簇生朝天椒可育胞质的分子鉴定标记及保持系选育方法与流程

本发明属于育种技术领域，具体涉及簇生朝天椒可育胞质的分子鉴定标记及保持系选育方法。

背景技术

我国辣椒栽培区域广泛，是仅次于印度的世界加工型辣椒第二大出口国。簇生朝天椒是加工型辣椒的重要类型之一，为辣椒的一个变种。簇生朝天椒因适应性广、营养成分丰富、加工利用广泛而受到世界各地的高度重视，对提高人民生活水平、增加农民经济收入效果显著。目前簇生朝天椒有许多地方品种，如‘三樱椒’、‘子弹头’、云南省建水的‘樱桃辣’、云南和贵州的‘鸡心辣’等。这些品种对当地自然或栽培环境具有非常好的适应性，具有一定不可替代的优良性状，适应当地辣椒产业需求。这些地方品种在辣椒品种中占据不可替代的位置。但仍需认识到，常规和地方品种在果实品质、产量、抗逆性、整齐度、加工率等等方面还存在问题，在保留本身优良性状的同时急需提升综合性状。

辣椒杂交种较常规种具有显著的杂种优势，改良或利用地方常规品种选育高品质、丰产、抗病、整齐度高的杂交种是产业的需求。由于采用辣椒雄性不育系进行三系配套的杂交种可降低制种成本的50%以上，因此快速选育出具有优良性状的地方常规品种的保持系至关重要。辣椒雄性不育系制种主要采用细胞质型雄性不育系，育性由细胞核和细胞质基因共同控制的核质互作型雄性不育系，细胞质基因n控制雄性可育的表观形态、细胞质基因s控制雄性不育的表观形态。由于细胞质型雄性不育系既能筛选到保持系，又能筛选到恢复系，容易实现“三系配套”，因此利用广泛。目前，辣椒胞质型雄性不育系保持系的选育方法主要采用常规测交回交方法，把不育株s（msms）的ms核基因转移到恢复系n（msms）的可育细胞质中，即人工合成保持系n（msms），其缺点是工作量大、周期较长。以100%已知品种不育系s(msms)×待转育品种测交（经济性状好、配合力高的品种），从中筛选出对雄性不育性保持率高的植株；然后用获得不育单株（株系）与待转育品种连续回交，直至杂交后代100%雄性不育，即为转育成功的保持系。但由于地方常规品种的基因型未知且混杂，因此选育工作量更大。

关于细胞质育性的鉴定，传统上鉴定不育胞质与可育胞质基因型主要依靠田间种植检测法(grow-outtestgot)，该方法建立在检测有代表性的成熟期植株表型和花器官形态的基础上，需要在开花季节才能检测，费时费工，易受自然灾害影响。随着分子标记技术的快速发展，使缩短选育年限和利用苗期选择减少田间杂交工作量成为可能。大部分用于诊断雄性不育的dna标记都是基于线粒体dna的分子标记。植物育种中分子标记的不稳定已经被充分地认识，但新型的分子标记可利于节约、快速和大量筛选本领域技术人员选育目标的样本。近几年，利用分子标记辅助育种标记方法可区分棉花、洋葱、油菜等不育和可育胞质已成为可能，其优点开发简单实用、稳定、并能快速准确鉴定优良单株胞质类型。张晓（2011）等开发了用于鉴定棉花可育胞质和不育胞质的标记，分别为ssr160、scar515和scar555标记。李永博（2015）开发了区分洋葱细胞质基因s型与n型细胞质的scar标记，命名为oc2175。衡双平（2015）通过对甘蓝型油菜利用haucms线粒体基因组特异的orfs开发标记，可以将不育系和保持系成功区分开。吉姣姣（2014）等通过辣椒(capsicumannuuml.)的花蕾进行线粒dna提取、聚丙烯酞胺凝胶电泳及tail-pcr技术，开发出一个特异标记scar130，该标记可以鉴定辣椒的雄性不育类型胞质；但应用该标记进行鉴定需要等到花蕾期，周期长，操作也相对复杂。而关于簇生朝天椒可育细胞质的鉴定的研究报道尚未发现，也未见快速选育保持系的方法。

技术实现要素：

本发明提供了簇生朝天椒可育胞质的分子鉴定标记及保持系选育方法。首先利用种子培育簇生朝天椒优良品种的黄化苗，采用高多糖/酚植物线粒体dna萃取法进行线粒体dna提取，其浓度在60~260ng/μl间满足要求，-20℃保存。然后依据本发明开发的簇生朝天椒可育胞质基因型（n）鉴定的特异扩增的分子标记mt_indel10和本发明确定的pcr体系条件，鉴定筛选搜集的具有可育胞质基因型（n）的品种。最后以100%雄性不育系材料与入选的具有可育胞质基因型n的品种，花期杂交，根据杂交后代育性分离情况，快速选育具有优良表观性状的雄性不育系和保持系，为雄性不育三系配套杂交育种储备保持系库。本发明所述的选育方法是建立在科学实验基础之上的，将分子标记筛选和常规杂交育种结合，减少了常规选育的盲目性，缩短选育年限，提高定向选择效果，加快育种进程，对加快簇生朝天椒优良地方品种的改良和提升具有重要应用价值。

为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

本发明提供了簇生朝天椒可育胞质的分子鉴定标记，所述分子鉴定标记为mt_indel10，其引物序列为：

mt_indel10-f：5’-cgccatttctttccttcaat-3’；

mt_indel10-r：5’-gttcaccccttcggcttct-3’。

本发明还提供了利用所述的分子鉴定标记的保持系选育方法，所述选育方法包括以下步骤：

（1）选择结果多、果实端正、生长势强、无病虫害的簇生朝天椒优良品种，取饱满种子；

（2）将饱满种子消毒并漂洗干净；然后进行浸种催芽，将发芽的种子移至黑暗环境下，继续培养黄化苗；

（3）将所述黄化苗去除子叶上的种皮和根，选取地上组织提取线粒体dna；

（4）以线粒体dna为模板进行簇生朝天椒pcr扩增；取扩增产物进行电泳分离分析，根据目的片段大小选取具有可育胞质的优良品种。

进一步的：对选取的具有可育胞质的优良品种，进一步利用100%雄性不育系进行测交，母本为隔离种植的100%雄性不育系，父本为隔离种植的所述具有可育胞质的优良品种；

如果测交后代群体85%-100%雄性不育，则其父本为具有可育胞质品种，且其细胞核基因型为msms，入选保持系；

如果测交后代雄性不育：雄性可育=1:1，则其父本为具有可育胞质品种，入选保持系；以母本为100%雄性不育系单株，父本为此保持系自交后代并单株挂牌标记的单株，杂交后代中的全部可育株系淘汰，杂交后代中的雄性不育率大于85%的不育株系入选，其对应的父本株系，则为入选的保持系；饱和回交，选育出胞质雄性不育同型保持系，细胞核基因型为msms；

如果测交后代85-100%雄性可育，则其父本为具有可育胞质品种，其细胞核基因型为msms，淘汰。

进一步的：所述步骤（2）中将辣椒饱满种子放入50℃-55℃热水中恒温浸种15-20分钟，然后加入冷水降到20℃-30℃。

进一步的：所述步骤（2）中催芽的温度为28℃-30℃。

进一步的：所述步骤（2）中黄化苗培养16-20天。

进一步的：所述步骤（3）中线粒体dna的浓度在60~260ng/μl间。

进一步的：所述步骤（3）中pcr反应体系为：取线粒体dna模板2μl，正反引物各1μl，2×gotaqrcolorlessmastermix3.5μl，ddh2o7.5μl。

进一步的：所述步骤（3）中pcr反应程序为：94℃预变性5min；94℃预变性1min；56.8℃退火45s；72℃延伸1min；72℃总延伸10min；4℃保存扩增产物；共35个循环数。

进一步的：所述步骤（4）中可育胞质目的片段大小为128bp。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：

1.本发明开发出快速、易检测的簇生朝天椒可育细胞质（n）的线粒体基因标记，只需以待检测品种的黄化苗为材料，通过mtdna提取、pcr体系扩增、琼脂糖检测即可。其优点：周期短、操作简单、费用低、稳定性好、条带扩增清晰、易于区分，鉴定结果更为准确，普通实验室即可完成操作。

2.本发明确定的适于簇生朝天椒线粒体indel-pcr体系条件，可为朝天椒可育胞质的鉴定筛选提供基础条件。

3.本发明确定的簇生朝天椒黄化苗培育方法，不同于以往的组培方法，简单、易行、快速。

4.快速选育具有地方品种优良表观性状的雄性不育系和保持系，为雄性不育三系配套杂交育种提供母本储备。

5.利用地方品种，减少盲目性，避免从头开始合成保持系，可有效的在辣椒红素含量、易干性、辣度等育种目标方面提升原有的母本不育系，加快育种进程。

6.利用本方法对于簇生朝天椒的育种转育中间材料的单株检测鉴定，也起到加速母本选育进程的作用。

7.有针对性合成簇生朝天椒种质资源材料，有目的鉴定并合成辣椒可育胞质（n）材料和雄性不育胞质（s）材料，为辣椒种质资源创新和雄性不育机理研究提供材料合成方法。

附图说明

图1是培育的簇生朝天椒地方品种黄化苗；

图2是簇生朝天椒‘001b’可育细胞质与‘001a’雄性不育细胞质在线粒体基因组序列比对结果；

图3是分子标记mt_indel10在簇生朝天椒可育胞质（n）与不育胞质（s）材料的2%琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中m：markerd2000；1：具有不育胞质的不育系材料；2：具有可育胞质的保持系材料；图中箭头所指为目的差异条带。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

实施例1

1.具有优良性状的簇生朝天椒地方品种准备：

簇生朝天椒优良地方品种可采用株选，在田间选择结果多，果实端正，生长势强，无病虫害，具有该品种特征的标准单株，选好后，插上标志，作为种株。待果实红熟后采收，用种子网袋并进行编号、拍照留证和重要经济性状登记，之后剖开取子，再晾晒干，取饱满种子500粒以上，贮藏备用。取其中种子150粒进行下一步骤黄化苗的培养。

本发明所述的地方品种指的是：地方品种是在当地自然环境条件下，经长期自然或人为选择形成的辣椒品种，对当地自然环境具有较好的适应性，一般为辣椒常规品种，而非人为利用雄性不育配制的杂交种。如“三樱椒”、“樱田早红”等均为地方品种。

簇生朝天椒黄化苗的培养：

可育胞质的鉴定需要的材料是黄化苗。黄化苗的培育是将挑选好的辣椒种子放入50℃-55℃热水中，恒温浸种15-20分钟，并不断地搅动，待水温下降时加入热水，使水温保持在50℃-55℃之间，20分钟后加入冷水降到20℃-30℃。用10%磷酸三钠溶液浸泡20分钟后用清水冲洗干净，种子消毒后，放入25℃左右水中。之后，在室温下浸泡12小时左右，然后进行浸种催芽。

然后将100粒种子放入做好标记的培养皿中，置于人工气候箱培养箱，设置催芽的适宜温度为28℃-30℃。下铺四层纱布，保持湿润。未出芽前，每天要投洗1-2次。经4-5天后出芽可达70%左右。将发芽的种子移至黑暗环境下（环境温度20-30℃，保证黑暗），每天按时补水，继续培养黄化苗16-20天后（见图1），即可作为下一步骤线粒体的提取材料。

簇生朝天椒线粒体dna的提取：

本发明采用高多糖/酚植物线粒体dna萃取试剂法提取（也可以采用市售的试剂盒进行提取）。实验开始前，将试剂盒里的净化液（reaydntc）冻融，然后移出1ml净化液（reaydntc）和4ml的裂解液（reaydntb）到15ml锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，置入冰槽里备用。然后进行下列操作：

（1）将准备好的辣椒黄化苗，去除子叶上的种皮和根，并千分之一天平秤取1g组织；

（2）放进预冷的50ml锥形离心管；

（3）加入10ml清理液（reaydnta）清洗1次；

（4）即刻用刀片切碎（3-5mm）组织；

（5）放进一个预冷的15ml锥形离心管；

（6）加入预冷的5ml裂解工作液；

（7）涡旋震荡5秒，充分混匀；

（8）即刻放进预冷的20ml的玻璃匀浆器，在冰槽里快速用匀浆棒匀化组织（直至看不到细微组织）；

（9）准备1个小型漏斗，内衬60μm尼龙网，置于50ml锥形离心管上；

（10）将所有组织匀浆液移入到4层纱布小型漏斗里过滤；

（11）将所有组织匀浆物移入15ml锥形离心管，放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1218rpm；

（12）小心移出上清液到另一个新的预冷的15ml锥形离心管，如果上清液含有肉眼可见的残渣，需重复离心5分钟一次，速度为2437rpm。此步骤目的是为了去除细胞壁、淀粉颗粒、细胞核和未溶解的细胞以及完整质体等残渣；

（13）放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为8125rpm；

（14）加入300μl破膜液（reaydntf）到线粒体颗粒样品中；

（15）涡旋震荡15秒，混匀颗粒群；

（16）转入1.5ml离心管；

（17）置入冰槽中孵育15分钟；

（18）加入30μl去干扰液（reaydntg）；

（19）用200μl枪头上下抽吸混匀；

（20）放进37℃恒温水槽孵育15分钟；

（21）加入30μl酶解液（reaydnth）；

（22）用涡旋震荡仪，涡旋震荡15秒，充分混匀；

（23）放进58℃恒温水槽孵育2小时；

（24）置于室温下冷却15分钟，直至处于室温状态；

（25）加入300μl萃取液（reaydnti）（注意：使用前摇匀）；

（26）涡旋震荡仪，涡旋震荡5秒，充分混匀；

（27）放进微型台式离心机离心5分钟，速度为13000rpm；

（28）移出上层液相溶液到新的2ml离心管（注意：切莫触碰液相交界面上的白色膜状物）；

（29）加入100μl浓缩液（reaydntj）到新的离心管；

（30）加入1μl助沉液（reaydntk）；

（31）加入800μl沉淀液（reaydntl）；

（32）在涡旋震荡仪上震荡5秒，充分混匀；

（33）离心前做好方位标记，以便离心后观察管底沉淀颗粒，放进微型台式离心机离心15分钟，速度为13000rpm；

（34）小心抽掉上清液；

（35）加入1ml纯化液（reaydntm）；

（36）放进微型台式离心机离心5分钟，速度为13000rpm；

（37）小心抽掉上清液；

（38）空气中晾干沉淀颗粒群；

（39）加入20μl缓冲液（reaydntn）溶解；

（40）移出1μl进行mtdna的浓度检测。

提取的簇生朝天椒mtdna浓度检测：

利用微量紫外分光光度计测定a260/a280、a260/a230的od值和线粒体dna浓度，能满足后续工作的条件为a260/a280的od值在1.6~1.9间，a260/a230的od值在1.7~2.0间，线粒体dna浓度在60~260ng/μl间，将适合进行下一步工作的mtdna样品于-20℃保存。

确定并合成簇生朝天椒可育胞质鉴定标记mt_indel10：

本发明利用美国国立生物技术信息中心（ncbi）数据库进行辣椒线粒体基因组同源性片段比对，根据不育系与保持系存在的细胞质育性差异，利用primer3软件重新设计特异引物。引物序列如下：

mt_indel10-f5’-cgccatttctttccttcaat-3’（seqidno:1）；

mt_indel10-r5’-gttcaccccttcggcttct-3’（seqidno:2）。

簇生朝天椒pcr扩增：

（1）反应体系（15.0μl）：取mtdna模板2.0μl，正反引物各1.0μl，2*gotaqrcolorlessmastermix3.5μl，ddh2o7.5μl。

（2）反应程序：94℃预变性5min；94℃预变性1min；56.8℃退火45s；72℃延伸1min；72℃总延伸10min；4℃保存扩增产物；共35个循环数。

．基于可育胞质鉴定标记mt_indel10在簇生朝天椒001a和001b细胞质育性鉴定中的验证

利用本发明开发的mt_indel10标记，以簇生朝天椒不育系001a（雄性不育）与保持系002b（雄性可育）的mtdna为模板进行pcr反应，目的片段纯化、经ta克隆后进行测序。拼接结果显示（如图2所示），雄性不育细胞质（s）目的片段大小为118bp，雄性可育胞质（n）目的片段大小为128bp，测序结果表明存在10bp差异。说明，利用本发明开发的标记在簇生朝天椒细胞质育性鉴定方面准确有效。

利用标记mt_indel10鉴定簇生朝天椒可育胞质材料：

100%雄性不育系与同型保持系，取线粒体pcr扩增产物5μl于2%琼脂糖凝胶进行电泳分离分析，分子量大小为2000bp的marker2μl，130v电压下电泳50min，置于凝胶成像系统成像保存。簇生朝天椒不育胞质（s）目的片段大小为118bp，可育胞质（n）目的片段大小为128bp，能有效的区分不育系（不育胞质）与保持系（可育胞质）。

簇生朝天椒地方品种的苗期可育胞质（n）的鉴定：

苗期采用步骤6的操作方法，进行保持系的可育胞质（n）材料筛选。通过琼脂糖凝胶电泳检测，若待检测的未知胞质材料与100%雄性不育保持系材料一样，都产生明亮的多态性条带，且目的片段大小一致，为128bp，则入选为具有可育胞质n的辣椒材料；其他材料苗期淘汰。该鉴定结果的准确性已在6个簇生朝天椒‘三樱椒’、‘樱田早红’等地方品种中得到验证，而且不限于所述地方品种。

入选簇生朝天椒可育胞质材料核基因筛选：

苗期采用步骤7的操作方法，虽然能鉴定地方品种的可育胞质（n），但不能依据外观表型区分三种细胞核育性基因型(msms)、(msms)、(msms)，需利用100%雄性不育系辣椒材料进行测交，根据杂交一代的育性分离比率，筛选鉴定核基因型。

（1）母本准备：100%雄性不育系，40目隔离网室内种植；

（2）父本准备：入选簇生朝天椒且具有可育胞质的地方品种，40目隔离网室内种植；

（3）花期杂交，将父本的花药点到母本开放的花的柱头上，同时做好标记。果实红熟期采收杂交果，连同果实采收标记。

（4）测交后代育性鉴定，将采收的杂交种在40目隔离网室内种植，进行花期育性鉴定

如果测交后代群体85%-100%雄性不育，则其父本为具有可育胞质品种，且其细胞核基因型为msms，入选保持系；

如果测交后代群体雄性不育：雄性可育=1:1，则其父本为具有可育胞质品种，其细胞核基因型为（msms），入选保持系。下一生长季需在入选的此保持系单株中自交，该保持系单株群体中有3种育性细胞核基因型（msms）、（msms）、（msms），但无法从表观性状区分；因此需选择优良单株，挂牌标记，与100%雄性不育系单株测交。母本为100%雄性不育系单株，父本为自交后代并单株挂牌标记的单株；淘汰杂交后代中的全部可育株系，入选杂交后代中的雄性不育率大于85%的不育株系，其对应的父本株系，则为最终入选的保持系，其细胞核基因型为（msms）；

如果测交后代85-100%雄性可育，则其父本为具有可育胞质的品种，其细胞核基因型为msms，淘汰。

根据育种目标选育同型保持系

根据以上步骤，可将簇生朝天椒地方品种转育为育性方面的雄性不育保持系，经济性状则需进一步根据育种目标进行回交转育，直至与地方品种优良综合性状相似。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110>青岛农业大学

<120>簇生朝天椒可育胞质的分子鉴定标记及保持系选育方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cgccatttctttccttcaat20

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gttcaccccttcggcttct19