一种溶瘤病毒及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种溶瘤病毒及其应用。

背景技术

溶瘤病毒(oncolyticvirus)是优先感染并杀死肿瘤细胞的一类病毒。初期，部分肿瘤细胞被溶瘤病毒特异性感染和破坏。随后，溶瘤病毒在肿瘤细胞进行复制和繁殖，释放出新的感染性病毒颗粒感染和破坏其他肿瘤细胞。溶瘤病毒通过直接溶解肿瘤细胞或者刺激宿主产生抗肿瘤免疫反应来发挥溶瘤的功效。病毒具有抗肿瘤药物的潜力在20世纪初便被发现，但是，直到20世纪60年代才被正式的进行深入的研究和开发。

目前已有多种病毒包括腺病毒，呼肠孤病毒、麻疹病毒、单纯疱疹病毒、新城疫病毒和牛痘病毒等在临床上作为溶瘤剂进行检测，且自然界中的仅少数病毒可以自然的发生溶瘤(如呼肠孤病毒、塞内卡病毒以及新城疫病毒等)。由国家管理机构批准的第一个溶瘤病毒是遗传修饰的echo-7肠道病毒rigvir，2004年在拉脱维亚批准用于治疗皮肤黑色素瘤。后来(分别在2015年和2016年)，格鲁吉亚(国家)和亚美尼亚也批准了这一规定。2005年，中国公司上海三维(sunway)生物技术有限公司注册了一种名为h101的基因修饰溶瘤腺病毒，并获得了国家食品药品监督管理局的监管部门批准，用于治疗头颈部肿瘤。2015年，usfda和欧盟ema批准t-vec作为第一个溶瘤疱疹病毒(一种改良的单纯疱疹病毒)，用于治疗黑色素瘤，也是目前最成功的一款溶瘤病毒。

新城疫病毒属于禽副粘病毒科，是禽类的致命病毒，但对于人类支造成轻微的流感样症状或结膜炎。新城疫病毒可通过病毒复制使细胞毒性病毒蔓延到身体的每一个癌细胞，但是病毒中和抗体的免疫系统的生产可能会限制这种可能性。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种溶瘤病毒，其具有溶瘤能力，可用于制备抗肿瘤药物。

本发明的第二目的在于提供一种载体，其能够装载溶瘤病毒，精准靶向肿瘤细胞，具有促进病毒特异性免疫反应以及增强抗肿瘤效果的优点。

本发明的第三目的在于提供一种装载有溶瘤病毒的免疫效应细胞的制备方法，能够制备出具有溶瘤效果的免疫效应细胞。

本发明的第四目的在于提供上述载体或上述溶瘤病毒在制备抗肿瘤药物中的应用，其能够制备出能够精确靶向肿瘤且抗肿瘤效果卓越的抗肿瘤药物。

本发明的第五目的在于提供一种抗肿瘤药物，其具有抗肿瘤效果卓越的优点。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种溶瘤病毒，其保藏号为cctccnov201809。

本发明提供了一种载体，该载体装载有上述的溶瘤病毒。

本发明提供了一种装载有溶瘤病毒的免疫效应细胞的制备方法。该制备方法包括将溶瘤病毒溶液与免疫效应细胞溶液接触，溶瘤病毒溶液中的溶瘤病毒为上述溶瘤病毒。

本发明提供了上述溶瘤病毒或上述载体在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明提供了一种抗肿瘤药物，其包括有上述的溶瘤病毒或上述的载体。

本发明具有以下有益效果：

本发明实施例提供的溶瘤病毒，其保藏号为cctccno.v201809。该溶瘤病毒具有溶瘤能力，可用于制备抗肿瘤效果卓越的抗肿瘤药物。

本发明实施例提供的包含上述溶瘤病毒的载体，该载体能够转载溶瘤病毒，精准靶向肿瘤细胞，具有促进病毒特异性免疫反应以及增强抗肿瘤效果的优点。

本发明实施例提供的装载有溶瘤病毒的免疫效应细胞的制备方法，其包括将上述溶瘤病毒与免疫效应细胞容易接触，该方法能够制备出靶向性好，抗肿瘤效果卓越的免疫效应细胞。

本发明实施例提供上述溶瘤病毒或上述载体在制备抗肿瘤药物中的应用。该应用能够制备出抗肿瘤效果卓越的抗肿瘤药物。

本发明实施例提供的一种抗肿瘤药物，其包括有上述溶瘤病毒或上述载体，该药物具有能够精确靶向肿瘤且抗肿瘤效果卓越的的优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明第二实施例提供的装载溶瘤病毒的免疫效应细胞的共聚焦结果图；

图2为本发明第三实施例提供的ndv/fmw感染肺癌细胞后的细胞存活图；

图3为本发明第三实施例提供的ndv/fmw感染甲状腺癌细胞后的细胞存活图；

图4为本发明第三实施例提供的ndv/fmw感染人胚肺成纤维细胞以及cik细胞后的细胞存活图；

图5为本发明第三实施例提供的装载ndv后cik细胞中cd8⁺tcell以及cd3⁺cd56⁺nktcell的变化结果图；

图6为本发明第四实施例提供的裸鼠皮下瘤体积变化结果图；

图7为本发明第五实施例提供的cik、ndv/fmw以及ndv/fmw+cik的he染色结果图；

图8为本发明第六实施例提供的ndv在肿瘤细胞以及cik细胞中的复制能力结果图；

图9为本发明第一对比例提供的流式细胞仪检测cik细胞装载ndv的效率结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的溶瘤病毒及其应用进行具体说明。

一方面，本发明实施例提供一种溶瘤病毒，具体为新城疫病毒ndv/fmw株，该病毒株已保藏于2018年2月6日中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏号：cctccnov201809。该溶瘤病毒具有溶瘤能力，能够用于制备抗肿瘤药物中。该溶瘤病毒的溶瘤能力可以通过向肿瘤细胞组织注射该溶瘤病毒溶液，肿瘤细胞变小，说明该溶瘤病毒对肿瘤组织具有溶瘤能力。

溶瘤病毒是一类具有复制能力的肿瘤杀伤性病毒，可通过多种机制发挥抗肿瘤作用。然而，机体的免疫监视作用使溶瘤病毒不能高效到达肿瘤部位而不足以治疗肿瘤。因此，本发明实施例提供一种载体，其装载有上述溶瘤病毒。细胞载体作用溶瘤病毒的容器，可是溶瘤病毒逃避免疫监视，两者联合，具有更好的抗肿瘤功效。

该载体包括有免疫效应细胞、间充质干细胞、内皮系细胞以及肿瘤细胞中的一种或多种。优选地，该免疫效应细胞可以包括有抗原特异性t细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞、肿瘤相关的巨噬细胞、外周血淋巴细胞以及树突状细胞。

优选地，该免疫效应细胞为cik细胞。cik细胞，英文名称为cytokineinducedkiller，即细胞因子诱导的杀伤细胞，是一种新型的免疫活性细胞，增值能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。cik细胞对肿瘤细胞的识别能力很强，能够精确地靶向肿瘤细胞，但不会伤及正常细胞，杀瘤谱广，安全性好。装载有上述溶瘤病毒的cik细胞，其结合了cik细胞的肿瘤靶向性以及溶瘤病毒的肿瘤杀伤力，达到了更好的抗肿瘤效果。

装载有溶瘤病毒的载体能够在靶向肿瘤能力的基础上，增强载体的溶瘤能力，提高载体的抗肿瘤效应。本发明实施例还提供一种装载有溶瘤病毒的免疫效应细胞的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

该制备方法包括将溶瘤病毒溶液与免疫效应细胞溶液接触，溶瘤病毒溶液中的溶瘤病毒为上述本发明实施例提供的溶瘤病毒ndv/fmw。

进一步地，溶瘤病毒的感染复数为10～100moi，免疫效应细胞溶液的细胞密度为1ⅹ10⁶～5ⅹ10⁶细胞/ml。

溶瘤病毒的感染复数可以为：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98或100moi。

免疫效应细胞溶液的细胞密度可以为：1ⅹ10⁶细胞/ml、1.5ⅹ10⁶细胞/ml、2ⅹ10⁶细胞/ml、2.5ⅹ10⁶细胞/ml、3ⅹ10⁶细胞/ml、3.5ⅹ10⁶细胞/ml、4ⅹ10⁶细胞/ml、4.5ⅹ10⁶细胞/ml或5ⅹ10⁶细胞/ml。

当溶瘤病毒的感染复数为10～100moi，免疫效应细胞溶液的细胞密度为1ⅹ10⁶～5ⅹ10⁶细胞/ml时，溶瘤病毒能够最大量的被cik细胞运载。

此外，本发明还提供上述溶瘤病毒或载体在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明实施例还提供一种抗肿瘤药物，其包括有上述溶瘤病毒或上述免疫效应细胞。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

第一实施例

本实施例提供的一种装载有溶瘤病毒的免疫效应细胞(cik细胞)的制备方法。

cik细胞的诱导及增值

实验耗材

x-vivo15无血清培养基：1000ml/瓶，生产商为lonza,walkersville,md,usa；il-2(重组人白细胞介素-2)：20万iu/支和100万iu/支，生产商为山东泉港药业有限公司；il-1α(重组人白细胞介素-1α)：10μg/支，生产商为peprotech；cd3抗体(抗cd3单抗)：500μg/支，生产商为e-bioscience；ifn-γ(重组人ifn-γ)：1.0mg/支，生产商为peprotech。

实验方法

首先，实验准备，紫外线消毒30min。打开超净工作台的排风和照明开关，75％酒精擦拭工作台面。

收集血常规检查外周血中白细胞≥3×10⁶/ml，淋巴细胞计数≥6×10⁵/ml的外周血50ml。取50ml离心管，将收集的外周血缓慢注入离心管中，进行全血离心，20℃，2000r/min离心10min。待离心结束后，吸取上层血浆于一支50ml离心管中，56℃，灭活30min备用。

向留有血细胞的离心管中加入生理盐水至50ml，吸管缓慢吸吹混合均匀。将混合均匀的血液缓慢加入到淋巴细胞分离液面上层，确保分层清晰，进行离心，20℃，800g离心20min。

收集两个管分离液中单个核细胞层(乳白色细胞环)至50ml离心管中，加入生理盐水至50ml，离心(20℃，2000r/min，8min)。然后弃上清，扣摇，加入生理盐水至50ml，离心(20℃，2000r/min离心5min)，重复洗涤两次。弃上清，扣摇，向离心管中加入一定量的细胞培养液，用吸管将细胞吹吸均匀移至细胞培养瓶中，培养液刷洗一次离心管。

培养瓶液体总量约50ml，加入2.5ml灭活血浆和γ-干扰素，γ-干扰素的终浓度1000iu/ml，混合均匀。显微镜观察细胞数量和状态，置于饱和湿度，37℃，5％co2培养箱中，进行培养24小时。

第二天，从培养箱中取出培养24h的细胞，肉眼观察培养液颜色，培养液透明度，镜下观察细胞数量及状态。加入一支混合因子(cd3抗体终浓度：100ng/ml；il-2终浓度：1000iu/ml；il-1α终浓度：1ng/ml)，置于饱和湿度，37℃，5％co2培养箱中，继续培养。

第五天，肉眼观察培养液颜色，镜下观察细胞数量和生长状态，确认cik细胞活性。确认后的细胞转至两个细胞培养瓶中，培养基中含il-21000u/ml,置于饱和湿度，37℃，5.0％co2培养箱中，继续培养。

第十五天，获得可用于装载ndv的cik细胞。

cik细胞的鉴定

培养瓶中cik细胞为无色半透明细胞悬浊液。采用自动细胞计数仪台盼蓝染色法，细胞存活率不低于90％。使用流式细胞仪检测，cd3⁺cd56⁺与cd3^-cd56⁺之和大于等于20％。采用cck-8试剂盒，当效靶比为20:1时，应保证cik细胞对白血病细胞株k562杀伤率大于50％。

将分离得到的cik细胞体外培养14天，用pbs清洗三次，然后用x-vivo.15无血清培养基重悬调整细胞密度为1×10⁶～1×10⁷/ml，细胞存活率不低于90％。

调整cik细胞溶液浓度至5ⅹ10⁶细胞/ml，随后取含有上述溶瘤病毒(fmw)的溶瘤病毒溶液，将溶瘤病毒溶液以10moi的感染复数与cik细胞溶液混合得到混合溶液，将混合溶液在37℃下孵育4小时，pbs洗去未结合的病毒，x-vivo.15无血清培养基重悬后，得到装载有溶瘤病毒的免疫效应细胞。

第二实施例

验证第一实施的例制备方法制得的免疫效应细胞装载有溶瘤病毒。

实验方法

采用激光共聚焦显微镜观察第一实施例提供的装载溶瘤病毒的免疫效应细胞cik细胞。具体地，在六孔板中放入细胞爬片，接种cik细胞悬液(2ml/孔)，放入培养箱预培养24小时，10moi溶瘤病毒(ndv/fmw)在37℃下感染cik细胞4小时。

取出爬片，pbs清洗2次，每次5分钟；4％多聚甲醛固定15分钟，pbs清洗2次，每次5分钟；0.03％triton100透化10分钟，pbs清洗2次，每次5分钟；hn(ndv病毒蛋白)抗体4℃孵育过夜，pbs清洗2次，每次5分钟；羊抗兔红色荧光二抗室温孵育30分钟，pbs清洗2次，每次5分钟；dapi染色10分钟，pbs清洗2次，每次5分钟；用含猝灭剂的封片剂封片，共聚焦观察hn蛋白分布。

实验结果

共聚焦结果如附图1所示，观察附图1可知，ndv病毒(溶瘤病毒)蛋白hn分布于细胞膜表面，结果显示ndv成功装载到cik细胞表面。

第三实施例

验证装载溶瘤病毒后对cik细胞的影响。

装载ndv对肿瘤细胞以及对cik细胞的细胞存活影响

实验方法

采用cck8试剂盒(cellcountingkit8)检测细胞活力。具体地，在96孔板中接种细胞悬液(100μl/孔)，放入培养箱预培养24小时。(此处的细胞悬液为以下几种细胞：肺癌细胞(a549和h460)，甲状腺癌细胞(thj-16t和thj-29t)，人胚肺成纤维细胞(mrc-5)，cik细胞)。不同moi(0.001，0.01，0.1，1)ndv/fmw感染肺癌细胞(a549和h460)、甲状腺癌细胞(thj-16t和thj-29t)、人胚肺成纤维细胞(mrc-5)、cik细胞24，48和72小时。提前1小时向每孔加入10ul的cck8溶液，继续培养1小时。用酶标仪测定450nm处吸光度。其中，moi(muhiplieityofinfection，感染复数，及病毒颗粒数/细胞数的比值)。实验结果如附图2～4所示。

实验结果

根据附图2～4可知，ndv显著抑制多种肿瘤细胞增殖，说明ndv有很强溶瘤能力，ndv对正常胚肺成纤维细胞(mrc-5)和cik细胞生长无抑制作用，说明ndv不影响正常细胞增殖。

装载ndv对cik细胞中的cd8⁺t以及nkt细胞的影响

实验方法

在6cm平皿中接种cik细胞悬液(4ml/皿)，放入培养箱预培养24小时。10moindv/fmw在37℃下感染cik细胞4小时。分别收集感染和未感染ndv的cik细胞，离心(2000转每分钟，五分钟)去上清。加入cd8抗体，或者加入cd3和cd56抗体。流式分选cd8⁺或cd3⁺和cd56⁺的cik细胞，计算在装载ndv前后cik细胞中的比值。结果如附图5所示。

实验结果

根据附图5可知，ndv装载前后，cd8⁺t细胞以及nkt细胞数量没有变化，说明装载ndv后不影响cik细胞活性。

第四实施例

验证第一实施例的制备方法制得的装载ndv后的cik细胞的溶瘤能力。

实验方法

取6周龄裸鼠40只，皮下注射h460细胞(1×10⁷/只)。待裸鼠皮下肿瘤达到200cm²(约14天)，将40只荷瘤裸鼠随机分为4组，每组10只。分别为a：pbs空白对照组；b：cik治疗组；c：ndv/fmw治疗组；d：ndv/fmw转载cik(ndv/fmw-cik)治疗组。瘤内注射，每周2次，治疗5周。每5天测量裸鼠皮下瘤体积，共记录40天，绘制折线图，如附图6所示。

实验结果

根据附图6可知，装载ndv/fmw的cik(ndv/fmw-cik)治疗与cik治疗组以及ndv/fmw治疗组比较，cik(ndv/fmw-cik)抑制肿瘤生长能力最强。

第五实施例

本实施例提供免疫组化方法检测第一实施例的制备方法制备的装载有ndv的cik细胞对老鼠肿瘤的效果。

实验方法

取6周龄裸鼠20只，皮下注射h460细胞(1×10⁷/只)。待裸鼠皮下肿瘤达到200cm²，将20只荷瘤裸鼠随机分为4组，每组5只。分别为a：pbs空白对照组；b：cik治疗组；c：ndv/fmw治疗组；d：ndv/fmw转载cik(ndv/fmw-cik)治疗组。瘤内注射，每周2次，治疗3周。3周后将荷瘤裸鼠麻醉后安乐死，取肿瘤组织制作病理切片。采用苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin，he)，he染色步骤如下：

石蜡切片置于60℃烘箱中，烘片4小时脱蜡，pbs冲洗3次，每次5分钟。按照以下流程处理切片：二甲苯(i)5min→二甲苯(ⅱ)5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水清洗5min。滴加苏木素染色5min，流水冲洗。滴加盐酸乙醇分化30s，蒸馏水浸泡15min，滴加伊红液染色2min，常规脱水，透明，封片：95％乙醇(i)min→95％乙醇(ⅱ)1min→100％乙醇(i)1min→100％乙醇(ⅱ)1min→二甲苯石碳酸(3：1)1min→二甲苯(i)1min→二甲苯(ⅱ)1min→中性树脂封片。

免疫组化检测cd3阳性率(指示cik细胞)

免疫组化步骤：

石蜡切片置于60℃烘箱中，烘片4小时脱蜡，pbs冲洗3次，每次5分钟。取ph＝6.0柠檬酸盐缓冲液加热至沸腾，将脱蜡水化后的切片放入已沸腾的缓冲液中，微波处理10分钟，流水自然泠却，pbs冲洗3次，每次5分钟。在切片滴加3％h2o2，室温孵育10分钟，pbs冲洗3次，每次5分钟。吸干pbs，每滴加cd3抗体(1：200)，室温下孵育3小时，pbs冲洗3次，每次5分钟。滴加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，室温下孵育30分钟，pbs冲洗3次，每次5分钟。吸干pbs液，滴加新鲜配制的dab液(二氨基联苯胺)，显微镜下观察5分钟。然后苏木素复染，0.1％hcl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经95％乙醇(i)min→95％乙醇(ⅱ)1min→100％乙醇(i)1min→100％乙醇(ⅱ)1min→二甲苯石碳酸(3：1)1min→二甲苯(i)1min→二甲苯(ⅱ)1min→中性树脂封片。

实验结果

he染色结果如附图7所示，根据图7可知cik、ndv/fmw以及ndv/fmw+cik出现肿瘤细胞坏死现象。cd3抗体(作为cik细胞指示标记)染色显示，在cik和ndv/fmw+cik治疗组小鼠切片中可检测到cd3表达，且ndv/fmw中cd3的数量大大多于cik中cd3的数量，说明ndv/fmw和cik的融合能够有效增加免疫原力，有效增强细胞的抗肿瘤能力。

第六实施例

验证ndv在肿瘤细胞以及cik细胞中的复制能力。

实验方法

在6孔板中接种细胞悬液(2ml/孔)，放入培养箱预培养24小时，(此处的细胞悬液为以下几种细胞，细胞个数均为6000/孔，肺癌细胞(a549和h460)，甲状腺癌细胞(thj-16t和thj-29t)，cik细胞。)0.01moindv/fmw感染肺癌细胞(a549和h460)、甲状腺癌细胞(thj-16t和thj-29t)、人胚肺成纤维细胞(mrc-5)、cik细胞24，48和72小时。收集细胞和细胞上清冻融3次，离心收集上清(待测病毒液)。在96孔板中接种df1细胞(ndv的宿主细胞，用于测量病毒滴度)悬液(100ul/孔)，放入培养箱预培养24小时。将待测病毒液10倍比稀释(10^-1-10^-11)，分别加入96孔板每列，每个梯度病毒8个复孔，继续培养(5％co2，37℃)；5～7天后观察病变，计算病毒滴度，滴度用reed-muench两氏法精确算出，实验结果如附图8所示。

实验结果

其中，对于cik细胞，当待测病毒液的稀释度为10^-8时出现75％阳性，当稀释为10^-9时出现20％阳性，距离比例＝(高于50％病变率的百分数-50％)/(高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数)，即距离比例＝(75％-50％)/(75％-25％)＝0.5。对于100μl的稀释液，lgtcid50＝距离比例×稀释度对数之间的差+高于50％病变率的稀释度的对数，即lgtcid50＝0.5×(-1)+(-8)＝-7.5/100ul，tcid50＝108.5/100μl＝109.5/ml≈3.16×10⁹/ml，将tcid50/ml转换为pfu/ml(此为病毒颗粒的单位)：病毒滴度＝3.16×10⁹tcid50/ml×0.7＝2.2×10⁹pfu/ml。

根据附图8可知，ndv在肺癌细胞以及甲状腺癌细胞中复制，且呈时间依赖性。ndv在cik细胞中同样可以复制，但是复制能力比在肿瘤细胞中的复制能力弱。说明，ndv可以在cik中复制、存活，但是不会大规模的杀伤cik细胞。

第一对比例

验证第一实施例提供的制备方法中ndv的感染复数。

实验方法

收集第一实施例提供的制备方法制备好的cik细胞(活性达到90％以上)，2000r/min离心5min，pbs重复清洗细胞2次。无血清培养基重悬cik细胞，并调整其细胞密度，调整为1×10⁶、5×10⁶以及1×10⁷各三组。取感染复数为1moi、10moi以及100moi的ndv分别与三组不同细胞密度的cik细胞在37℃下孵育4小时，pbs洗去未结合的病毒，无血清培养基重悬细胞，得到装载了ndv的cik细胞。抗ndvhn蛋白抗体室温孵育1小时。fitc山羊抗兔igg二抗孵育30min，然后通过流式细胞仪检测ndv装载cik细胞的效率，检测结果如附图9所示。

根据附图9可知，5×10⁶cik细胞+10moindv(88.5％)和5×10⁶cik细胞+100moindv(89.6％)两组均接近90％，但5×10⁶cik细胞+10moindv组合比5×10⁶cik细胞+100moindv组合消耗更少的ndv，因此，选择5×10⁶cik细胞+10moindv组合为最优方案。

综上所述，本发明实施例提供的溶瘤病毒，其保藏号为cctccno.v201809。该溶瘤病毒具有溶瘤能力，可用于制备抗肿瘤效果卓越的抗肿瘤药物。

本发明实施例提供的包含上述溶瘤病毒的载体，该载体能够转载溶瘤病毒，精准靶向肿瘤细胞，具有促进病毒特异性免疫反应以及增强抗肿瘤效果的优点。

本发明实施例提供的装载有溶瘤病毒的免疫效应细胞的制备方法，其包括将上述溶瘤病毒与免疫效应细胞容易接触，该方法能够制备出靶向性好，抗肿瘤效果卓越的免疫效应细胞。

本发明实施例提供上述溶瘤病毒或上述载体在制备抗肿瘤药物中的应用。该应用能够制备出抗肿瘤效果卓越的抗肿瘤药物。

本发明实施例提供的一种抗肿瘤药物，其包括有上述溶瘤病毒或上述载体，该药物具有能够精确靶向肿瘤且抗肿瘤效果卓越的的优点。

此外，本发明还提供上述载体或溶瘤病毒在制备抗肿瘤药物中的应用以及包括上述溶瘤病毒或包括上述载体的抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物具有抗肿瘤效果卓越的优点。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。