本发明属于生物技术领域，具体涉及一种dna模板快速制备方法。
背景技术
聚合酶链式反应(pcr)是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊dna复制，pcr的最大特点是能将微量的dna大幅增加，在涉及pcr反应的任何领域包括医学检验、进出口检疫检验、生命及农业科学相关研究等都需要制备用于pcr反应的dna模板，而其限制步骤主要在dna模板的制备。
目前，常见的快速制备dna模板的方法有氢氧化钠溶液水煮法、sds裂解快速制备法。
氢氧化钠水煮法一般用氢氧化钠溶液在较高温水浴中处理后，要么直接加较高浓度的tris-hcl缓冲液(ph8.0)来中和碱性处理液后，不经过dna沉淀直接用于pcr；要么用tris-hcl缓冲液中和碱性后再加乙醇离心沉淀dna，再用te溶解后再用于pcr。氢氧化钠水煮法的缺点：氢氧化钠溶液水煮处理再直接加te溶液中和碱性后用于pcr，则因为dna溶液中盐分过多(特别是当碱溶液浓度较高时，需要更高浓度的缓冲液来中和，盐分浓度则更高)，影响pcr结果甚至导致无法扩增出片段；即使再加上一个步骤，即用te溶液中和碱性后再用乙醇或异丙醇沉淀，这样对pcr影响会小一些，但是原本氢氧化钠水煮后醇沉淀dna的效果并不理想，因此该方法的适用性并不广，针对一些生物样品有用而对另一些样品没用。
sds裂解快速提取法则用含有sds的裂解液，在高温水浴中处理样品细胞，经过乙醇或异丙醇沉淀离心dna把sds等对pcr有害的成分去除后，再用te溶解后用于pcr。sds裂解快速制备法的缺点：由于sds(或者其他表面活性剂)溶液加热虽然对细胞脂双层结构有破坏作用，但对细胞壁较厚的样品细胞裂解效果差，难以真正破坏细胞壁，因此sds裂解法适用范围更窄；另外，sds是蛋白质变性剂，其残留对后续pcr影响显著(sds使dna聚合酶变性失活)；而且用te作为dna保存缓冲液有其一定的弊端，由于te缓冲液中使用edta作为二价离子螯合剂为保证保存过程避免dna水解酶降解dna，但后续用于pcr时edta成分会鳌合pcr反应体系中的mg2+离子，降低了dna聚合酶活性(mg2+离子是dna聚合酶活性中心离子)。
在与生命科学相关的各个领域都非常需要dna模板快速制备技术，尽管目前有很多方法可用于dna提取制备，但是效果比较好的方法往往耗时较长、费用相对高，而简单快速的方法又往往适用范围很窄。因此亟须发展一种耗时短、成本低和适用范围广的dna模板制备技术。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种耗时短、成本低和适用范围广的dna模板快速制备方法。
本发明提供的这种dna模板快速制备方法，包括：
在样品分散液中加入koh溶液，得到混合溶液；
将混合溶液进行沸水浴处理，然后进行离心处理，去除上层清液，将沉淀物溶解，得到dna模板溶液；或者
在样品分散液中加入koh溶液，得到混合溶液；
将混合溶液进行沸水浴处理，加入tris-hcl溶液和醇类，然后进行离心处理，去除上层清液，将沉淀物溶解，得到dna模板溶液。
优选的，所述混合溶液中koh的浓度为0.05～0.5m。
更优选的，所述混合溶液中koh的浓度为0.1m。
优选的，所述醇类优选为异丙醇。
优选的，所述样品分散液为细胞培养液或把非液体样品分散在无菌水中。
优选的，所述沸水浴处理时间为5～30min。
更优选的，所述沸水浴处理时间为10～20min，水浴时间太短不能去除细胞壁和裂解细胞，导致dna释放不充分，沸水浴时间过长会增加dna在碱液中的水解量。
优选的，所述tris-hcl溶液加入到混合液中后的终浓度为0.1m～1m，醇类加入到混合液中后的最终体积浓度为30～60％，加入tris-hcl溶液和醇类后混合溶液的ph为7.0～9.5。
优选的，所述离心处理通过离心机沉淀。
优选的，所述离心处理的离心力为13000～18000×g，离心时间为2～20min。
更优选的，所述离心处理的离心力为16000×g，离心时间为10min。
优选的，所述dna模板溶液可直接用于pcr反应或置于-20℃备用。
本发明的原理：本发明提供的这种dna模板快速制备方法，通过在样品分散液中加入koh溶液后的koh终浓度达到0.05～0.5m，该浓度范围的koh和加热处理能破坏细胞壁并释放dna，然后通过离心处理就可以得到含有dna物质的沉淀物，或者加入tris-hcl溶液和异丙醇后再进行离心处理，得到的沉淀物中含有dna就更高，离心后去除上清液可将多余的koh成分去除，dna沉淀中残余的少许koh在加入无菌水溶解沉淀物时可以使溶液呈碱性(ph范围在7.5-9.0)，以保证的dna的稳定性，残余的koh在最终的dna溶液中浓度较低，作为pcr反应体系模板时用量又很少，很容易被pcr反应体系中的tris-hcl缓冲液中和；同时由于pcr反应缓冲液中往往有kcl成分，而dna溶液中的koh被中和后也是钾盐，不会影响pcr。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果：
本发明提供的这种dna模板快速制备方法，通过在样品分散液中加入的koh溶液，加热处理和离心后实现了细胞裂解和沉淀出含有dna物质的双重作用，省去了传统技术中使用低级醇(甲醇、乙醇或丙醇等)或高浓度的盐沉淀dna的步骤，dna的制备温度为100℃(沸水浴)，最终使dna制备效果更好，或者在加热处理后进一步加入tris-hcl缓冲液和醇再离心，可以得到的含更高浓度dna的沉淀物，本发明工艺简单，耗时短，成本低，制备全程只需20min左右(而试剂盒需要2h左右)，可适用于细菌、真菌、动物细胞、植物细胞等，相对目前公开的其他dna快速制备方法应用更广。
附图说明
图1为对比例1～5和本发明pbc法这六种方法分别制备15种微生物dna模板的pcr产物的凝胶电泳检测结果对比图。
图2为koh、naoh和lioh三种碱液对dna模板制备的效果图。
图3为不同koh浓度对dna模板制备的效果图。
图4为采用本发明pbc法和etna法对于s.cerevisiae和m.antarcticus不同浓度菌液的dna模板的pcr产物的凝胶电泳检测结果对比图。
图5为采用本发明pbc法、kits法和etna法对于s.cerevisiae和m.antarcticus长片段的扩增效果对比图。
图6为采用etna法、pbc法和pbc+np法对s.cerevisiae、a.niger、al.alternata、m.antarcticus、pi.pastoris(pichiapastoris)和ps.syringae(pseudomonassyringae)这6种菌进行dna模板制备方法的对比图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。
本发明具体实施方式中采用了15种微生物作为处理对象，来验证本发明dna模板快速制备方法的适用性，并与现有的dna试剂盒提取法(kits法)、etna法、naoh/t法、te/sds法和“water”水处理法等做了对比试验，具体所用生物材料如表1。
表1实施例使用的生物材料
对比例1
dna试剂盒提取法(下文简称kits)：
细菌(escherichiacoli和bacillusthuringiensis，表1中1、2号)，细菌液样品用“bacteriagenomicdnakit”(康为世纪，cat.cw0552s)提取dna；
真菌(表1中其余3～15号菌)用“真菌基因组dna快速提取试剂盒”(艾德莱生物，dn41)提取dna，用试剂盒提取的dna，最终用与原菌液相同体积的te缓冲液溶解，再用于pcr。
其中，pcr反应采用10μl反应体系：
2×gotaqgreenmastermix(promega)5μl；
上游引物0.2μl；
下游引物0.2μl；
无菌ddh2o3.6μl；
样品dna溶液1μl；
pcr反应程序：
95℃预变性3min；
95℃变性45sec；
56℃退火45sec；
72℃延伸1min；
26个循环；
72℃补充延伸5min；
pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，上样量为2μl。
其中，pcr反应过程中，细菌(表1中1、2号)用引物为：
上游引物：序列1
下游引物：序列2
pcr反应过程中，真菌(表1中3～15号)用引物为：
上游引物：序列3
下游引物：序列4
对比例2
etna法制备dna模板的步骤如下：
1)取样品分散液与etna提取液按一定比例混合形成混合反应液，使得混合反应液中naoh浓度为0.2m、乙醇浓度为61％、edta浓度为2.25mm；
2)将混合反应液用80℃处理10min，用16060×g离心力离心，弃上清，然后加入与原样品分散液等体积的dna溶解液(成分浓度为：50mmtris-hcl,0.1mmedta，1％triton-x100，0.5％tween20)使沉淀悬浮混匀，该dna悬浮
液即可用于pcr，pcr体系和反应程序同上。(参考文献：vingataraminl,frosteh.asingleprotocolforextractionofgdnafrombacteriaandyeast[j].biotechniques,2015,58(3):120-5.)
对比例3
naoh/t法制备dna模板的步骤如下：
(1)取50μl菌液12000rpm离心弃上清获得菌体或直接从培养皿中提取菌丝置于1.5ml离心管中，加50μl的50mmol/lnaoh溶液混匀，沸水浴10分钟，再加入5μl(1/10体积)的1mol/ltris-hcl(ph8.0)缓冲液，12000rpm离心10分钟，吸取上清移至新离心管中，即为naoh/t法制备的模板dna；
(2)制得dna模板溶液，然后用于pcr实验；pcr体系和反应程序同上。(参考文献：罗中钦,程琳,张茜,等.丝状真菌pcr模板dna的快速制备方法[j].生物技术通报,2015,31(9):79-83.)
对比例4
te/sds法制备dna模板的步骤如下：
(1)te/sds:10mmtris-hcl,1mmedta，0.1％sds；
取500μl菌液3000×g离心4分钟，弃上清；用500μlte/sds(固体培养的菌丝则直接取少许置于500μlte/sds中)洗涤，3000×g离心4分钟，弃上清；加20μlte/sds沸水浴2min，取上清液作为dna模板，然后用于pcr实验；pcr体系和反应程序同上。(参考文献：赖芳芳,李中圣,赵焱,等.pcr快速鉴定毕赤酵母重组子几种模板制备方法的比较[j].黑龙江畜牧兽医,2014(3):191-193.)
对比例5
“water”法制备dna模板的步骤如下：把样品细胞的水悬浮液在沸水浴中处理10min后直接用于pcr，pcr体系和反应程序同上。
实施例1
本发明提供一种dna模板快速制备方法，命名为pbc(potassiumhydroxide-boiling-centrifuge)法，包括：
(1)取3.214ml的2m氢氧化钾溶液，加入46.786ml的无菌水中，得到50ml的koh溶液(浓度为0.129m)；
将100μl的样品细胞液加入到350μl的koh溶液(浓度为0.129m)，混匀得到混合溶液(koh浓度为0.1m)；
(2)将混合溶液在沸水浴中放置15min，用13000×g的离心力离心10min，去除上层清液，加入与原样品细胞液等体积的无菌水，将所得沉淀物溶解，得到dna模板溶液，pcr体系和反应程序同上。
图1为对比例1～5和本发明pbc法这六种方法分别制备15种微生物dna模板的pcr产物的凝胶电泳检测结果，由图1可知，对于具体实施方式中的15种微生物，在上述26个循环的pcr条件下，商业dna提取试剂盒(kits)和本发明提取的dna模板都能扩增出目的带，对于15个不同种微生物来说无明显差异，个别微生物有少许差异，如对于py.vexans，pbc法比dna提取试剂盒的效果稍好。etna法提取的dna在pcr条件下，对酿酒酵母(s.cerevisiae)、黑曲霉(a.niger)和链格孢菌(al.alternata)等3种微生物无效。naoh/t法对7种微生物无效，te/sds只对酿酒酵母(s.cerevisiae)和毕赤酵母(sc.stipitis)有效而对其他13种微生物无效，“water”法对8种微生物无效。由此可见本发明pbc法的效果与商业试剂盒很相似，比其他目前报道的dna快速制备方法更高效、适用性更广。从我们选用的微生物种属可以看出，材料涉及细菌和真菌，其中细菌包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌；真菌包括3个门10个科13个种的菌类，因此具有广泛的物种代表性，证明了本发明pbc法具有广泛的适用性。pcr只进行26个循环就可扩增得到明亮的条带，说明dna模板浓度良好。
实施例2
为了比较koh、naoh和lioh的处理效果，控制混合溶液中碱浓度为0.2m，其余反应步骤和工艺条件同实施例1，etna法作为对照组，本实施例采用酿酒酵母(s.cerevisiae)、莫氏黑粉菌(m.antarcticus)和黑曲霉(a.niger)作为处理对象样品。
图2为koh、naoh和lioh三种碱液对dna模板制备的效果，由图2可知：0.2m的koh表现对三种真菌dna制备都有良好的效果；0.2m的naoh次之，只对酿酒酵母和莫氏黑粉菌有效果，而对黑曲霉无效果；而0.2m的lioh较差，只对酿酒酵母有效果(但是pcr扩增效果良好)；对照etna法的结果最差，只对m.antarcticus处理有较弱pcr扩增效果。
实施例3
为了对koh浓度进行优化，使混合反应液中koh的浓度分别为0.05m、0.1m、0.2m、0.3m、0.4m和0.5m这几个浓度，其余反应步骤和工艺条件同实施例1，etna法作为对照组，本实施例采用s.cerevisiae、m.antarcticus和a.niger作为处理对象样品。
图3为不同koh浓度对dna模板制备的效果，由图可知：对于s.cerevisiae菌来说，0.1mkoh效果最好，随后依次是0.2m、0.3m、0.4m、0.5m和0.05m；而etna法无效果；对于m.antarcticus，koh的几个浓度中也是0.1m的效果最好；在本实施例中etna法同样对m.antarcticus有效果；对于a.niger菌来说，0.1m浓度与其他浓度区别不大，而etna法对a.niger无效。另外，对于0.1mkoh处理并离心后加无菌水溶解获得最终的dna溶液，经ph测试(对超过30个处理样品的ph测试)，结果显示ph范围在7.5～9.0之间，以保证的dna的稳定性。
实施例4
由于etna法和本发明pbc法的效果较为接近，因此进一步比较这两种方法对于s.cerevisiae和m.antarcticus不同浓度菌液的处理效果，具体步骤如下：
(1)从s.cerevisiae和m.antarcticus平皿上挑取菌落，分别用ypd和yepsl液体培养基培养，30℃，180rpm恒温摇床培养过夜，待菌液浓度达到108cell/ml数量级后用于稀释成107、105、103、10等数量级浓度并用于实验(细胞浓度分析用bio-radautomatedcellcoutertc20计数)；
(2)分别采用实施例1、对比例2中的处理方法制备得到dna模板，pcr体系和反应程序同上，pcr循环数分别有26个循环、30个循环和35个循环。
图4为采用本发明pbc法和etna法对于s.cerevisiae和m.antarcticus不同浓度菌液的dna模板的pcr产物的凝胶电泳检测结果，由图4可知，提高pcr循环数可以相应提高扩增效果。在pcr循环为35时，本发明pbc法对于s.cerevisiae细胞浓度103～108均有效，对m.antarcticus浓度107～108有效；而etna法对s.cerevisiae细胞浓度103～107有效，对m.antarcticus浓度107有效；并且本发明pbc法在pcr扩增结果整体上比etna法要好。因此，与etna相比，本实施例证明了本发明pbc法对样品量的敏感性较好，并进一步证明了本发明pbc法的适用性良好。
实施例5
制备效果差的dna溶液样品往往pcr效果差，并且很难扩增长片段dna，为了比较本发明pbc法、etna法和试剂盒法(kits)在长片段上的扩增效果，包括：
1)以s.cerevisiae和m.antarcticus作为实验用菌，将制备的dna模板用于pcr反应，加入两对引物：
上游引物：序列5
下游引物：序列6
以及
上游引物：序列7
下游引物：序列8
2)两对引物扩增长约6.5kb的长片段，pcr体系同上，pcr试剂为cloneamphifipcrpremix(clontech)，程序为:
98℃预变性20sec；
95℃变性10sec；
58℃退火15sec；
68℃延伸7min；
35个循环；
72℃补充延伸10min；
图5为采用本发明pbc法、kits法和etna法对于s.cerevisiae和m.antarcticus长片段的扩增效果对比图，由图5可知，本发明pbc法和试剂盒法(kits)都能对s.cerevisiae菌的6.5kb长片段dna有很好的扩增效果，而etna法效果差，导致难以用于下一步酶切回收等实验。对于m.antarcticus菌的6.5kb长片段dna，试剂盒法(kits)扩增效果最好，本发明pbc法和etna法次之，但扩增效果均较理想(能用于下一步实验)。可见，本发明pbc法获得的dna模板同样适合扩增长片段dna。
实施例6
采用etna法、pbc法和pbc+np法对s.cerevisiae、a.niger、al.alternata、m.antarcticus、pi.pastoris和ps.syringae这6种菌进行dna模板制备方法的对比，其中pbc法：在样品分散液中加入koh溶液，进行沸水浴处理，然后进行离心处理，去除上层清液，将沉淀物溶解，得到dna模板溶液；pbc+np法：在沸水浴步骤后加入tris-hcl缓冲溶液、异丙醇(最终混合液中tris-hcl浓度为0.1m，异丙醇浓度45％)，再进行离心，其余步骤与pbc法相同。pcr及电泳实验与实施例1相同。
从实验结果看出，pbc+np法比pbc法扩增效果更好(如图6)，说明dna模板浓度有所提高。
本发明dna模板的制备方法对于动物细胞和植物细胞样品均有良好效果，由于本方法的处理过程会破坏dna双链的氢键配对结构，因此本方法最终获得的dna属于单链dna，对于仅需要单链dna的后续其他实验均适用。本发明dna模板的制备方法不仅限于上述的处理过程，以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术构思前提下所得到的改进和变换也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>中国农业科学院麻类研究所
<120>一种dna模板快速制备方法
<160>8
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>23
<212>dna
<213>人工序列()
<400>1
agactgctacgggaggcagcagt23
<210>2
<211>23
<212>dna
<213>人工序列()
<400>2
gttgcgctcgttgcgggacttaa23
<210>3
<211>19
<212>dna
<213>人工序列()
<400>3
tccgtaggtgaacctgcgg19
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>人工序列()
<400>4
tcctccgcttattgatatgc20
<210>5
<211>22
<212>dna
<213>人工序列()
<400>5
ttctacccttggaattagtggc22
<210>6
<211>23
<212>dna
<213>人工序列()
<400>6
gtgagctctgtagcatttgcaag23
<210>7
<211>23
<212>dna
<213>人工序列()
<400>7
agaacgggtagtagatgaccacc23
<210>8
<211>22
<212>dna
<213>人工序列()
<400>8
ccagatcgaggatgttgtcttc22