一种单细胞测序筛选成纤维细胞标记分子的方法与流程

本发明属于生物医学领域，尤其是涉及一种利用单细胞测序筛选肿瘤成纤维细胞标记分子的方法。

背景技术：

肿瘤相关成纤维细胞（caf）是肿瘤间质中最主要的细胞成分，在肿瘤的发生和发展过程中扮演着至关重要的角色。caf可以募集内皮祖细胞到肿瘤局部促进肿瘤新生血管的生成和肿瘤的生长。这些肿瘤相关成纤维细胞除了表达vimentin这一成纤维细胞的标记物外，还特异性表达fap、-sma，但不表达ck、desmin，在形态、功能、蛋白质表达、对细胞因子的反应性及遗传学水平上，它与正常成纤维细胞（nf）存在明显差异。

肿瘤相关成纤维细胞目前是研究热点之一，很多机制尚存在争议，但是普遍认为该细胞与肿瘤的发生发展和转移侵袭有着密不可分的关系。肿瘤相关成纤维细胞能分泌趋化因子12（cxcl12）和肝细胞生长因子（hgf），前者能直接刺激肿瘤细胞进行增殖和转移，后者导致细胞外基质（ecm）的改变，进而造成体内上皮细胞增殖和发生恶性转化。除此之外，cxcl12和hgf与肿瘤分泌的血管内皮生长因子（vegf）一起影响肿瘤新生血管的生成。以此方式，肿瘤相关成纤维细胞能同时影响正常上皮细胞和肿瘤细胞的旁泌性因子来影响肿瘤的发生发展，越来越多的证据表明肿瘤基质中成纤维细胞的突变往往发生在癌症发展之前。

以肿瘤相关成纤维细胞为靶点的药物是提高肿瘤治愈率的一种新方法。正是这种固有差异为新药物的设计和治疗策略的高度选择性提供了多种独特的靶点。我们利用单细胞测序技术在肿瘤成纤维细胞的单细胞水平上对全转录组进行扩增与测序，在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控的规律，最后利用生物信息学分析技术，从mrna水平上分析寻找肿瘤成纤维细胞的特异性标记分子，为肿瘤的靶向治疗提供新的靶点。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对上述存在的科学问题，提供一种利用单细胞测序筛选肿瘤成纤维细胞标记分子的方法。

本发明的技术方案概述如下：

本发明的单细胞测序筛选肿瘤成纤维细胞标记分子的方法，包括以下步骤：

1）提取肿瘤成纤维细胞；

2）分离单细胞并进行裂解：分离单细胞，加入裂解缓冲液中进行裂解，得到细胞裂解液；

3）对样品的mrna进行逆转录得到cdna：使用美国thermofisher公司的superscript试剂盒构建逆转录体系，对上述步骤2）获得的细胞裂解液进行逆转录，得到cdna；

4）以cdna为模板进行pcr扩增，构建测序文库，进行测序：使用美国illumina公司的nexteraxt试剂盒，按照说明书对上述步骤3）得到的逆转录产物进行扩增和纯化，构建高通量测序文库；完成后将文库送交测序；

5）对测序结果进行生物信息学分析，从mrna水平上分析寻找肿瘤成纤维细胞的特异性标记分子。

优选的，以上所述步骤1）中，将从肿瘤组织中提取的成纤维细胞进行单细胞测序，利用生物信息学分析从mrna水平上寻找其特异的标记分子。

本发明的具有突出的实质性特点和显著的进步：

通过利用单细胞测序技术，为肿瘤靶向治疗寻找新的靶点提供更为全面、客观、准确的方法，为肿瘤靶向治疗寻找新的靶点提供一种新的思路和方法。

附图说明

图1为从荷瘤小鼠剥离得到的肿瘤组织。

图2为剪碎的肿瘤组织。

图3为肿瘤相关成纤维细胞显微镜下的细胞形态。

图4为利用本发明提取方法得到的肿瘤相关成纤维细胞的fap表达率。

图5为利用本发明提取方法得到的肿瘤相关成纤维细胞的免疫细胞化学染色的实验结果。

具体实施方式

下面对本发明的实施操作做详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施案例。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

1.应用自创的提取方法获得高质量的肿瘤成纤维细胞。

2.准备肿瘤成纤维细胞单细胞样品。分离单细胞并进行裂解：分离单细胞，加入裂解缓冲液中进行裂解，得到细胞裂解液。

3.对样品的mrna进行逆转录得到cdna：使用美国thermofisher公司的superscript试剂盒构建逆转录体系，对步骤3）获得的细胞裂解液进行逆转录，得到cdna。

4.以cdna为模板进行扩增，构建测序文库，进行测序，使用美国illumina公司的nexteraxt试剂盒，按照说明书对步骤4）得到的逆转录产物进行扩增和纯化，构建高通量测序文库；完成后将文库送交测序。

5.通过生物信息学分析寻找肿瘤成纤维细胞特异性的标记分子。

实施例1

本实施例选择小鼠（musmusculus）hepg2移植瘤模型为实验材料，对其肿瘤成纤维细胞进行了单细胞转录组的测序。

一.肿瘤相关成纤维细胞的提取

步骤s1）：取3只4-5周龄balb/c裸鼠，每只于右侧腋下皮下接种人肝癌hepg2细胞，待肿瘤平均体积长至约1.0×1.0×1.0cm3时，得到荷瘤小鼠。将荷瘤小鼠颈椎脱臼处死后浸泡于75%（体积百分比浓度）的乙醇水溶液中3-5min，得到消毒后的小鼠；在超净工作台内，用无菌剪刀和无菌镊子从消毒后的小鼠胸口剪开小鼠皮肤，小心剥离得到肿瘤组织。参看附图1，图为从荷瘤小鼠剥离得到的肿瘤组织。

用眼科剪稍微剪碎肿瘤组织（此时的肿瘤组织大小为0.5×0.5×0.5cm³），并在0.01mol/lpbs中浸泡（使肿瘤组织完全浸润在0.01mol/lpbs中）2min后将其取出，得到浸泡后的肿瘤组织。用眼科剪在无菌平皿上充分剪碎浸泡后的肿瘤组织（此时的肿瘤组织大小为0.2×0.2×0.2mm3），在剪碎浸泡后的肿瘤组织的过程中适时滴加0.01mol/lpbs，保持该肿瘤组织处于湿润状态，得到剪碎的肿瘤组织。附图2为用眼科剪充分剪碎肿瘤组织得到的剪碎的肿瘤组织。向上述盛有剪碎的肿瘤组织的无菌平皿中滴加胶原酶ⅰ溶液，用剪过头的1ml枪头吹散肿瘤组织，得到胶原酶ⅰ-肿瘤组织混合物。

上述方法中，所述眼科剪又称眼科手术剪、眼用手术剪，是剪切眼部软组织用的器械。所述眼科剪可为头端宽0.4毫米，尖而不锐的眼科剪；所述眼科剪也可为头端宽1.6毫米的眼科剪。

步骤：把胶原酶ⅰ-肿瘤组织混合物转移到50ml离心管中，然后将所述离心管进行如下c1）和c2）的处理，c1）和c2）交替进行3次：

c1）将盛有胶原酶ⅰ-肿瘤组织混合物的50ml离心管在震荡器上进行震荡3min，得到震荡后的胶原酶-肿瘤组织混合物；

c2）将震荡后的胶原酶-肿瘤组织混合物在37℃水浴锅中孵育2min，得到胶原酶消化后的肿瘤组织a。

将步骤c2）的胶原酶消化后的肿瘤组织a进行离心处理：

c1）将孵育后的胶原酶消化后的肿瘤组织于300g下离心6min，弃上清液；

c2）向步骤c1）的沉淀中加入20ml0.01mol/lpbs，混匀后于300g下离心6min，弃上清液；

c3）向步骤c2）的沉淀中加入20ml0.01mol/lpbs，混匀后于300g下离心6min，弃上清液，得到胶原酶消化后的肿瘤组织。

将上述胶原酶消化后的肿瘤组织铺在培养瓶中，加入dmem完全培养基，在细胞培养箱中培养两天，细胞培养箱中co2的体积百分比为6-8%，温度为35-38℃，得到组织结构松散的肿瘤组织。

步骤s3）：再在结构松散的肿瘤组织中加入胶原酶溶液进行消化，并重复步骤s2），得到经交替消化、培养后的组织结构松散的肿瘤组织。

步骤s4）：向组织结构松散的肿瘤组织中加入胰酶溶液，得到胰酶-肿瘤组织混合物，将胰酶-肿瘤组织混合物在在超净工作台上常温静置1min后，加入10ml胎牛血清fbs终止消化，倒掉胰酶肿瘤组织悬液，得到胰酶消化后贴壁的肿瘤单细胞。在胰酶消化后贴壁的肿瘤单细胞中加入dmem完全培养基进行传代培养，得到纯化后的肿瘤相关成纤维细胞。

步骤s5）：将上述肿瘤相关成纤维细胞进行培养，培养条件为：dmem完全培养基，细胞培养箱（细胞培养箱中co2的体积百分比为6-8%，温度为35-38℃），得到贴壁的肿瘤相关成纤维细胞。附图3为肿瘤相关成纤维细胞显微镜下的细胞形态。

本发明成纤维细胞的快速提取方法可应用于提取肿瘤相关成纤维细胞。所述肿瘤为实体瘤，所述实体瘤为肺癌、肝癌、肠癌、前列腺癌、胰腺癌和肺腺癌中的一种或几种。所述肿瘤具体可为在balb/c裸鼠上生长的人肝癌。

二.肿瘤相关成纤维细胞的鉴定

1.肿瘤相关成纤维细胞fap的表达水平检测

用流式细胞仪测定肿瘤相关成纤维细胞表达fap的水平。首先将肿瘤相关成纤维细胞与一抗（0.5g/1×106细胞）（abcam公司产品，货号为ab54651）在0.01mol/lpbs中22℃反应30分钟，反应结束后以0.01mol/lpbs洗三次，然后再与dylight®488标记的二抗（0.01mol/lpbs稀释，稀释比例为1/500）（abcam公司产品，货号为ab96879）在4℃反应30分钟，反应结束后以0.01mol/lpbs洗三次，上机分析，结果如附图4所示，图4中左峰是阴性对照峰，右峰是阳性结果峰，表示的是fap的表达情况；结果显示肿瘤相关成纤维细胞纯度很高，高表达fap，表达率为99.2%（即表达fap的肿瘤相关成纤维细胞占所检测肿瘤相关成纤维细胞的百分比为99.2%）。

2.肿瘤相关成纤维细胞免疫细胞化学染色实验

（1）将纯化后贴壁的肿瘤相关成纤维细胞铺板于6孔板中，用不含血清的培养基培养24小时，细胞密度可为5×105/孔。

（2）0.01mol/lpbs洗涤2遍，4%多聚甲醛固定30min。

（3）用浓度为5%的胎牛血清对非特异结合进行封闭，常温下反应30min。

（4）更换含抗fap单克隆一抗（配成浓度为1ug/ml)（abcam公司产品，货号为ab28244）的0.01mol/lpbs，4℃反应过夜。

（5）0.01mol/lpbs洗涤2遍，与alexafluor®594红色荧光标记的二抗（0.01mol/lpbs稀释，稀释比例为1/400）（abcam公司产品，货号为ab150080）在常温反应30分钟。

（6）0.01mol/lpbs洗涤2遍，染dapi（配成浓度为0.14mg/ml）3分钟，0.01mol/lpbs洗涤2遍，荧光显微镜下观察。

实验结果显示成纤维细胞特异性结合抗fap单克隆抗体后发出红色荧光。见附图5为利用本发明的提取方法得到的肿瘤相关成纤维细胞的免疫细胞化学染色的实验结果。显微镜下肿瘤相关成纤维细胞呈长梭形或星芒状，胞质丰富，嗜酸性，胞核位于胞体中央，圆形或长椭圆形，细胞呈放射状或束状排列，部分细胞排列紊乱，极性消失，有明显的交叉重叠现象。免疫细胞化学染色结果提示，成纤维细胞表面能特异性结合抗fap单克隆荧光抗体，发出红色荧光。

三.分离单细胞并进行裂解：

1）以rnasezap和无dna的溶液清理工作台及移液枪头；

2）混合以下试剂作为裂解缓冲液：

a）0.2%triton-x100溶液19μl；

b）40u/μl的rnase抑制剂1μl。

3）向0.2ml的薄壁pcr管中加入1.19μl裂解缓冲液；

4）以最小体积从步骤（2）所得的细胞中分离单细胞，体积一般为0.3μl，加入含裂解缓冲液的pcr管中。

四.对样品的mrna进行逆转录得到cdna：

1）混合以下试剂作为引物-dntp预混液：

a）dntp（10mm）10μl；

b）oligo-dt30vn引物（10μm）10μl。

2）混合以下试剂作为逆转录预混液：

a）美国thermofisher公司的superscriptiiifirst-strand缓冲液2μl；

b）美国thermofisher公司的superscriptiiireversetranscriptase溶液0.5μl；

c）rnase抑制剂（40u/μl）0.25μl；

d）dtt溶液（100mm）0.5μl；

e）甜菜碱溶液（5m）2μl；

f）氯化镁溶液（1m）0.06μl；

g）tso溶液（100μm）0.2μl；

h）ercc外源rna标准样溶液0.5μl。

3）在步骤（3）所得的含有细胞和裂解缓冲液的pcr管中加入2μl引物-dntp预混液；

4）快速涡旋震荡pcr管使溶液充分混合，在室温下以700g离心10s后立即置于冰上；

5）以72℃孵育样品3min，立即放回冰上；

6）在室温下以700g离心10s，收集pcr管底部的液体，将其置于冰上；

7）将逆转录预混液加入单细胞裂解产物中，使用移液器轻轻吹吸几次混匀样品，混匀过程中避免产生气泡；

8）在室温下以700g离心10s，收集pcr管底部的液体；

9）将含样品的pcr管置于pcr仪中，设定程序进行细胞mrna的逆转录，得到cdna第一链反应产物，逆转录程序的热循环条件表示在表1中。

表1：逆转录程序的热循环条件

五.以cdna为模板进行扩增，构建测序文库，进行测序：

1）混合以下溶液作为pcr混合液：

a）步骤（4）中得到的第一链反应产物10μl；

b）美国rochemolecularsystems公司的kapahifihotstartreadymix溶液12.5μl；

c）ispcr引物溶液（10μm）0.25μl；

d）无核酸酶水2.25μl。

2）取15μl步骤1）中的pcr混合液加入pcr管中，涡旋震荡使样品混合，在室温下以700g离心10s，收集pcr管底部的液体；

3）将含样品的pcr管置于pcr仪中，设定程序进行细胞cdna的扩增，程序的热循环条件表示在表2中；

表2：cdna扩增程序的热循环条件

4）在室温下将美国beckmancoulter公司的ampurexp磁珠放置15min，涡旋震荡混匀；

5）将25μl磁珠加入等体积步骤3）所得到的cdna扩增产物中，用移液器吹吸10次混匀，将溶液转移到96孔板中，在室温下孵育8min；

6）将96孔板在磁力架上放置5min，待溶液澄清，小心移除上清液；加入200μl的80%乙醇清洗磁珠，孵育30s后将小心移除乙醇，重复2次；

7）完全移除乙醇后，在室温下放置5min，待磁珠表面出现一道裂缝后，加入15μl的eb溶液，用移液器吹吸10次混匀；

8）移除磁力架，室温放置2min；将96孔板再放回磁力架上，放置2分钟，待溶液澄清后，吸取13μl的上清液，移到一个新的0.2ml薄壁pcr管中；

9）使用6%的page凝胶检测cdna扩增产物的片段大小分布，好的文库应该片段大小应该在500~3000bp之间，没有小于500bp的短片段，而且峰应该出现在1500~2000bp之间（图4）；

10）混合以下溶液作为标记预混液：

a）美国illumina公司的标记dna缓冲液4μl；

b）美国illumina公司的标记酶混合液1.67μl；

c）美国illumina公司的重悬缓冲液1.33μl。

11）取1μl步骤8）中得到的cdna，加入7μl步骤10）中的标记预混液，在55℃孵育10min，对cdna进行标记；

12）再加入2μl的美国illumina公司的nt缓冲液，在室温下孵育5min，完成标记反应；

13）混合以下溶液作为接头连接扩增预混液：

a）美国rochemolecularsystems公司的kapahifihotstartreadymix溶液15μl；

b）美国illumina公司的index1引物溶液2.5μl；

c）美国illumina公司的index2引物溶液2.5μl。

14）向步骤12）中得到的10μl标记产物中加入20μl步骤13）中的接头连接预混液，置于pcr仪中，设定程序进行接头的连接，程序的热循环条件表示在表3中。

表3：接头连接程序的热循环条件

15）在室温下将美国beckmancoulter公司的ampurexp磁珠放置15min，涡旋震荡混匀；

16）将24μl磁珠按照0.8：1的体积比加入步骤13）得到的30μl产物中，用移液器吹吸10次混匀，将溶液转移到96孔板中，在室温下孵育8min；

17）重复步骤6）至步骤8），纯化扩增产物；

18）使用6%的page凝胶和美国agilent公司的2100bioanalyzer检测步骤17）中获得测序文库的片段大小分布，并用美国thermofisher公司的qubit3.0荧光计测量各文库dna的浓度；

19）根据步骤18）中测得各文库的浓度及所需测序的数据量，计算最终文库混合液中各文库的摩尔比例，按比例将文库混合，使用qubit3.0荧光计测量，调整终浓度达到5nm；

20）送测序公司进行高通量测序。

选择小鼠（musmusculus）的记忆性cd8⁺t细胞为实验材料仅是为了举例，证明此方法可以成功应用于哺乳动物活化t细胞的单细胞转录组测序，但本发明同样可以应用于人类及其他哺乳动物的活化t细胞的单细胞转录组测序。

本发明并不局限于前述的具体实施方式，本发明扩展到任何本说明书中披露的新特征或新的组合，以及披露的任一新方法或过程的步骤或新的组合。