本发明属于生物技术领域，具体涉及一种vegf-c单克隆抗体及vegf-c蛋白检测试剂盒。
背景技术：
血管内皮生长因子c(vegf-c)属vegf/pdgf家族成员，人vegf-c基因位于染色体4q34上，编码产物为419个氨基酸残基的蛋白质，属分泌性多肽，经蛋白酶水解加工后，形成以二硫键连接的同源二聚体，分子量为46.9kd。vegf-c受体为vegfr-2，vegfr-3。vegf通过vegfr-2调节血管和淋巴管的增生，而vegfr-3表达则局限于淋巴管内皮，vegf-c为vegfr-2的结合，产生生物学效应的所需浓度远高于vegfr-c，因此，vegfr-3是淋巴管增生特异性调节因子，用vegf-c转基因鼠实验证实，vegf-c的高表达可以选择性地引起淋巴管增生[neufeldg等，fasebj，1999，13：9-22]，经研究，vegf-c表达与肿瘤淋巴管增生和转移的关系是vegf-c高表达可促进肿瘤的淋巴转移，其机理是vegf-c促进了肿瘤周围及间质的淋巴管生长以及肿瘤组织中淋巴管增生。
vegf-c是最早发现的淋巴管生长因子，与淋巴管的关系较为密切，包括对淋巴管增生的诱导及对淋巴细胞内皮进行有效的调节，而肿瘤往往最先通过淋巴管进行转移，因此，vegf-c与肿瘤转移密切相关。vegf-c在发育的胚胎中即能促进血管进行分化、生长，因此，与其他促进血管生成的因子相比，其发挥作用的时间更早。vegf-c可作用于vegfr-2和vegfr-3，诱导内皮细胞增生，尤其是微血管细胞增生。vegf-c与vegfr-3结合后，激活vegfr-3引起shc的磷酸化，导致erk1和erk2的活化，继而活化细胞骨架蛋白paxillin促进淋巴管上皮细胞的转移；同时也可激活ras/mapk信号转导通路或tnk通路，诱导淋巴管内皮细胞肌动蛋白的重组，刺激内皮细胞增生。vegf-c与受体vegfr-2结合，通过pi3k途径，激活抗体凋亡蛋白akt/pkb，上调凋亡蛋白bcl-2抑制肿瘤细胞的凋亡，从而促进肿瘤细胞的生长，在体外能刺激血管内皮细胞增生和移动，在体内能增加血管的通透性。而同一组织中，vegf-c与vegfr-3的结合力是与vegfr-2结合力的3倍，这使得vegf-c的促淋巴管生成作用成为主导，只有在一定条件下(如:高浓度、局部组织主要表达vegfr-2)才促进血管的生成。
作为特异性淋巴管内皮细胞的生长因子，vegf-c在肿瘤发生、发展的不同阶段都具有重要作用。目前的临床研究统计和试验显示，vegf-c以旁分泌和自分泌方式分别作用于血管和淋巴管内皮细胞并诱导其新生，改变淋巴管内皮的黏附特性，增加分泌细胞因子和趋化因子，促进肿瘤细胞增殖。
影响癌症临床疗效的主要原因之一是肿瘤的转移，而且，肿瘤淋巴转移发生较早。因此，探索肿瘤淋巴转移的机制，研究针对肿瘤淋巴转移过程的有效治疗方法，显得尤为重要。随着vegf-c及其受体的相继发现，研究肿瘤淋巴管生成及淋巴转移的机制已成为目前肿瘤研究的热点。虽然vegf-c介导的肿瘤淋巴管生成的具体机制尚不清楚。但通过大量的研究，已证实vegf-c的高表达与肿瘤淋巴管密度与肿瘤临床分期和腋淋巴结转移有关相关，vegf-c能促进淋巴管生成，与淋巴结转移状况密切相关，且vegf-c的阳性表达与肿瘤血行转移危险密切相关，所以监测vegf-c的表达有望成为肿瘤淋巴转移的生物标记物。
近十年来标记免疫分析技术的研究和应用发展迅速，已广泛应用于生物医学基础理论研究及临床疾病诊断各领域。用于检测血清学指标的方法主要包括放射性同位素免疫分析、酶联免疫吸附法、和化学发光免疫分析。这些方法既可以作为初筛试验也可以作为确认试验，其中化学发光法具有检测线性范围宽、检测仪器简单、操作方便等优点。
现有技术中针对肿瘤淋巴转移的生物标记物产品目前国内尚属空白，同类产品其特异性和亲和力等方面还存在进一步的提升可能，基于此，我们开发了vegf-c测定试剂盒(化学发光法)及其制备方法。
技术实现要素：
为了克服现有中的上述问题，本发明提供了一种vegf-c单克隆抗体，具有较高的亲和力，在体外具有良好的生物学活性；开发前景广阔。
一种vegf-c单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区氨基酸序列为：methisleuleuglyphepheservalalacysserleuleualaalaalaleuleuproglyproargglualaproalaalaalaalaalaphegluserglyleuaspleuseraspalagluproaspalaglyglualathralatyralaserlysaspleuglugluglnleuargservalserservalaspgluleumetthrvalleutyrproglutyrtrplysmettyrlyscysglnleuarglysglyglytrpglnhisasnarggluglnalaasnleuasnserargthrglugluthrilelysphealaalaalahistyrasnthrgluileleulysserileaspasnglutrparglysthrglncysmetproarggluvalcysileaspvalglylysglupheglyvalalathrasnthrphephelysproprocysvalservaltyrargcysglyglycyscysasnsergluglyleuglncysmetasnthrserthrsertyrleuserlysthrleuphegluilethrvalproleuserglnglyprolysprovalthrileserphealaasnhisthrsercysargcysmetserlysleuaspvaltyrargglnvalhisserileileargargserleuproalathrleuproglncysglnalaalaasnlysthrcysprothrasntyrmettrpasnasnhisilecysargcysleualaglngluaspphemetpheserseraspalaglyaspaspserthraspglyphehisaspilecysglyproasnlysgluleuaspglugluthrcysglncysvalcysargalaglyleuargproalasercysglyprohislysgluleuaspargasnsercysglncysvalcyslysasnlysleupheproserglncysglyalaasnargglupheaspgluasnthrcysglncysvalcyslysargthrcysproargasnglnproleuasnproglylyscysalacysglucysthrgluserproglnlyscysleuleulysglylyslysphehishisglnthrcyssercystyrargargprocysthrasnargglnlysalacysgluproglyphesertyrserglugluvalcysargcysvalprosertyrtrplysargproglnmetser；
轻链可变区氨基酸序列为：alahistyrasnthrgluileleulysserileaspasnglutrparglysthrglncysmetproarggluvalalaileaspvalglylysglupheglyvalalathrasnthrphephelysproprocysvalservaltyrargcysglyglycyscysasnsergluglyleuglncysmetasnthrserthrsertyrleuserlysthrleuphegluilethrvalproleuserglnglyprolysprovalthrileserphealaasnhisthrsercysargcysmetserlysleuhishishishishishis。
进一步地，本发明还提供了编码上述轻链可变区和重链可变区氨基酸序列的多核苷酸。
进一步地，本发明还提供了包含上述多核苷酸的重组dna表达载体，所述重组dna表达载体中包含编码vegf-c单克隆抗体重链可变区、轻链可变区和和抗体恒定区的dna序列。
进一步地，本发明提供了包含上述vegf-c单克隆抗体的检测试剂盒。该试剂盒制备方法是：以nunc化学发光反应板为反应支持物，将vegf-c单克隆抗体用0.5mpbs稀释至2.5ug/ml，以100ul/孔包被至化学发光空白板中，4℃下24小时后，用0.9％nacl洗板3次，加入含有1％bsa的0.5molpbs封闭，4℃下12小时后甩干。
本发明具有以下优点：
(1)本发明的vegf-c单克隆抗体，具有较高的亲和力，特异性强，在体外具有良好的生物学活性。
(2)包含有vegf-c单克隆抗体的检测试剂盒检测方法简便、准确性强、成本低。
(3)将vegfc419与vegf-c多抗建立vegf-c蛋白检测试剂盒可作为vegf/vegfr通路肿瘤靶向药物移的监测工具。
附图说明
图1是vegfc419抗体剂量-反应体系示意图。
图2是vegfc419抗体质控血清检测散点图。
具体实施方式
借助于下述具体实施方式可更好地理解本发明，然而，这些具体实施方式仅用于举例说明本发明，不应被解释为对本发明的限制。
实施例1
一、vegf-c抗原的制备：
(1)根据genbank数据库中人vegf-c(x94216.1)的序列设计一对引物，上游引物为vp：5’-ataccccgccacggaccggtcccccacccccggtcc-3’，引入xhoi酶切位点；下游引物为vp：5’-ttcatattggaaagaccacaaatgagcta-3’，引入ecori酶切位点，通过rt-pcr方法从人肝细胞中提取总rna，然后反转录成cdna，以cdna为模板，用pyrobestdna聚合酶进行vegf-c基因特异性扩增。扩增后的pcr产物进行凝胶回收，回收的vegf-c基因与ppic9k质粒分别进行xhoi和ecori酶切，t4连接酶连接回收后的目的片段，连接产物转化dh5α感受态细胞，通过氨苄(1mg/ml)抗体筛选出阳性克隆，体取质粒并经酶切和测序鉴定。
(2)ppic9k-vegf-c表达载体经stui线性化、电转化至感受态的毕赤酵母gs115(his4)，涂布含g418的md平板筛选高拷贝的转化子，待菌落长出，挑选单克隆菌株进行pcr鉴定，将pcr结果为阳性的克隆以质粒ppic9-kal/gs115(his4)转化至毕赤酵母细胞，在7.5l培养罐内高密度细胞3e3发酵，以1％-2％的甲醛诱导表达vegf-c。发酵上清液经phenylsephadexg-25凝胶过滤层析，heparinsepharoseff肝素亲和层析，sephacryls-100凝胶过滤层析，得到充足人vegf-c蛋白，表达水平为50mg/l，进行sds-page电泳鉴定，纯化后的vegf-c蛋白纯度98％。
二、vegf-c多抗的制备及标记
(1)用雄性新西兰白兔作为免疫动物，先用10mg卡介苗注射刺激动物，一周后开始免疫。使用vegf-c蛋白作为免疫原；免疫模式采用足下注射及背部4-6点皮下注射，免疫佐剂使用弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂，分四次免疫动物，每次取vegf-c抗原1mg将等量的弗氏完全佐剂和抗原溶液分别吸入两个注射器内充分乳化30-60分钟后后足皮下注射，每次间隔两周。取耳静脉血检测效价，clia达到1:50000进行劲动脉放血，离心取血清。利用deae离子交换纯化，所得抗体溶液达98％以上。
(2)vegf-c多抗用0.5molpbsph7.5稀释1mg/ml，配置ez-linktmsulfo-nhs-lc-lc-biotin货号21338生物素试剂10mm，标记多抗与生物素，摩尔比1:20；室温反应1小时，pd10脱盐柱过柱，收集并保存。
三、vegf-c单克隆抗体的制备
(1)小鼠免疫：培养稳定表达的3e3细胞，离心后用pbs(ph7.4)重悬，免疫3只雌性bala/c小鼠，每只balb/c小鼠皮下注射5×106细胞，连续3次，每次间隔2周，第4次免疫后7d，用clia法检测抗血清效价，取效价最高的小鼠，脾内注射1×105个细胞加强免疫，3d后取小鼠脾脏，研磨，并对脾细胞计数待用。
(2)细胞融合与抗体制备：取脾细胞与骨髓细胞sp2/0按细胞计数6:1的比例融合，peg1200诱导，融合后加到铺好的饲养层的96孔板培养一周后用hat培养基半量换液，clia方法筛选阳性细胞株。用间接clia法筛选阳性杂交瘤细胞株。经3次有效稀释法克隆化后，选择i株vegf-cab持续分泌阳性率98％以上的杂交瘤细胞6h2并扩大培养准备腹腔注射小鼠。接种杂交瘤细胞前i周，小鼠腹腔注射500μl液体石蜡。接种时离心收集杂交瘤细胞，用不完全培养液悬浮并混匀，将细胞数调至1×109/l，每只小鼠腹腔注射500μl，1周后小鼠腹部明显肿胀，消毒下腹部皮肤后，抽取腹水，所得腹水3000r/min，收集上清。
(3)选用ge公司proteing纯化柱纯化腹水；用20mmpb缓冲液平衡纯化柱，加入腹水上样，用ph2.70.1mol甘氨酸盐酸缓冲液进行洗脱，用含有ph8.71moltris缓冲液的ep管收集，0.05mmpb透析，浓缩冻存。
四、单克隆抗体应用筛选
(1)包被前述方法制备好的单克隆抗体，以0.5mpbs稀释抗体至1-5ug/ml。100ul每孔包被至化学发光空白板中，4℃过夜后，0.9％nacl洗3次，加入含有1％bsa每孔150ul封闭，4℃过夜后甩干备用。
(2)筛选最优单抗：稀释制备的抗原按比例稀释8个梯度(0、10、50、100、200、400、1000、2000pg/m)，依次加入前述制备好的化学发光板中，每孔50ul，再加入生物素化多抗及标记有辣根过氧化物酶的链霉亲和素，37℃温育1h，pbst洗涤5次，加入化学发光底物液，避光反应检测发光值；对比不同单抗包被化学发光板下校准品的线性相关系数r值，以vegf-c浓度为横坐标x值，rlu值为纵坐标y值。最终挑选具有良好线性，评价指标最好的单克隆抗体vegfc419，结果如下图。单抗隆抗体作为夹心法clia检测方法的评价标准应s0rlu值＜100，s5/s0(p/n)最大，30例质控血清检出率大于90％等条件。
vegfc419抗体剂量-反应体系示意图如图1所示。
vegfc419抗体质控血清检测散点图如图2所示。
五、杂交瘤中单克隆抗体基因调取与制备
(1)用trizol试剂提取5×106的杂交瘤细胞4c5的总rna，再以oligodt为引物，amv逆转录酶逆转录温度37℃15min，合成得到cdna。以合成cdna为模板，针对rna序列的引物和基因特异性引物gsp进行巢式pcr扩增，pcr的条件均为：95℃变性5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，共35个循环，最后再于72℃延伸10min。
(2)将pcr产物经1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，切取并回收目的凝胶条带，调取目的基因，连接到pgem-t载体中，ecori酶切鉴定阳性的重组质粒，进行dna序列的测定分别获得vl和vh基因序列。
vh(重链可变区序列)
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vl(轻链可变区序列)
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将获得重链和轻链可变区基因序列和抗体的恒定区一起进行密码子优化并合成，分别获得完整抗体基因的重链和轻链，将获得的轻链和重链基因分别克隆到pmd18-t表达载体中。质粒分别提取100-150ug的量，并去内毒素(＜1eu/mg)，将获得的2个质粒1:1共转染到50ml体积的悬浮的感受态tg1细胞中，转染试剂采用pei，质粒和pei的比值为1:2。转染3-7天后，收集细胞上清，sds-page检测抗体是否正确表达，proteina柱纯化，浓缩后获得合格的vegf-c抗体vegfc419，纯度大于98％。
六、vegf-c检测clia试剂盒的制备
(1)单抗包被：以nunc化学发光反应板为反应支持物，将筛选出的最优单抗vegfc419，用0.5mpbs稀释至2.5ug/ml。以100ul/孔包被至化学发光空白板中，4度24小时后，用0.9％nacl300ul/孔洗板3次，加入含有1％bsa的0.5molpbs/孔150ul封闭，4度12小时甩干备用。
(2)加样：稀释制备的vegf-c抗原按比例稀释6个梯度(0、10、50、100、200、400、800pg/m)及待测血清样本，各50ul/孔加入包被vegfc419的包被板中，50ul/孔再加入生物素化vegf-c多抗及标记有辣根过氧化物酶的链霉亲和素(0.5mpbs，1:10000稀释)，37℃温育1h，pbst洗涤5次，除去未结合的vegf多抗及链霉亲和素-辣根过氧化物酶。
(3)加入鲁米诺-过氧化物化学发光底物50ul/孔，利用tzd-cl-200s化学发光免疫分析仪检测化学发光强度(rlu)。
七、vegf-c检测试剂盒的性能
(1)vegf-c检测试剂盒的分析性能
重复性：vegf-c检测试剂盒的批内变异系数(cv)不大于10％；批间变异系数(cv)不大于15％；
分析灵敏度：试剂盒最低检出限不大于30pg/ml；
分析特异性：一定浓度特异性物质(fgf2、egf)检测结果不大于50pg/ml；
线性范围：在0-800pg/ml浓度范围内，线性相关系数r不小于0.9900。
(2)vegf-c检测试剂盒的临床性能
开展299例临床样本检测，156例正常人，143例乳腺癌淋巴转移患者。试剂盒正常参考值0-135pg/ml，试剂盒检测结果如下：
符合率及其置信区间
交叉表
计数
符合率及其置信区间
对称度量值
a.没有假定空假设。
b.使用渐近标准错误假定空假设。
一致性系数kappa(k)值为：0.980。
血管内皮生长因子c(vegf-c)化学发光检测试剂盒乳腺癌淋巴转移符合率为99％，能够对乳腺癌淋巴转移的有效临床监测。
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<110>浙江众意生物科技有限公司
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