一种用于HER2检测的dsDNA-AgNCs荧光探针及其构建方法和应用与流程

本发明涉及一种用于生物标志物her2检测的荧光探针，特别涉及一种利用杂交dna链合成的dsdna-agncs荧光探针以及利用鸟嘌呤(guanine,g)碱基序列靠近agncs增强agncs的荧光信号的原理来实现对her2特异性荧光检测的方法，属于生物传感技术领域。

背景技术

人表皮生长因子受体2(her2，又称neu或erbb2)是一种促进乳腺癌细胞生长的蛋白质。her2成为最常见的恶性肿瘤标志物(d.j.slamon,b.leyland-jones,s.shak,h.fuchs,v.paton,v.n.engl.j.med.2001,344,783-792.)。目前已确定的检测her2的方法有:显色原位杂交试验(cish)(s.kiyose,h.igarashi,k.nagura,t.kamo,k.kawane,h.mori,t.ozawa,m.maeda,k.konno,h.hoshino,h.konno,h.ogura,k.shinmura,n.hattori,h.sugimura,pathol.int.2012,62,728-734.)、荧光原位杂交(fish)(s.shah,b.chen,pathologresint.2011,903202-903217.)、免疫组织化学(ihc)、酶联免疫吸附试验(elisa)(c.b.moelans,r.a.d.weger,e.v.d.wall,p.j.v.diest,crit.rev.oncol.hematol.2011,80,380-392)、电化学(a)m.shamsipur,m.emami,l.farzin,r.saber,biosens.bioelectron.2018,103,54-61；b)c.shen,k.zeng,j.luo,x.li,m.yang,a.rasooly,anal.chem.2017,89,10264-10269.)等。然而，fish和ihc需要有侵入性的活检组织标本、专业的和专用的仪器，elisa技术非常可靠，但通常只对ng/ml范围敏感。电化学方法具有简单、快速、选择性高、灵敏度高等优点。然而，电化学方法一直以来都面临着稳定性和重复性问题，而且价格昂贵。这限制了这些方法的广泛应用。因此，建立一种简便、特异、灵敏、准确的her2检测方法具有重要意义。

近年来，agncs作为一种新型纳米材料，由于它比普通有机染料和量子点具有很大的优越性，包括高的光稳定性、亚纳米尺寸、稳定性、低毒性、强荧光发射性和良好的生物相容性等优点，而受到广泛关注。而且一些报道表明，agncs通过靠近富含g的dna序列，其荧光强度显著增强(j.li,x.zhong,h.zhang,x.c.le,j.j.zhu,anal.chem.2012，84,5170-5174.)。这一机制在许多生物分析方法中得到了广泛应用(a)x.liu,f.wang,r.aizen,o.yehezkeli,i.willner,j.am.chem.soc.2013，135,11832-11839；b)l.zhang,j.zhu,s.guo,t.li,j.li,e.wang,j.am.chem.soc.2013,135,2403-2406.)。

技术实现要素：

针对现有技术中检测her2的方法存在的缺陷，本发明的第一个目的是在于提供一种用于her2特异性荧光检测的dsdna-agncs荧光探针，该荧光探针在检测her2过程中具有信号强、特异性高、高灵敏度等优点。

本发明的第二个目的是在于提供一种步骤简单、低成本、条件温和的构建dsdna-agncs荧光探针的方法。

本发明的第三个目的是在于提供所述dsdna-agncs荧光探针在检测her2中的应用，表现出信号强、特异性高、高灵敏度等特点。

本发明提供了一种用于her2检测的dsdna-agncs荧光探针的构建方法，该方法是将dna1和dna2进行杂交形成dsdna，所述dsdna与银盐及还原剂通过原位还原反应，得到agncs探针；所述dna1为her2适配体dna片段；所述dna2包含与dna1互补的dna片段、合成agncs的模板dna片段以及富含g碱基的dna片段，且dna2的两端为互补的dna片段。

本发明的技术方案关键在于设计了两条特殊的dna链，dna1为短链，是her2的适配体，而dna2为长链，其包含与dna1互补的dna片段、合成agncs的模板dna片段以及富含g碱基的dna片段，且dna2的两端为互补的dna片段。先将dna2与dna1杂交，再利用agncs模板原位合成银纳米簇。生成的杂交双链部分为刚性结构，将dna2为长链支撑成链状结构，使得富含g碱基的dna片段远离银纳米簇，表现出较弱的荧光信号，而dna2链两端的互补dna片段也处于自由状态，无法特异性结合。当体系中出现her2时，dna2结合的dna1不断被her2特异性结合，从而使得dna2中间的刚性链段恢复自由单链，dna2两端的互补dna片段发生特异性结合，从而使得dna2包裹纳米银簇，富含g碱基的dna片段通过接近纳米银簇使得荧光信号增强，实现her2的荧光检测。

优选的方案，所述dna1序列号为：5’-ggggtgtggcgacg-3’。

优选的方案，所述dna2序列号为：5’-atattaccccaacccccgtcgccacaccccggggaaggggtaatat-3’。

本发明的dna1与dna2是自己设计序列，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。dna1序列中5’-ggggtgtggcgacg-3’片段为her2适配体片段，且利用dna2中富含c碱基的片段来合成agncs，dna2两端的5个碱基序列为互补dna片段，而dna2中富含g碱基的dna为与银纳米簇产生荧光信号增强的片段。

较优选的方案，dsdna与硝酸银及硼氢化钠在溶液体系中，于室温下反应1～3h，得到dsdna-agncs荧光探针。利用dsdna中的agncs模板dna片段通过原位还原合成银纳米簇。

较优选的方案，dsdna、agno3和nabh4的摩尔比为1:5～7:5～7。在本发明的技术方案中dsdna、agno3和nabh4的摩尔比为1:6:6时，即可合成较稳定的agncs。实验过程所用的dna均用磷酸缓冲溶液(10mm，ph＝7.4)配制，所述dna1与dna2等摩尔比混合，高温解旋冷却至室温使其杂交互补，加入agno3溶液在室温下震荡混匀15min，随后加入新鲜配制的nabh4，迅速震荡混匀1min，随后置于25℃恒温水浴箱中反应2h，即可检测其荧光信号，经实验证明此方法合成agncs仅需2h，整个dna1-agncs体系2h即可达到稳定。体系达到完全的稳定，即得到检测乳腺癌标志物的荧光探针。

本发明设计了4种dna2[dna2-1：8个互补(5’-atattattaccccaacccccgtcgccacaccccggggaaggggtaataatat-3’)；dna2-2：5个互补(5’-atattaccccaacccccgtcgccacaccccggggaaggggtaatat-3’)；dna2-3：5个拖尾(5’-atattattaccccaacccccgtcgccacaccccggggaaggggtaataatatttatt-3’)；dna2-4：5个g(5’-atattattaccccaacccccgtcgccacaccccaagggggtaataatat-3’)]，4种dna2都在accccaacccccgtcgccacaccccggggaaggggt的基础上进行改变，dna2-1在其基础上，两端设计了8个互补的碱基；dna2-2在其基础上，两端设计了5个互补的碱基；dna2-3在8个互补的基础上又增加了5个拖尾的碱基；dna2-4在8个互补的基础上由可以使银纳簇荧光信号增强的含有8个g碱基改为5个g碱基。在相同的实验条件下，用设计的4种dna2与dna1合成dsdna-agncs荧光探针，并对85fm的her2进行检测，结果表明8个互补与5个互补的荧光信号变化量差别不是太大，但明显高于含有5个拖尾以及含有5个g碱基的情况。含有5个拖尾的dna2可能影响其与dna1的杂交，以及her2蛋白与dna1的结合，5个g碱基由于g碱基的个数少于8个g碱基，所以当dsdna-agncs荧光探针与her2反应是产生的荧光信号变化量不如含有8个g碱基的dna2产生的荧光信号变化量大。所以我们优选两端含有5个互补碱基dna2-2的进行实验，获得的荧光探针具有更好的检测效果。

本发明提供了一种用于her2检测的dsdna-agncs荧光探针，其由上述构建方法得到。

本发明还提供了一种用于her2检测的dsdna-agncs荧光探针的应用，其作为her2检测的荧光探针应用。

优选的方案，将dsdna-agncs荧光探针与待测her2溶液进行反应后，检测荧光信号值，根据her2溶液浓度与荧光信号值的标准曲线计算出待测her2溶液中her2的浓度。本发明的dsdna-agncs荧光探针与待测her2溶液在25℃下反应5-30min。更优选为20min。

较优选的方案，将dsdna-agncs荧光探针与一系列不同浓度的标准her2溶液反应后，通过荧光检测荧光信号值，得到一系列荧光信号值，建立her2溶液浓度与荧光信号值的标准曲线。

本发明提供了一种基于agncs探针对her2特异性荧光检测的方法，其包括以下步骤：

1)dna1和dna2通过高温解旋，自然冷却至室温使两条dna链杂交互补形成dsdna；

2)在dsdna中依次加入agno3、nabh4，合成dsdna-agncs探针并检测其信号，可得到微弱的荧光信号；

3)所述dsdna-agncs荧光探针与一系列不同浓度的标准her2溶液反应后，进行荧光检测由于her2可与其适配体链dna1高特异性结合，使dna1与dna2-agncs解螺旋，设计的dna2-agncs两端几个有互补碱基片段，这就使dna2-agncs片段中的g碱基片段靠近agncs，可得到一系列荧光增强的信号,建立her2溶液浓度与荧光信号值的标准曲线；

4)将dsdna-agncs荧光探针与待测her2溶液反应后，进行荧光检测，得到的荧光信号值，并根据标准曲线，计算出待测her2溶液的浓度。

本发明的技术方案，通过两条具有互补片段的dna1和dna2构建agncs荧光探针，当dna1与dna2互补时，dna2中富含g碱基的片段远离agncs，dsdna-agncs荧光探针的荧光较弱，当加入her2后，由于dna1-her2-aptamer与her2特异性结合并自动将her2进行包裹形成复合物结构，而失去dna1的dna2构象发生改变，dna2两端的互补dna片段特异性结合，将银纳米簇包裹，使得富含g碱基的片段将靠近agncs，从而导致荧光增强，通过荧光信号增加来检测乳腺癌标志物的含量，利用该原理，实现了her2特异性荧光检测，检测限可达到1.406fm，并且在4.25fm～255fm范围之间，荧光强度随着浓度的增加呈线性增强，检测范围相对传统的方法较宽。

相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果：

本发明的技术方案通过设计两条特殊的dna链来实现dsdna-agncs荧光探针的构建，构建特殊的dsdna-agncs荧光探针，实现了对乳腺癌标志物her2特异性的荧光检测，具有信号强、特异性高、灵敏度高、检测浓度范围广等优点，有利于推广应用。

本发明的技术方案银纳米簇荧光探针通过dna核酸序列来稳定银纳米粒子，其稳定性好，具有稳定信号，且纳米簇的尺寸小，耐环境影响力强；并且应用核酸适体的高选择性和特异性的特点可以有效改善现有技术灵敏度低和检测限的问题，并且性质更稳定，操作更为简便，有利于推广应用。

本发明的dsdna-agncs荧光探针构建方法简单，成本低，条件温和，有利于推广应用。

附图说明

【图1】为通过荧光信号变化的方法检测标志物her2的实验方法的示意图。

【图2】为dsdna合成银纳米簇的激发和发射图谱。

【图3】为设计不同的dna2对her2检测的影响。

【图4】为对目标物和干扰物做的特异性检测图。

【图5】为在一定浓度范围内检测标志物her2含量的荧光图。

【图6】为一定浓度范围内检测标志物her2含量的线性关系图。

具体实施方式

以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而不是限制本发明权利要求的保护范围。

实施例1

银纳米簇的制备方法，步骤如下：

取40μldna1(50μm)和40μldna2(50μm)，并加入240μl磷酸缓冲液(20mm，ph7.0)混合混匀，高温解旋然后冷却至室温使其杂交互补。加入12μlagno3水溶液(1mm)室温下震荡混匀15min，然后加入12μl新鲜配制的nabh4(1mm)迅速混匀并移入25℃恒温水浴锅中反应2h，即可检测其荧光。dna1序列号为：5’-ggggtgtggcgacg-3’。dna2序列号为：5’-atattaccccaacccccgtcgccacaccccggggaaggggtaatat-3’。

her2的检测步骤如下：

向已经反应好了的dsdna-agncs溶液中加入不同浓度的her2，反应20min后检测其荧光信号。

特异性检测步骤如下：

分别向已经反应好了的dsdna-agncs溶液中加入可能存在于人血清中的hsa、igg和胰岛素作为在相同条件下测定her2的潜在干扰物(100pm)，20min后检测荧光信号。

建立坐标曲线步骤如下：

用磷酸缓冲液(10mm，ph7.4)配置不同浓度的her2溶液，每个溶液取相同体积加入到dsdna-agncs荧光探针溶液中，20min后检测其荧光信号，重复3组实验，用origin软件做出线性拟合曲线图。

从图2可以看出a为银纳米簇的激发图谱，激发波长在563nm处；b为发射图谱，发射波长在625nm处。

从图3可以看出设计出来的dna2碱基序列不同，在相同的实验条件下，分别合成dsdna-agncs荧光探针后，加入相同浓度的目标物her2,产生的荧光信号变化量不同。

从图4可以看出适配体只对乳腺癌标志物her2有特异性结合，实验干扰小。

从图5可以看出荧光信号随着her2浓度增大而增大。

从图6可以看出在一定的浓度范围内her2与其所对应的响应信号有一定的线性关系。