g/l(葡萄糖20g/l，木糖40g/l)。步骤(4)发酵培养基中添加阿魏酸(1g/l)。结果：香草醛的产量0g/上升到1.44g/l。