本发明涉及植物学
技术领域：
，尤其涉及一种苎麻的bn-mir52及其应用。
背景技术：
：镉是生物毒性最强的重金属元素，其不仅影响土壤生态结构和功能，而且会抑制作物的生长发育，降低产量和品质，并通过食物链进入人体，引发各种疾病，最终危害人体健康。我国受镉污染耕地面积近1.33万公顷，污染范围涉及11个省25个地区，且污染程度有逐年加重的趋势。通过种植能吸收镉的作物，降低土壤中镉的含量，是目前处理镉污染土壤最为经济和有效的方法。苎麻是古老的天然纤维作物，也是我国的特色作物，栽培面积和总产量均占世界的90％以上。苎麻对镉具有高耐高吸收作用，其具有适应能力强、生长迅速、繁殖能力强、根系发达、生物产量大等优点，在很多方面弥补了现有超积累植物植株矮小、生长速度慢、受气候影响大、很难实现实际应用价值等不足，具有很好的生态效益，是修复镉污染土壤的理想植物。目前，有关于筛选不同品种的苎麻来提高苎麻对镉的吸收，如专利201110025715.9中通过苎麻品种筛选方法，将苎麻品种分为高耐低吸收型、高耐高吸收型、低耐低吸收型和低耐高吸收型，指导麻农对不同镉污染程度的土壤种植不同的品种。还有加入一些药剂，与苎麻协同作用，从而提高苎麻对镉的吸收，如专利201410718494.7中，在种植苎麻过程中，施加生物可降螯合剂edds，从而提高苎麻对镉的吸收。microrna(mirna)是一类内源性的、19-24个碱基长度的小分子非编码rna，其通过碱基互补调控靶基因的表达，参与调控植物生长发育及多种非生物与生物胁迫。但是目前提高苎麻对镉的吸收方法，都是辅助性的提高，未涉及到苎麻吸镉分子机制理论的研究。技术实现要素：本发明的目的是提供一种苎麻的bn-mir52及其应用，可控制该基因的上调表达，提高苎麻对镉的吸收。本发明这种苎麻的bn-mir52，其核苷酸序列如序列1所示。所述的苎麻的bn-mir52的前体序列bn-mir52，其核苷酸序列如序列2所示。编码所述的前体bn-mir52的dna序列，其核苷酸序列如序列3所示。所述苎麻的bn-mir52调控的靶基因为comp46152_c0，comp14825_c0，和comp45314_c0，其核苷酸序列分别对应为序列4、序列5和序列6所示。所述的苎麻的bn-mir52在提高苎麻对镉吸收中的应用。所述的苎麻的bn-mir52在培育镉超富集苎麻品种中的应用。其中bn-mir52中bn为苎麻的拉丁文boehmerianivea的简写，mir代表mirna。本发明的有益效果：本发明筛选了一种苎麻的新mirna(bn-mir52)及其前提序列，该bn-mir52调控的靶基因为comp46152_c0，comp14825_c0和comp45314_c0，这些靶基因分别编码磷脂酰丝氨酸脱羧酶原酶3(comp46152_c0)、钙网蛋白-3(comp14825_c0)、atp依赖性锌金属蛋白酶ftsh9。磷脂酰丝氨酸脱羧酶原酶与磷脂酰丝氨酸合成有关，磷脂酰丝氨酸是细胞膜的重要组分，细胞膜的完整性可影响镉离子的吸收。钙网蛋白-3可维持植物体内钙离子平衡，镉离子可通过钙离子通道进入细胞内，简单来说就是该蛋白与镉的吸收有关。本发明通过荧光定量pcr等方法，验证了在正常和镉胁迫条件下bn-mir52在苎麻中的表达差异，得出苎麻植株吸镉量与bn-mir52表达量呈正比关系的结论，证明本发明bn-mir52的上调表达可以促进苎麻对镉的吸收，且得出了bn-mir52与其靶基因comp46152_c0，comp14825_c0和comp45314_c0的表达量均呈反比关系的结论，证明bn-mir52通过调节其靶基因的表达来调控苎麻吸镉量。本发明在镉超富集苎麻品种培育中具有潜在应用价值。附图说明图1为bn-mir52前体bn-mir52的二级结构。图2为镉胁迫处理下苎麻植株不同部位吸镉量。图3为镉胁迫条件下bn-mir52在苎麻叶片中的表达量变化情况。图4为镉胁迫条件下bn-mir52的靶基因comp46152_c0，comp14825_c0，comp45314_c0在苎麻叶片中的表达量变化情况。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的阐述和说明，但本发明所保护范围不限于此。下列实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径中获得。实施例1mirna的筛选和鉴定1.植物材料和样品的准备处理组：取苎麻中苎1号品种嫩梢(10-15cm)，经多菌灵消毒10s，扦插于水循环装置，置于人工气候温室中培养，待根长至10cm时用10mg/l浓度的氯化镉处理，处理20天后采集完全展开的苎麻叶片，液氮速冻后，-80℃冷冻备用。对照组：对照组：将处理组中的10mg/l浓度的氯化镉换成水，其余实验条件不变，作为对照组。2.苎麻mirna的高通量测序rna提取：用液氮将叶片研磨成粉末后，采用北京艾德莱生物科技有限公司生产的easyspin植物microrna快速提取试剂盒提取rna；用微量紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测rna质量，rnaod60/od80在1.8～2.2之间，电泳显示28s和18s条带清晰，无降解，表明rna质量合格；用agilent2100bioanalyzer检测rna的完整性，完整性大于8.0，表明rna完整性高。文库构建：检验合格的rna用于构建mirna文库，mirna文库的构建按照illuminasamplesreprationprotocol文库构建方法进行，然后采用hiseq2500高通量测序，委托百迈客生物科技有限公司完成。3.mirna的鉴定hiseq2500高通量测序获得rawreads数据后，对所获得的原始数据序列进行去街头、去低质量、去未知碱基n含量大于等于10％、去污染、去载体序列、去短于18或长于30个核苷酸的序列等处理，得到可用于后续分析的干净序列(cleanreads)。利用bowtie软件，将cleanreads分别与silva数据库、gtrnadb数据库、rfam数据库和repbase数据库进行序列比对，过滤核糖体rna(rrna)、转运rna(trna)、核内小rna(snrna)、核仁小rna(snorna)等ncrna以及重复序列，获得包含mirna的unannotatedreads。利用mirdeep2软件将unannotatedreads与指定的苎麻转录组进行序列比对，获得mappedreads。利用mirdeep2软件将18-30nt的核苷酸序列比对到mirbase数据库中特定物种上，鉴定该物种已知的mirna；过滤获得的未比对到参考基因组，通过碱基数目延伸，进行mirna结构预测，进行二级结构分析。本实施例中的二级结构如图1所示，由图1可知，其形成类似mirna前体的稳定茎环结构，说明该序列可鉴定为苎麻新mirna。通过该方法，鉴定出受镉胁迫诱导的苎麻新mirna，命名为bn-mir52，其成熟序列为：cgaaaucgucgucggcgacg(如序列1所示)，其前体序列如序列2所示。4.bn-mir52差异表达分析利用deseq软件对来自正常和镉胁迫处理文库的mirna序列进行比对分析，利用|log2(foldchange)|≥1和benjamini-hochberg错误发现率校正p-值<0.01作为筛选条件，进行样品组间的差异表达分析。结果表明，处理组在镉胁迫下，bn-mir52在苎麻叶片中上调表达。5.bn-mir52靶基因的预测用targetfinder软件对bn-mir52的靶基因进行预测，并通过生物信息学对所获得的靶基因进行注释，利用预测到的靶基因序列比对苎麻基因组，获得靶基因的基因组序列，该靶基因序列共有3个为comp46152_c0，comp14825_c0和comp45314_c0，其对应的核苷酸序列分别为序列4、序列5和序列6。实施例2bn-mir52的表达量分析1.植物材料和样品的准备同实施例1中1。2.bn-mir52的表达量分析以提取的合格的rna为样品，采用specificstem-looprtprimer第三代试剂盒反转录成cdna第一链，以cdna为模板，采用试剂盒中通用的反向引物和正向引物f1对进行q-pcr检测bn-mir52的表达量，采用f2和r2组成的引物对进行q-pcr检测18srrna(内参基因)，计算bn-mir52的相对表达量。具体操作步骤如下：1)rna提取：取-80℃保存的样品，液氮研磨成粉，取粉末约100mg，迅速加入1ml冷藏的trizol，匀浆仪匀浆2min；按200μl氯仿/1mltrizol的比例加入氯仿，迅速混匀15s，在室温放置2-3min；在2℃-8℃环境中，12000g离心15min，提取上层水相600μl；在提取的水相中按1:1的比例加入异丙醇，轻轻吹打混匀，室温放置10min；2℃-8℃环境12000g离心10min，rna沉淀于管底，将上层废液吸出(尽量将液体吸干净)；按1ml75％酒精/1mltrizol的比例加入-20℃保存的75％冷酒精，颠倒3次悬浮沉淀，在2℃-8℃环境7500g离心5min，弃去上层废液，空气中干燥5-10min；加入50μlrnasefree的水溶解rna，测定浓度备用。2)反转录：以提取的rna为模板，采用specificstem-looprtprimer第三代试剂盒反转录成cdna第一链，反转录体系如下：项目用量totalrna～200ngspecificstem-looprtprimermix2μl5xm-mlvbuffer4μl25mmdntp0.4μlrnaseinhibitor0.5μl200u/μlm-mlv0.5μlrnasefreeh2oupto20μl冰上5min，16℃30min，42℃30min，85℃5min，4℃1s。18srrna反转录：配制反应液：总rna原液～200ng100μmoligo(dt)1μlrnasefreeh2o至12μl70℃10min，迅速冰上冷却2min反转录体系：项目用量上述反应液12μl5xm-mlvbuffer4μl25mmdntp0.4μlrnaseinhibitor0.5μl200u/μlm-mlv0.5μlrnasefreeh2oupto20μl42℃60min，85℃5min，4℃1s，-20℃保存获得的cdna。3)q-pcr实验正向引物f1：cgaaatcgtcgtcggcgacg(序列7)；反向引物r1：试剂盒通用引物；正向引物f2：atgataactcgacggatcgc(序列8)；反向引物r2：cttggatgtggtagccgttt(序列9)，在冰上配制pcr反应体系：项目用量cdna0.2μl2×sybrmix5μl0.5μmeachprimer4μlddh2o补足10μl充分混匀pcr反应液，吸取反应液至每个pcr反应孔中，封好热封膜，短暂离心，确保所有试剂都甩至反应管底部。在rochelightcycler480iipcr仪上检测目的mirna，pcr反应程序如下：循环数步骤温度时间1预变性/酶活化94℃10min45变性82℃20sec退火/延伸60℃20sec熔解曲线分析：18srrna反应程序：熔解曲线分析同目标mirna。以内参基因做参考，计算bn-mir52的相对表达量。本实施例中bn-mir52的相对表达量见图3，结果表明，处理组在镉胁迫处理下，bn-mir52在苎麻叶片中相对于对照(未经镉胁迫处理的苎麻)上调表达，与测序分析的表达量表达趋势一致。实施例3bn-mir52的靶基因comp46152_c0，comp14825_c0，comp45314_c0的表达量分析1.植物材料和样品的准备同实施例1中1。2.bn-mir52靶基因的表达量分析按照实施例2中18srrna反转录的方法准备cdna样品，利用靶基因特异引物对(comp46152_c0，正向引物f3：tccaagtttggcatcttaacg(序列10)和反向引物f3：gaaatcgaccatgacctcct(序列11)；comp14825_c0，正向引物f4：gctgggcctccttgttaaat(序列12)和反向引物r4：aaccctcattttgcatctcg(序列13)；comp45314_c0，正向引物f5：cagacatctggagcacgaaa(序列14)和反向引物r5：tctacgcccagtggtttaca(序列15))扩增靶基因，以18srrna为内参基因(正向引物f6：tgacggagaattagggttcga(序列16)；反向引物f6：ccgtgtcaggattgggtaattt(序列17))，在rochelightcycler480iipcr仪上检测靶基因的表达量，pcr反应体系及反应程序同实施例2中18srrna。靶基因的表达量如图4所示，结果表明，处理组在镉胁迫处理下，bn-mir52的靶基因comp46152_c0，comp14825_c0，comp45314_c0表达量与bn-mir52的表达量呈反比关系，说明comp46152_c0，comp14825_c0，comp45314_c0受bn-mir52调控，从而调控苎麻对镉的吸收。实施例4镉胁迫下苎麻植株吸镉量分析处理组：苎麻中苎1号品种嫩梢(10-15cm)，经多菌灵消毒10s，扦插于水循环装置，置于人工气候温室中培养，待根长至10cm时用10mg/l浓度的氯化镉处理，处理20天后分别收获根、茎、叶，烘干后磨粉，利用solaarm6原子吸收光谱仪测定其镉含量，结果如图2所示。从图2可知，苎麻的根中镉含量较多，其次为茎，最少是叶中。对照组：对照组将氯化镉处理换成水处理，其他条件与处理组一致。对照组的根茎叶镉含量很少，采用原子吸收的方法未能检测到镉的存在。序列表<110>中国农业科学院麻类研究所<120>一种苎麻的bn-mir52及其应用<160>17<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>rna<213>苎麻()<400>1cgaaaucgucgucggcgacg20<210>2<211>110<212>rna<213>苎麻()<400>2ugucuaaggucagcaacaacauccaaaucgacgucguucgggacggucgccggcaaccga60uuucgaucuucgaaaucgucgucggcgacgucguuucguugaaaaucggc110<210>3<211>110<212>dna<213>苎麻()<400>3tgtctaaggtcagcaacaacatccaaatcgacgtcgttcgggacggtcgccggcaaccga60tttcgatcttcgaaatcgtcgtcggcgacgtcgtttcgttgaaaatcggc110<210>4<211>541<212>dna<213>苎麻()<400>4ggcagtttgaccgactgttaaaattaattatgtaattaattttgtaattagttattatac60aatgatcaattactgcaatgtcactatagtccataattgttatttattcagaaaatattc120aacaagacaaaacactcgttgcttgttctattctaaattgccaaaagtatccattgaaca180agagaagattagaacatgaaaaacacgtgctttaacaaaatcgaaaatatgagccttact240tttccaagaaaatatccaaactcaaaacacttcgattattctcacataatttacacgcca300gatcaaatctagcctatatatgcaaattataaccagagagaaatagtatccaggcaaatt360ttgacttttaactaaacaagcctatgattaccttagtcatgtataacacagttgtccaag420tttggcatcttaacgtcagaggctttttttgacacgcctaacttcattccaactgatacc480aaagtctccagtgacctggcactgttttctaggaggtcatggtcgatttcaattgaaccc540t541<210>5<211>654<212>dna<213>苎麻()<400>5tggatgtacatgatccccctcggactcatcgtcatgaacgccataactcaagcgatgaat60ctgccagaggaacaagctgccggccaaggtcagccaggcgcagcccagcgtgcgggtccc120cctgctgctgtgaggagaagatagttttttctcttgtttccttcttaatggaagttagta180gccagtgactaaagaatggaggttttagcttttgacactcggctgtatcattatttattc240ccattggaaaacatatcaaaattttgtaaatcgctgggcctccttgttaaattactgata300gggtgtgtttatggcagtaactggaccaaagcatttgaaaatttagtgccaacatttttt360tttttttggcgagatgcaaaatgagggtttaattttatgagtttatttgaacaattaaac420atatattctttaggtagtaactgcactgttttaatgaaaaattttacattacttgctatc480ccacaaaggaagcttttacagaaacacattcataagagagaattacaccggcaagcttgg540aggaaagtttgccagggattatgcaacaaggagacagagtaacactgacatatttgaatt600ttgtaaacgtaacggcgaggtgaacagaacccgggaacgtcatcagagctcatc654<210>6<211>661<212>dna<213>苎麻()<400>6ttcttgctcacgccctggccttcgctcgccttcgcctcgctcttctccccggaatcaccg60tcctggccgctcgctgagaccctaaccctcctcagcccgccattgtcgctcctcagccga120cctctccagagcccgaattcgtcgggaatcctccgaccaccgctctgcccgtacaccgag180accgccgggaaaggcaccaccgagctctgaaccagacatctggagcacgaaaccctagac240tgcgcgcgaacgaaccccaatccacgccaatcgcgagaatcggacttggaattcacacaa300agcctgttgtaaaccactgggcgtagatactcgatcgacgtcatagccgaagctcaacaa360acatgtatatacacacatatacaactacttgtctatatttgtgtatctatctgtgtatag420atgtaaattattcgtattattggattataatataaaattgcgtttaagcaactttgaaaa480gagtatcgatagagctgagaagcttaaaaaacatctctctcagagaaagagagttgttaa540aggaagagaatttaacttgaagtacggaccgttggatttggcaggagtacgggatcttaa600ccgtcgactttccctttttgttttagcgttatcttataacttctctctcgctccgcgctc660g661<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列()<400>7cgaaatcgtcgtcggcgacg20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列()<400>8atgataactcgacggatcgc20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列()<400>9cttggatgtggtagccgttt20<210>10<211>21<212>dna<213>人工序列()<400>10tccaagtttggcatcttaacg21<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列()<400>11gaaatcgaccatgacctcct20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列()<400>12gctgggcctccttgttaaat20<210>13<211>20<212>dna<213>人工序列()<400>13aaccctcattttgcatctcg20<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列()<400>14cagacatctggagcacgaaa20<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列()<400>15tctacgcccagtggtttaca20<210>16<211>21<212>dna<213>人工序列()<400>16tgacggagaattagggttcga21<210>17<211>22<212>dna<213>人工序列()<400>17ccgtgtcaggattgggtaattt22当前第1页12