抗GCC的核酸、其制备方法、具有该核酸的免疫细胞及其应用与流程

本发明涉及基因技术领域，尤其涉及一种抗gcc的核酸、其制备方法、具有该核酸的免疫细胞及其应用。

背景技术

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，占全球所有肿瘤的10％，在全世界恶性肿瘤的发病率中占第3位。手术虽为有效的治疗方法，但仍有近1/3的结直肠癌患者在术后出现复发和远处转移，5年生存率不足50％。目前，相关研究也表明结直肠发病具有逐年上升和年轻化趋势，严重影响危害人类健康。因此，早期发现、早期治疗是提高结直肠癌疗效、改善预后和提高生存率的关键。

在恶性肿瘤治疗方法中，使用手术、放化疗和靶向治疗的治愈率以及预后都很差，对患者造成极大的伤害，而嵌合抗原受体t细胞(chimericantigenreceptortcells，car-t)过继性免疫治疗策略克服了以上治疗方法的缺点，给癌症治愈带来了希望。car-t治疗的原理如下：通过基因工程修饰技术，使体外分离收集的癌症患者的t细胞表达识别肿瘤特异性抗原的嵌合抗原受体(car)，并在体外大量扩增car-t细胞后将其输回癌症患者体内，达到清除肿瘤的目的。相关研究表明car-t细胞疗法在急性淋巴细胞白血病(all)和淋巴瘤等恶性肿瘤治疗中取得了良好效果，因此，car-t技术具有较大的应用前景。

因此，开发一种抗gcc的核酸、其制备方法、具有该核酸的免疫细胞及其应用，不但具有迫切的研究价值，也具有良好的经济效益和工业应用潜力，这正是本发明得以完成的动力所在和基础。

技术实现要素：

为了克服上述所指出的现有技术的缺陷，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，从而完成了本发明。

具体而言，本发明所要解决的技术问题是：提供抗gcc的核酸、其制备方法、具有该核酸的免疫细胞及其应用，以提高免疫细胞的针对性，减少对非肿瘤细胞的伤害，提高有效性、安全性。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

第一方面，本发明提供了抗gcc的核酸，其至少包含leader核苷酸序列、gcc单链抗体核酸人工序列、cd8的铰链区核苷酸序列、跨膜-刺激结构域核苷酸序列、cd3ζ信号传导区核苷酸序列、自裂解肽t2a核苷酸序列、趋化因子il7核苷酸序列及趋化因子ccl19核苷酸序列。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述跨膜-刺激结构域核苷酸序列选自cd8、cd27、cd28、cd137(即4-1bb)、cd134(即ox40)、icos分子的全部或部分dna片段。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述抗gcc的核酸，其包括依序排列的

如seqidno.2所述的leader核苷酸序列；

如seqidno.3所述的gcc单链抗体核酸人工序列；

如seqidno.4所述的cd8的铰链区核苷酸序列；

跨膜-刺激结构域核苷酸序列；

如seqidno.6所述的4-1bb胞内区核酸序列；

如seqidno.7所述的cd3ζ信号传导区核苷酸序列；

如seqidno.8所述的自裂解肽t2a核酸人工序列；

如seqidno.9所述的趋化因子il7核苷酸序列；

如seqidno.10所述的趋化因子ccl19核苷酸序。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述跨膜-刺激结构域核苷酸序列采用如seqidno.5所述的cd8跨膜区核酸人工序列。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述抗gcc的核酸的核苷酸序列如seqidno.1所述。

第二方面，本发明提供了该核酸的制备方法，包括如下步骤：

(1)分别按leader核苷酸序列、gcc单链抗体核酸人工序列、cd8的铰链区核苷酸序列、跨膜-刺激结构域核苷酸序列、cd3ζ信号传导区核苷酸序列、自裂解肽t2a核苷酸序列、趋化因子il7核苷酸序列、自裂解肽t2a核苷酸序列及趋化因子ccl19核苷酸序列合成其整个表达框并插入标准载体puc上，得到puc-gcc-car；

(2)将puc-gcc-car进行双酶切，利用琼胶电泳将gcc-cardna片段琼胶部位切下，利用dnaextractionkit溶胶液处理、过df柱弃滤液、漂洗df柱、空离、洗脱df柱、收集离心物，得到纯化的gcc-cardna片段。

第三方面，本发明提供了免疫细胞，包含具有如上所述核酸的质粒。

在本发明中，作为一种优选的技术方案，所述免疫细胞选自自体的或转基因的t细胞、nk细胞、细胞毒性t淋巴细胞或调节t细胞、记忆性t细胞、双特异性t细胞、cik细胞。

在本发明中，作为一种优选的技术方案，所述质粒是将融合基因片段gcc-cardna插入慢病毒表达载体plent-c-gfp得到的plent-gcc-car质粒。

在本发明中，作为一种优选的技术方案，所述质粒采用如下制备方法制备得到：将上述纯化的gcc-cardna片段和线性化的plent-c-gfpdna片段在连接体系为：10×buffer：1μl；t4连接酶：1μl；gcc-cardna片段：4μl；线性化的plent-c-gfpdna片段：4μl，连接形成。

在本发明中，作为一种优选的技术方案，所述免疫细胞的采用包括如下步骤的方法制备得到：

首先将上述的plent-gcc-car质粒进行慢病毒包装，然后利用重组慢病毒感染免疫细胞。

第四方面，本发明提供了抗gcc核酸的应用，是指该基因在制备治疗实体瘤的药物中能够得以应用。所述药物形式包括但不限于试剂盒。

在本发明中，作为一种优选的技术方案，所述实体瘤包括结直肠癌、胃癌、食道癌。

在本发明中，作为一种优选的技术方案，该试剂盒，包括

(1)获得如上所述的稳定表达gcc-car的载体；

(2)载体稀释液。

采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：

本发明中，鸟苷酸环化酶c(guanylylcyclasec，gcc)是一种肠道组织特异性表达的多肽，属于受体鸟苷酸环化酶家族成员，是n-连接糖蛋白受体。gcc包括胞外n末端受体结合区、激酶同源调节区、c末端催化区及羧基末端四个部分。gcc具有以下功能:调节na+动态平衡；刺激cl-分泌/抑制na+吸收，调节肠道功能；调节肠道ph值，促进食物消化吸收；通过开放cng通路和抑制ca2+和na+交换,调节肠上皮细胞的转变和增殖；分泌黏液、水，清除肠、肺等组织中的病原菌。gcc亦可表达于结直肠癌细胞株、原发性和转移性结直肠癌，调节肠上皮细胞转变，抑制结直肠癌细胞增殖和dna合成。体内gcc抗体可能通过环磷酸鸟嘌呤(cgmp)依赖的相关机制来调节小肠黏膜上皮细胞的增殖和分化(见图1)。另外，研究发现在食管和胃腺癌中也可见gcc高表达。因此，可以利用gcc作为治疗结肠癌、胃癌或食道癌的car-t的靶点，为临床诊治提供有效的治疗方法。但是，由于单纯的利用gcc作为治疗结肠癌、胃癌或食道癌的car-t的靶点，其免疫细胞容易对非肿瘤细胞的造成伤害。

因此，发明人经过反复的筛选试验，付出创造性的劳动，将本发明所述的共表达免疫加强因子il7和ccl19抗gcc的car-t在常规car-t基础上进行改造，使常规car-t可以表达il7和ccl19两种趋化因子，特异性识别结肠癌细胞表面gcc肿瘤相关抗原。所述白介素-7(interleukin-7,il-7)是一种细胞因子，由胸腺细胞、骨髓基质细胞、小肠上皮细胞等分泌，在人体免疫系统的正常发育和维持正常免疫功能中起重要作用，在促进t细胞增殖的同时可维持t细胞稳定。所述ccl19是趋化因子cc家族成员，它的特异性受体ccr7是一种分布于细胞表面的7次跨膜蛋白。ccl19具有募集外周t细胞及树突状细胞进入淋巴组织的功能，可抑制人结直肠癌细胞株sw620细胞增殖、迁移和侵袭能力，具有抑制结直肠癌的作用，除此之外ccl19还可以有效抑制肺癌、卵巢癌、纤维肉瘤等实体肿瘤。

本发明在第三代car-t技术的基础上，首次提出将gcc作为结直肠癌、胃癌、食道癌等恶性肿瘤表达量高的gcc作为靶点，制备了一共同表达免疫加强因子il7和ccl19抗gcc嵌合抗原受体的免疫细胞，该细胞即可特异性杀死表达gcc靶细胞，又能减少对非肿瘤细胞的伤害，有效性更好、安全性更高。

本发明构造的新一代car-t载体，加入了免疫加强因子il7和ccl19，其中il7可促进t细胞增殖并维持t细胞稳定，ccl19可以募集外周t细胞及树突状细胞进入淋巴组织，因此，本发明构造的7×19car-t细胞增殖和杀伤能力比普通的car-t细胞提高2倍。而且本发明所述的趋化因子可被用于任何car技术改造的免疫细胞，极大的提高car技术的临床有效性。

附图说明

图1gcc结构示意图。

图2共表达免疫加强因子il7和ccl19anti-gcc的car模块图。

图3流式细胞术检测抗7×19gcc-car载体在t细胞表面的表达情况。

图4cfse标记的7×19car-t细胞和car-t细胞数量比较图。

图5结直肠癌鼠模型t淋巴细胞治疗后肿瘤大小变化图。

图6为本发明所述的leader-scfv(gcc)-cd8-4-1bb-cd3ζ-t2a-il7-t2a-ccl19重组基因设计图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。

实施例1

抗gcc的核酸，其至少包含leader核苷酸序列、gcc单链抗体核酸人工序列、cd8的铰链区核苷酸序列、跨膜-刺激结构域核苷酸序列、cd3ζ信号传导区核苷酸序列、自裂解肽t2a核苷酸序列、趋化因子il7核苷酸序列及趋化因子ccl19核苷酸序列。其中，跨膜-刺激结构域核苷酸序列选自cd8、cd27、cd28、cd137(即4-1bb)、cd134(即ox40)、icos分子的全部或部分dna片段。

本实施例中，所述抗gcc的核酸，其包括依序排列的cd8leader核酸人工序列(seqidno.2)、gcc单链抗体核酸人工序列(seqidno.3)、cd8铰链区核酸人工序列(seqidno.4)、cd8跨膜区核酸人工序列(seqidno.5)、4-1bb共刺激区核酸人工序列(seqidno.6)、cd3ζ信号区传导区核酸人工序列(seqidno.7)、自裂解肽t2a核酸人工序列(seqidno.8)、趋化因子il7核酸人工序列(seqidno.9)、自裂解肽t2a核酸人工序列(seqidno.8)、趋化因子ccl19核酸人工序列(seqidno.10)。

实施例2

治疗gcc的核酸的制备方法，包括如下步骤：

(1)分别按leader核酸人工序列、gcc单链抗体核酸人工序列、cd8铰链区核酸人工序列、cd8跨膜区核酸人工序列、4-1bb共刺激区核酸人工序列、cd3ζ信号传导区核酸人工序列、自裂解肽t2a核酸人工序列、il7核酸人工序列、自裂解肽t2a核酸人工序列、ccl19核酸人工序列合成其整个表达框并插入标准载体puc上，得到puc-gcc-car；

(2)将puc-gcc-car进行双酶切，利用琼胶电泳将gcc-cardna片段琼胶部位切下，利用dnaextractionkit溶胶液处理、过df柱弃滤液、漂洗df柱、空离、洗脱df柱、收集离心物，得到纯化的gcc-cardna片段。

本实施例中，更详细的步骤为：

(1)分别按leader核酸人工序列、gcc单链抗体核酸人工序列、cd8铰链区核酸人工序列、cd8跨膜区核酸人工序列、4-1bb共刺激区核酸人工序列、cd3ζ信号传导区核酸人工序列、自裂解肽t2a核酸人工序列、il7核酸人工序列、自裂解肽t2a核酸人工序列、ccl19核酸人工序列委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框并插入标准载体puc上，因此命名为puc-gcc-car；

(2)将puc-gcc-car载体进行fastdigestasisi(购自thermofisher公司)和fastdigestnoti(购自thermofisher公司)双酶切，37℃，酶切20min。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；dna6μg；asisi酶：3μl；noti酶：3μl；去离子水补足体积。利用琼胶电泳将把含有gcc-cardna片段的琼胶部位切下，放在两个离心管中。采用dnaextractionkit(购自thermofisher公司)将dna从琼胶中溶出并浓缩，首先往上述离心管加入500μldfbuffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入dfcolumn，并套上collectiontube(收集过滤液)。8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500μlwashbuffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将dfcolumn转移至上另一干净的微量离心管，加入25μlelutionbuffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的gcc-cardna片段。

实施例3

含有如实施例2所述基因的质粒，所述质粒是将融合基因片段gcc-cardna插入慢病毒表达载体plent-c-gfp得到的质粒，命名为7×19plent-gcc-car。所述质粒采用如下制备方法制备得到：将上述纯化的gcc-cardna片段和线性化的plent-c-gfpdna片段在连接体系为：10×buffer：1μl；t4连接酶：1μl；gcc-cardna片段：4μl；线性化的plent-c-gfpdna片段：4μl，连接形成。

本实施例中，该质粒采用如下的方法制备得到：

分别按leader核酸人工序列、gcc单链抗体核酸人工序列、cd8铰链区核酸人工序列、cd8跨膜区核酸人工序列、4-1bb共刺激区核酸人工序列、cd3ζ信号传导区核酸人工序列、自裂解肽t2a核酸人工序列、il7核酸人工序列、自裂解肽t2a核酸人工序列、ccl19核酸人工序列委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框并插入标准载体puc上，因此命名为puc-gcc-car，同时将puc-gcc-car和plent-c-gfp载体进行fastdigestasisi(购自thermofisher公司)和fastdigestnoti(购自thermofisher公司)双酶切，37℃，酶切20min。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；dna6μg；asisi酶：3μl；noti酶：3μl；去离子水补足体积。利用琼胶电泳将分别把含有gcc-cardna片段和线性化的plent-c-gfpdna片段的琼胶部位切下，放在两个离心管中。采用dnaextractionkit(购自thermofisher公司)将dna从琼胶中溶出并浓缩，首先往上述离心管加入500μldfbuffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入dfcolumn，并套上collectiontube(收集过滤液)。8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500μlwashbuffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将dfcolumn转移至上另一干净的微量离心管，加入25μlelutionbuffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的gcc-cardna片段和线性化的plent-c-gfpdna片段。

将上述两种dna片段在16℃进行过夜连接形成7×19plent-gcc-car质粒。连接体系为：10×buffer：1μl；t4连接酶：1μl；gcc-cardna：4μl；线性化的plent-c-gfpdna：4μl。

实施例4

质粒的纯化：将上述7×19plent-gcc-car转化到e.coli(dh5α)。具体步骤如下：将质粒和感受态细胞混匀在冰上孵育半小时，再42度热激90秒，再冰上放置2min，最后加液体lb培养基缓摇1个小时左右再3000rpm离心5min，将100μl菌液涂布在含有氨苄lb固体平板。次日挑取单菌落进行过夜培养，采用质粒提取纯化试剂盒(购自qiagen公司)提取plent-gcc-car质粒，具体步骤如下：(1)取1.5ml菌液室温10000×g离心1min。(2)去上清，加250μl溶液ⅰ(含rnasea)，涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。(3)加入250μl溶液ⅱ，温和颠倒离心管4～6次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min。(4)加350μl溶液ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀，室温10000×g离心10min。(5)特别小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000×g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱。(6)弃滤过液，加500μlbufferhbc，10000×g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证dna的纯度。(7)弃滤过液，再用100％乙醇稀释的750μlwashbuffer清洗吸收柱，10000×g离心1min。(8)再加750μlwashbuffer清洗吸收柱。(9)必须将吸收柱10000×g离心2min确保乙醇被去除。(10)将吸收柱放入干净1.5ml离心管，加50-100μl(取决于需要的终浓度)无菌去离子水或te缓冲液在滤膜上，10000×g离心5min，收集质粒dna。(11)和预知浓度dna样品(marker)一起做琼脂糖凝胶电泳，对比结果，得出7×19plent-gcc-car质粒浓度为360ng/μl。

实施例5

免疫细胞，包含具有如上所述核酸的质粒。本实施例，首先将如实施例4纯化的7×19plent-gcc-car质粒进行慢病毒包装，然后利用重组慢病毒感染免疫细胞。所述免疫细胞选自自体的或转基因的t细胞、nk细胞、细胞毒性t淋巴细胞或调节t细胞、记忆性t细胞、双特异性t细胞、cik细胞。

详细的步骤为：

(1)慢病毒包装及滴度检测

将慢病毒包装细胞系293t接种于含有dmem+10％fbs10cm培养皿中，37℃，5％co2条件下培养，贴壁率为70％-80％后进行转染。将实施例1中的重组质粒(约10μg)和空载质粒(约10μg)分别与慢病毒包装质粒采用磷酸钙转染法共转染293t细胞，轻轻混匀，置于37℃、5％co2培养箱中培养12h，加入含10％fbs的dmem液体培养基8ml，继续培养至48小时。48h后在倒置荧光显微镜下观察到细胞内有绿色荧光蛋白表达。72h后，收集上清，除去细胞碎片，收获病毒后进行浓缩，获得浓缩过的gcc-car病毒液，-70℃低温冰箱中保存备用。根据lenti-x^tmgostix^tm试剂盒(北京华夏远洋科技有限公司产品)测定病毒滴度，结果表明，重组慢病毒的滴度3.12×10⁶pfu/ml。

实施例3：慢病毒感染t细胞

(2)t细胞的制备

取50ml患者自体外周血，用tbd样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)，分离外周血单个核细胞。用含有1000iu/ml的重组干扰素α2a(购自沈阳三生制药)的培养基(购自corning公司，88-551-cm)诱导培养24小时后，加入1000iu/ml的重组白细胞介素2(购自沈阳三生制药)、50ng/ml的okt-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养24小时。每隔两天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测t细胞中的cd3⁺、cd56⁺的阳性表达率(cd3-fitc，cd16/cd56-pe抗体购自beckman公司，a07735)。cd3⁺阳性率>80％，cd3⁺cd56⁺双阳性率>20％，视为t细胞诱导成功，并留取该细胞待病毒感染。

(3)慢病毒感染t细胞及car-t细胞的扩增培养

t细胞经活化后，取出1×10⁶个细胞，加入浓缩过的gcc-car病毒液，混匀，moi＝6。分别在一周后对转染的t细胞进行相关检测。通过荧光显微镜检测嵌合抗原受体表达，由于gfp与car共表达，检测gfp的阳性细胞即为表达嵌合抗原受体的阳性细胞。

图3为流式细胞术检测的利用本发明构建的7×19gcc-car载体在t细胞表面上的表达情况。结果表明有28.9％的细胞是gfp(慢病毒载体本身表达gfp蛋白)阳性，说明利用本发明构建的7×19gcc-car能够在t细胞表面表达，且转染效率为28.9％。

实施例6

cfse标记car-t细胞检测细胞增殖

用cfse(购自invitrogen，usa)标记7×19car-t细胞和car-t细胞(未加免疫因子il7和ccl9的抗gcccar-t细胞)，置于5％co2、37℃培养箱中培养。分别在第3、5/7天收集细胞，用流式缓冲液洗涤细胞2次，表面染色，4℃避光30min，再洗涤2次，重悬细胞，用流式细胞仪检测细胞的数量(图4)。

图4表明，培养至第7天，表达il7和ccl19的car-t细胞，增殖能力是普通car-t细胞的两倍，因此，在car-t中加入il7和ccl19可以促进t细胞增殖，进而增强car-t细胞的杀伤能力。

实施例7

抗gcc-cart细胞杀伤性效果评估

1、体外杀伤实验

将接种100μl本发明制备7×19car-t细胞、car-t细胞和空载慢病毒感染t细胞作为效应细胞进行杀伤活性测定，靶细胞为结肠癌细胞系t84。按照效应细胞与靶细胞数量比例为5:1加入96孔培养板中置于5％co2、37℃培养箱培养24h后每孔加入20mlcck-8，继续孵育2h后，酶标仪检测450nm波长，读取od值，杀伤率＝[1-(实验组od值-效应细胞对照组od值)/靶细胞对照组od值]×100％。以空载慢病毒感染t细胞作为对照组。7×19car-t细胞对gcc表达阳性结肠癌细胞t84的杀伤效率高达95％，而car-t细胞杀伤率不足60％。因此，7×19car-t细胞特异性杀伤活性显著高于car-t细胞组和对照组，说明本发明制备的抗gcc7×19car-t细胞具有高效杀伤gcc阳性细胞的能力。

2、体内杀伤实验

选取4个月大的雄性wistar大鼠模型(购自广州中医药大学)于动物房饲养(室温23±2℃，湿度50％±10％)，将dmh用生理盐水配置成浓度为4mg/ml的溶液，用1mol/lnahco3溶液调节ph值为6.5，过滤除菌后备用。在无菌条件下，腹腔注射小鼠，每次剂量21mg/kg，每周一次，连续注射20周，获得结直肠癌小鼠。将上述结直肠癌小鼠，分为4组，a组为实施例3制备的7×19gcc-cart细胞治疗组；b组为实施例3制备gcc-cart细胞治疗组；c组为实施例3制备的未转染的t淋巴细胞治疗组；d组为生理盐水对照组。a组在7×19gcc-cart细胞培养到第14天和第16天，尾静脉注射2×10⁶细胞，b组在gcc-cart细胞培养到第14天和第16天，尾静脉注射2×10⁶细胞，c组在未转染的t淋巴细胞培养到第14天和第16天，尾静脉注射2×10⁶细胞，d组与a组、b组和c组的治疗时间相同，尾静脉注射同体积的生理盐水。治疗后持续观察一个月，分别于7d、14d、21d和28d拉颈处死，取出结直肠癌小鼠模型肿瘤组织，计算鼠模型肿瘤大小。

图4鼠模型t淋巴细胞治疗完之后肿瘤大小变化图，空白对照d组和7×19gcc-cart细胞治疗组a组、gcc-cart细胞治疗组b组相比，治疗组a和b中肿瘤大小均缩少，但治疗a组比治疗b组的肿瘤缩少明显，a组肿瘤最终几乎全部消失。因此，本发明提高的7×19gcc-cart细胞对结直肠癌细胞具有强大的杀伤作用，其杀伤效果显著优于普通的car-t细胞。

因此，本发明提供的7×19gcc-cart细胞对肿瘤具有较强的杀伤能力。

实施例8

抗gcc核酸的应用，将其制备成试剂盒形式，用以治疗包括直肠癌、胃癌、食道癌在内的实体瘤，该试剂盒包括

(1)获得如上所述的稳定表达gcc-car的载体；

(2)载体稀释液；

(3)使用说明书，该说明书中包含如实施例7的方法。

应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。