本发明属于医药技术领域，具体涉及一种检测磺脲类个体化用药相关基因snp位点的引物及方法。
背景技术
糖尿病是由胰岛素缺乏或生物效应降低所致的内分泌代谢疾病，其发病率逐年上升。世界卫生组织指出，2025年全世界将出现3.8亿名糖尿病患者。2012年1月9日，中国健康教育中心公布的“中国慢性病监测及糖尿病患病率为2.6％，60岁以上老年人患病率高达19.6％，全国有成年糖尿病患者9700万人，已超越印度成为全球糖尿病人数最多的国家”，给患者的身心健康及经济造成沉重的负担。磺脲类药物不仅降糖作用强，还可减少或延缓2型糖尿病慢性并发症的发生，特别是微血管并发症，被多个国内外成人2型糖尿病防治指南推荐为一线备选或二线降糖用药，可作为二甲双胍不耐受或存在禁忌症者的起始治疗或二甲双胍治疗血糖控制不佳时的联合用药之一。研究报道，对于大多数新诊断的2型糖尿病患者，磺脲类药物可使空腹血糖下降50～80mg/dl，使hbalc(糖化血红蛋白)下降1.0％～2.5％。但其临床应用仍然存在一些问题，如据某项研究报告，每年有5–7％服用磺脲类的患者发生继发性无效；一项大规模随机试验、adopt表明，单用磺脲类5年失效率(禁食血糖>180mg/dl)高达34％，而罗格列酮为15％；二甲双胍为21％；ukpds试验表明，每年约有1％服用磺脲类的患者发生严重低血糖。因此，探讨决定其个体疗效差异的基因多态性位点，是实现糖尿病精准医学的第一步，通过基因分型检测，可以更有效的指导医生进行个体化用药治疗，提高磺脲类药物的治疗水平。
磺脲类药物为促胰岛素分泌剂，主要作用机制是能紧密结合胰腺β细胞的katp通道，从而模拟完整的葡萄糖传感机制，促进胰腺β细胞的胰岛素分泌，克服肝和外周胰岛素抵抗，缓解β细胞胰岛素分泌不足。tcf7l2(转录因子7类似物2)，又名t细胞转录因子-4(tcf-4)基因位于染色体10q25，全长217kb，226bp，由14个外显子和13个内含子组成。tcf7l2可通过激活wnt信号通路，影响β细胞的存活与分泌及胰高血糖素肽1(glp-1)的分泌，导致胰岛素的分泌缺陷和不足，促使糖尿病的发生。研究报道，tcf7l2的rs7903146(c/t)位点多态性与磺脲类药物治疗效果密切相关，等位基因t是2型糖尿病患者发病危险基因，tt/ct基因型是患者发病的危险基因型。接受格列齐特磺脲类药物治疗后cc基因型患者空腹血糖(fpg)及糖化血红蛋白(hba1c)水平相对ct/tt基因型患者低，因此，通过检测tcf7l2的rs7903146位点多态性，可指导临床医生合理用药。
单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,snp)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性。目前报道的检测方法主要有：直接测序法、高分辨率熔解曲线法(hrm)、pcr-rflp法、taqman探针法、突变扩增系统(amplificationrefractorymutationsystem,arms)pcr法等。直接测序法虽是snp分析的金标准，可发现已知和未知的snp位点，但每个位点均需经pcr扩增，然后测序，成本较高，工作量大，周期长、价格贵，不适合大样本做疾病关联分析，且易发生交叉污染。taqman探针法灵敏，特异性较高，适合少量位点大量样本的分型项目；但其探针设计有一定难度，需要验证效果，且合成价格昂贵，不适合少量样本多位点分型，特别是频率偏低的位点。pcr-rflp法优点是分型技术简单，结果判定容易，位点特异性高，成本较低；其缺点是序列多态性座位中大约只有1/3的碱基涉及限制酶识别序列，遗传标记系统的个人识别能力有限，限制酶消化条件较高。hrm法可高通量检测基因的突变情况，但其所需检测仪器比普通的荧光pcr仪更为精密，对温度敏感性要求高，受仪器影响大很难普及。arms-pcr法，又称等位基因特异性扩增法，其基本原理是因为taqdna聚合酶缺少3’-5’外切酶活性，如果引物的3’端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热dna聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计3条引物，其3’端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。arms-pcr可检测dna分子上任何点突变和小的缺失，其方法可靠、不依赖于任何特殊标记，但往往反应结束后还需进行凝胶电泳，增加了pcr污染的机会，且耗时费力。因此，迫切需要开发一种高灵敏度，经济实惠、快速且结果判读准确可靠的snp检测方法，以实现对tcf7l2的rs7903146(c/t)位点的检测，指导临床医生个体化用药。
技术实现要素：
本发明的目的是解决上述问题，提供一种高灵敏度，经济实惠、快速且结果判读准确可靠的检测磺脲类个体化用药相关基因snp位点的引物及方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种检测磺脲类个体化用药相关基因snp位点的引物，其对tcf7l2基因rs7903146(c/t)位点进行检测；所述用于tcf7l2基因rs7903146(c/t)位点检测的引物序列包括：野生型上游引物、突变型上游引物及共用下游引物，具体如下所示：
seqidno.01：caattagagagctaagcactttttaggtac，
seqidno.02：agagagctaagcactttttaggtat，
seqidno.03：caagctaacactaatgaagaggaca。
检测磺脲类个体化用药相关基因snp位点的方法，包括以下步骤：
(1)糖尿病患者临床样本dna提取：按照天根血液基因组dna提取试剂盒说明书提取。将所得的dna样品用紫外分光光度计进行定量，并将其稀释到40ng/μl，用于后续实验；
(2)arms-qpcr法扩增临床样本dna：设置a组(野生型引物扩增组)及b组(突变型引物扩增组)，具体操作步骤如下：
2.1将检测所需试剂及样本置于冰上融化并轻弹混匀，将样本及试剂加入联管，并按照体积由高到低依次加入反应孔中；
2.2加样完毕后扣紧管盖，用手轻轻震荡混匀反应体系，避免产生气泡，离心；
2.3取出离心后的样品，放入荧光定量pcr仪中；
2.4设定pcr反应程序；
2.5对检测结果进行判读：根据溶解曲线确定扩增反应效果，溶解曲线只有单峰且出峰位置是目的产物退火温度tm＝90℃(tm相差范围为±2℃)，那么实验结果有效，可对数据进行判读，δct＝ctb组-cta组，当δct＞7为野生型(基因型为cc)，δct＜-7为突变型(基因型为tt)，-2＜δct＜2为杂合型(基因型为ct)。
作为优选，所述步骤(2)的检测仪器为tl988实时荧光定量pcr仪，或abi7500实时荧光定量pcr仪。
作为优选，所述步骤2.1的联管为与检测仪器相配套的八联管，所采用的酶为superrealpremixplus(sybrgreen)预混液。
本发明的有益效果在于：
本发明主要是在arms-qpcr法的基础上鉴定tcf7l2基因多态性，以此为依据为磺脲类药物的个体化用药提供指导，其成本低且特异性高；操作简单，一次加样，从pcr反应开始到结束，一直在封闭的反应体系中进行，可有效降低污染；检测时间短，从样本接收到检测完成只需3个小时左右；结果判读准确直观，一份样本的检测只需要两个pcr管反应就可以完成，根据各反应的ct差值直接确定其基因型，结果准确可靠，与一代测序结果检测对比，一致率达100％，有望在临床快速基因分型中得到广泛的应用。解决现有其它检测技术价格昂贵、操作复杂、周期长、通量低等问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明利用本发明中的引物对1号待测临床样本的tcf7l2基因rs7903146位点进行检测的结果示意图；
图2为利用本发明中的引物对2号待测临床样本的tcf7l2基因rs7903146位点进行检测的结果示意图；
图3为利用直接测序法对1号临床样本进行tcf7l2基因rs7903146位点的检测结果示意图；
图4为利用直接测序法对2号临床样本进行tcf7l2基因rs7903146位点的检测结果示意图。
具体实施方式
本发明的原理是：在arms-pcr基础上对其做了改进，针对snp序列设计的特异性引物及共用下游引物，特异性引物于3’末端第三位引入错配碱基，以此扩大特异性引物3’末端碱基与dna模版上snp位点碱基互补和不互补情况下扩增效率间的差距，从而大幅度提高检测的特异性和准确性。其次，引入了real-timepcr技术，可根据△ct值进行判读，即△ct＝突变ct-野生ct，一般情况下△ct＞7为野生型，△ct＜-7为突变型，-2＜△ct＜2为杂合型，该法相比较于其他方法，其操作简单、结果直观，检测时间短，成本低且特异性高。因此，本发明主要是在arms-qpcr法的基础上鉴定tcf7l2基因多态性，以此为依据为磺脲类药物的个体化用药提供指导。
本发明的方案为：一种用于检测磺脲类药物个体化用药相关基因snp位点的引物及方法。所述的引物可对tcf7l2基因rs7903146(c/t)位点进行检测。
所述的用于tcf7l2基因rs7903146(c/t)位点检测的引物序列包括野生型上游引物、突变型上游引物、共用下游引物，如下所示：
seqidno.01：caattagagagctaagcactttttaggtac
seqidno.02：agagagctaagcactttttaggtat
seqidno.03：caagctaacactaatgaagaggaca
如图1，是利用本发明中的引物对1号待测临床样本的tcf7l2基因rs7903146位点进行检测的结果。结果显示为c/c型，提示该患者接受磺脲类药物治疗疗效较强。
如图2，是利用本发明中的引物对2号待测临床样本的tcf7l2基因rs7903146位点进行检测的结果。结果显示为c/t型，提示该患者接受磺脲类药物治疗疗效一般。
如图3，是利用直接测序法对1号临床样本进行tcf7l2基因rs7903146位点的检测结果。反向测序结果显示单峰，为g，则基因型为cc型。
如图4，是利用直接测序法对2号临床样本进行tcf7l2基因rs7903146位点的检测结果。反向测序结果显示突变位点为双峰，为g/a，则基因型为c/t型。
本发明方法所提供的实施例为：
(1)临床样本dna提取
本实施例是从2型糖尿病患者血液中提取dna，并对其进行定量，以此作为arms-qpcr检测用模板。dna提取试剂盒为天根血液基因组dna提取试剂盒。将所得的dna样品用紫外分光光度计进行定量，并将其稀释到40ng/μl，用于后续实验。
(2)arms-qpcr法扩增临床样本dna
检测仪器可选用天隆tl988实时荧光定量pcr仪，或者abi7500实时荧光定量pcr仪，应注意与仪器对应的反应体系不同。每个样本检测过程中需设a组(野生型引物扩增组)及b组(突变型引物扩增组)，除上游引物不同外，a/b两组的反应体系应一致，并且必须在同一台仪器上同时对a/b两组进行检测，具体操作步骤如下：
2.1将检测所需试剂及样本置于冰上融化并轻弹混匀，按照表1或表2所示反应体系将样本及试剂加入8联管(需使用与仪器配套8联管)，并且应按照体积由高到低依次加入反应孔中，所用酶为天根公司的superrealpremixplus(sybrgreen)预混液；
表1arms-qpcr反应体系(限天隆tl988使用)
表2arms-qpcr反应体系(限abi7500使用)
2.2加样完毕后扣紧管盖，应注意避免磨损或弄脏管盖，用手轻轻震荡混匀反应体系，同时避免产生气泡，离心机离心30s；
2.3小心取出离心后的样品，放入荧光定量pcr仪中，操作过程中应垂直拿放8联管，避免部分样品溅到管壁或管盖上，影响反应体系及荧光信号的采集；
2.4设定pcr反应程序，具体内容如下：
表3arms-qpcr反应程序
2.5对检测结果进行判读：根据溶解曲线确定扩增反应效果，溶解曲线只有单峰且出峰位置是目的产物退火温度tm＝90℃(tm相差范围为±2℃)，那么实验结果有效，可对数据进行判读，δct＝ctb组-cta组，当δct＞7为野生型(基因型为cc)，δct＜-7为突变型(基因型为tt)，-2＜δct＜2为杂合型(基因型为ct)。
采用上述方法对56例临床样本进行tcf7l2基因rs7903146位点基因型分析，所得结果与直接测序结果100％一致。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果和显著进步：
(1)成本低，特异性强。
(2)检测时间短，从样本接收到检测完成只需3个小时左右。
(3)操作简单，一次加样，从pcr反应开始到结束，一直在封闭的反应体系中进行，可有效降低污染。
(4)结果判读准确直观，一份样本的检测只需要2个pcr管反应就可以完成，根据各反应的ct差值直接确定其基因型，结果准确可靠，与一代测序结果检测对比，一致率达100％，有望在临床快速基因分型中得到广泛的应用。解决现有其它检测技术价格昂贵、操作复杂、周期长、通量低等问题。
本发明中未做详细描述的内容均为现有技术。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。