西番莲叶中多糖提取工艺及正交试验优化的制作方法

本发明涉及一种西番莲叶中多糖提取条件的优化方法，特别是涉及利用正交试验法优化西番莲叶多糖提取条件的方法。

背景技术：

西番莲(passifloraedulissims)是西番莲科(passiflraceae)西番莲属(passiflora)草质藤本植物，又名百香果。西番莲果汁具有番石榴、菠萝、香蕉、芒果、苹果、酸梅等多种水果的令人愉悦的香味，常取其果汁用于饮料、糖果等加工。据报道西番莲具有生津止渴、消除疲劳、提神醒酒、护肤养颜、减肥通便、清肺润燥、化痰止咳、滋阴补肾、防癌抗衰、安神抗焦虑、镇痛抗炎抑菌、防治心血管疾病等多种医药保健功能，因而也被誉为“果中之王”。

植物多糖的提取方法一般为沸水浴提取，建立连续变量曲面模型，通过回归方程来拟合多个响应变量和一系列变量之间的关系，考察不停试验因素级交互作用对目标响应值的影响。该方法能经济有效、快速地确定多试验因素的最佳组合条件。本研究考察了不同料液比、提取时间和提取温度对西番莲叶中多糖的影响规律，利用响应面分析法，获得西番莲叶中多糖提取的优化工艺。

技术实现要素：

本发明的目的是在单因素试验的基础上，利用正交试验法对西番莲叶中多糖提取工艺提取条件进行优化，为西番莲的综合开发利用提供参考依据。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：

步骤一：新鲜的西番莲叶片，于50℃下烘干，粉碎过20目筛。按照一定料液比，在80％的乙醇85℃冷凝回流提取3次，每次2h，分离残渣并干燥，即得脱除脂类、色素和小分子杂质的西番莲叶的粉末，备用。

步骤二：热水提取西番莲叶中多糖，采用响应面法确定西番莲叶中多糖提取的变量参数，设置三因素五水平的试验方式进行重复试验获得实验结果，计算出西番莲叶中多糖的提取率，再采用正交试验，采取三因素三水平进行分析，得到最佳提取条件：料液比1:35g/ml，提取时间100min，温度100℃为最优，提取率达3.006％。

步骤三：采用苯酚-硫酸法测定其吸光度，并计算出西番莲叶中多糖的提取率。

本发明的有益效果为：

本发明采用响应面法确定西番莲叶中多糖提取的变量参数，选取对西番莲叶中多糖提取率较为显著影响的三个因素，即料液比、提取时间和温度，在单因素试验基础上，设计三因素三水平的正交试验，进而优化出西番莲叶中多糖最佳提取工艺条件。

附图说明

图1是料液比对西番莲叶中多糖提取率的影响

图2是提取时间对西番莲叶中多糖提取率的影响

图3是提取温度对西番莲叶中多糖提取率的影响

具体实施方式

下面结合附图通过实施例对本发明的技术方案做进一步说明。

1、样品制备

将西番莲新鲜叶片烘干，粉碎，用80％的乙醇85℃冷凝回流提取3次，每次2h，分离残渣并干燥，备用。用天平称取残渣5.0g，按照一定料液比加入蒸馏水，热水提取，抽滤，滤液离心得上清液浓缩，加入4倍体积无水乙醇沉淀，4℃静置48h，4000r/min，离心15min，取沉淀干燥，得到西番莲叶中粗多糖。

2、单因素实验

改变料液比、提取时间、提取温度进行单因素实验，采用苯酚-硫酸法定量测定提取液中多糖含量，计算出西番莲叶中多糖的提取率，每次实验平行三次。

3、正交试验优化设计

根据单因素实验结果，选取多糖提取效果影响显著的料液比、提取时间、提取温度这三个因素，利用正交试验设计实验，选取料液比、提取时间和提取温度进行试验因素与水平的设定，设定结果见表1。

表1试验因素与水平设定

以料液比(a)、提取时间(b)和提取温度(c)，以多糖的提取率为响应值(y)，试验方案及结果见表2。

4、试验结果分析与优化

根据正交试验结果可知，西番莲叶多糖提取优化参数为：料液比1:35g/ml，提取时间100min，提取温度100℃。在此条件下，西番莲叶中多糖提取率为3.006％且提取率相对偏差较小，工艺条件稳定。

5、不同西番莲叶多糖浓度对dpph自由基清除能力的影响

量取配制的待测样品液2.0ml，加入2.0ml0.04mg/mldpph溶液(无水乙醇作为溶剂)，充分混匀后室温下避光反应30min，在波长517nm处测定其吸光度ai，同时测定无水乙醇(2.0ml)与dpph(2.0ml)混合液的吸光度ac，无水乙醇(2.0ml)和样品液(2.0ml)混合液的吸光度aj。

西番莲叶多糖对dpph自由基的清除作用在浓度范围内呈现一定剂量效应，且随着浓度的增大而提高，当浓度达到1.0mg/ml时，西番莲果皮多糖对dpph·的清除率为23.09％。

6、不同西番莲叶多糖浓度对羟基自由基清除能力的影响

取0.2ml的feso4-edta混合液(10mmol/l)于带塞试管中，加入0.2ml的α-脱氧核糖溶液(20mmol/l)，然后再加入0.2ml样品，并用磷酸缓冲液(0.2mol/l，ph＝7.4)定容至1.8ml，然后加入0.2ml的h2o2(10mmol/l)，40℃恒温水浴1h，加入1ml2.8％的三氯乙酸终止反应，再加入1ml1％硫代巴比妥酸，混匀之后于沸水浴中加热10min，冷却后于532nm处测光吸收值as。

西番莲叶多糖对·oh的清除能力随着浓度的增大而提高，当浓度达到1.0mg/ml时，西番莲果皮多糖清除率为31.23％。

7、不同西番莲叶多糖浓度对fe³⁺还原能力作用

量取0.5ml样品液于试管，依次加入0.5ml的1％k3fe(cn)6溶液与0.5mlpbs溶液(0.2mo1/l，ph＝6.7)，于50℃水浴反应20min后立即冷却，依次加入0.5ml10％tca溶液，0.5ml0.1％fecl3溶液和2.0ml去离子水，充分摇匀，静置10min，在波长700nm下摇匀测定其吸光度值a，以抗坏血酸作为阳性对照。

西番莲叶多糖对还原性能力清除作用在浓度范围内呈现一定剂量效应，且随着浓度的增大而提高，当浓度达到1.0mg/ml时，百香果茎多糖对还原性能力的清除率为22.70％。

技术特征：

技术总结
本发明为一种具有抗氧化活性的西番莲叶中多糖的提取方法。通过正交法优化西番莲叶多糖的提取工艺，获得西番莲叶多糖的最佳提取条件。本发明还涉及在制药中应用，尤其在制备抗氧化药物中应用，包括在清除DPPH自由基药物、羟自由基药物以及Fe3+还原能力的药物应用。本发明将西番莲叶多糖用于体外抗氧化活性试验，为西番莲叶多糖在医药领域的应用提供参考依据。

技术研发人员：李霞;胡楠;莫婉莹;石梅;崔萌佳
受保护的技术使用者：桂林理工大学
技术研发日：2018.06.29
技术公布日：2018.12.11