一种丝素蛋白-明胶双交联水凝胶及其制备方法与流程

本发明涉及生物医用材料技术领域，特别涉及一种丝素蛋白-明胶双交联水凝胶及其制备方法。

背景技术：

水凝胶是一种类含水量较高的软材料，由亲水性聚合物与水结合形成的三维网络构成，与人体软组织的组分、结构极为相似，已经作为组织工程修复材料被广泛研究，其应用领域包括药物缓释、软骨、血管、肌肉以及神经等软组织修复。但目前用于组织修复的凝胶产品仍面临许多问题，包括力学强度较差、生物相容性、体内降解速率与新生组织再生速率不匹配等。

明胶是由胶原蛋白降解获得的一种亲水性天然高分子材料，其分子链上具有可供细胞粘附的rgd片段，并且其水溶液具有低温成胶，高温溶胶的温敏特性。通过利用明胶分子链上的氨基或羧基官能团进行接枝改性，可以赋予明胶多种交联机理，从而避免明胶水凝胶在体内应用时发生溶胶。通过活化明胶分子链上的羧基，使其与酪胺上的氨基进行酰胺化反应，可以获得接枝酪胺根的改性明胶。在辣根过氧化物酶与双氧水的协同作用下，改性明胶中酪胺根中的苯酚基团之间可以发生共价交联，并迅速成胶(biomaterials,30(2009)3371–3377）。但单纯的明胶水凝胶普遍存在力学性能差、体内降解时间短等问题。

丝素蛋白是从蚕丝中提取出来的天然高分子，其分子链可以自发或在外界条件促进下向β-sheet结晶构象转变，形成物理交联水凝胶。通过调控β-sheet构象转变可以获得兼具优异的力学性能和可控降解性能的水凝胶；同时，丝素蛋白分子链上含有5%的酪氨酸残基，其上的苯酚基团也可以在辣根过氧化物酶与双氧水的协同作用下发生共价交联成胶。但是目前丝素蛋白分子链上没有已知的细胞粘附位点，不利于细胞在其上的迁移、粘附和生长。

因此如何结合丝素蛋白与明胶两种天然蛋白高分子，使其兼具较好的力学性能、生物相容性以及降解性能，将有利于更好地利用这两种材料应用到组织工程修复领域。此外，如何设计一定形状的水凝胶，如空心管状水凝胶，也将有助于其拓宽在特定组织修复领域研究如血管组织、药物释放等中的应用。然而目前空心结构水凝胶的制备过程较为复杂，可能涉及到复杂模具的制备，这些因素均限制了其应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种丝素蛋白-明胶双交联水凝胶。本发明的丝素蛋白-明胶双交联水凝胶克服了明胶以及丝素蛋白水凝胶单独作为水凝胶存在的不足，并利用明胶的温敏性和双氧水渗透酶交联方式制备空心的水凝胶，包括一般测试用的丝素蛋白-明胶双交联水凝胶或管状的丝素蛋白-明胶双交联水凝胶，拓宽了其在生物医学材料中的应用范围。

本发明的目的还在于提供制备所述的一种丝素蛋白-明胶双交联水凝胶的方法。该方法首先对明胶进行酪胺根接枝改性，将改性的明胶溶于丝素蛋白溶液中，加入辣根过氧化物酶混合均匀并倒入圆柱形模具中低温凝胶化，然后浸泡在低浓度双氧水中，引发丝素蛋白与明胶分子间的共价交联，酶交联完成后浸泡于醇溶液中，促进丝素蛋白构象转变形成物理交联，再用去离子水洗涤浸泡，获得丝素蛋白-明胶双交联水凝胶；或者，酶交联完成后取出并切除两端，然后放入热水中热溶出处理，再进一步浸泡于醇溶液，促进丝素蛋白构象转变形成物理交联，进一步加强水凝胶，最终获得双交联的管状水凝胶。

本发明的目的通过如下技术方案实现。

一种丝素蛋白-明胶双交联水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

（1）制备酪胺根接枝改性的明胶

将明胶溶于2-吗啉乙磺酸生物缓冲剂中，利用羧基活化剂活化明胶分子链上的羧基，加入酪胺盐酸盐进行反应，反应结束后经透析、冻干，获得酪胺根接枝改性的明胶；

（2）制备丝素蛋白溶液

将脱胶蚕丝浸泡在于溴化锂溶液中，充分溶解，溶解完全后经去离子水透析，获得丝素蛋白溶液；

（3）热可逆丝素蛋白/酪胺改性明胶水凝胶的制备

将步骤（1）的酪胺根接枝改性的明胶溶解于步骤（2）得到的丝素蛋白溶液中，加入辣根过氧化物酶，混合均匀形成混合溶液，接着将混合溶液后倒入模具中，凝胶化，获得热可逆丝素蛋白/酪胺改性明胶水凝胶；

（4）丝素蛋白-明胶双交联水凝胶的制备

将步骤（3）得到的热可逆丝素蛋白/酪胺改性明胶水凝胶浸泡在低浓度双氧水中，引发丝素蛋白和明胶分子间的酶催化共价交联，酶交联完成后浸泡于醇溶液中，促进丝素蛋白构象转变形成物理交联，再用去离子水浸泡洗涤，获得丝素蛋白-明胶双交联水凝胶。

进一步地，步骤（1）中，所述羧基活化剂为n-羟基琥珀酰亚胺与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的混合物，其中，n-羟基琥珀酰亚胺与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为2:1。

进一步地，步骤（1）中，所述明胶和酪胺盐酸盐的质量比为2:1。

进一步地，步骤（1）中，所述反应是在室温反应12h。

进一步地，步骤（2）中，所述溴化锂溶液的浓度为9.3m。

进一步地，步骤（2）中，所述溶解的温度为60℃，充分溶解时间为4h。

进一步地，步骤（2）中，所述丝素蛋白溶液的浓度为0.01~0.05g/ml。

进一步地，步骤（3）中，所述改性明胶和丝素蛋白总质量分数为6w/v%~10w/v%。

进一步地，步骤（3）中，所述辣根过氧化物酶浓度为60~240units/ml。

进一步地，步骤（3）中，所述凝胶化的温度为4~10℃。

进一步地，步骤（4）中，所述低浓度双氧水的浓度为1~10mm。

进一步地，步骤（4）中，浸泡在低浓度双氧水的时间为6~12h。

进一步地，步骤（4）中，所述醇溶液包括体积分数为50%~90%的甲醇、乙醇或丙醇的水溶液。

进一步地，步骤（4）中，浸泡于醇溶液中的时间为0.5~12h。

进一步地，步骤（4）中，将步骤（3）中的热可逆丝素蛋白/酪胺改性明胶水凝胶浸泡在低浓度双氧水后，取出切除其两端，并浸泡在温水中进行热溶出，充分溶出后浸泡于醇溶液中，引发丝素蛋白物理交联，再用去离子水浸泡洗涤，获得管状丝素蛋白-明胶双交联水凝胶。

更进一步地，所述低浓度双氧水的浓度为1~10mm。

更进一步地，浸泡在低浓度双氧水的时间为30s~6h，优选为30s~1h。

更进一步地，所述热溶出是在温度30~50℃热溶出5~30min。

更进一步地，所述醇溶液包括体积分数为50%~90%的甲醇、乙醇或丙醇的水溶液。

更进一步地，浸泡于醇溶液中的时间为0.5~12h。

由上述任一项所述的制备方法制得的一种丝素蛋白-明胶双交联水凝胶。

本发明制备管状丝素蛋白-明胶双交联水凝胶的原理为：

酪胺根接枝改性的明胶与丝素蛋白在辣根过氧化物酶与双氧水协同作用下可以发生交联，将辣根过氧化物酶与明胶、丝素混合均匀后，低温形成热可逆丝素蛋白-明胶水凝胶，随后将其浸泡在双氧水中，通过双氧水小分子的渗透，由内而外的引发酶催化交联。浸泡在双氧水后，切除部分酶交联水凝胶的两端，将未交联的部分通过简单地热溶出除去，将获得中空管状酶交联丝素蛋白-明胶水凝胶并进一步浸泡醇溶液，促进丝素蛋白形成物理交联，获得力学性能加强的管状丝素蛋白-明胶双交联水凝胶。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

（1）本发明制备方法所用材料为明胶和丝素蛋白两种天然可再生高分子，其来源广泛易获取。

（2）本发明制备方法的制备过程简单易操作，简单易行，不需要复杂的模具或者磨具，制备条件也很温和，有利于大规模工业化生产。

（3）本发明的双交联丝素蛋白-明胶复合水凝胶相对于单独的明胶或丝素蛋白水凝胶，具有更强的力学性能，兼具了两者的优点，弥补了单纯明胶或丝素蛋白水凝胶存在的缺陷，形成生物相容性和力学性能优异的水凝胶，在组织工程血管化领域具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为实施例1中未改性的明胶与酪胺根接枝改性的明胶的核磁氢谱图；

图2为实施例1、2、3中不同丝素蛋白固含量的丝素蛋白/明胶双交联水凝胶的压缩模量柱状图；

图3为实施例4中制备的管径1mm的管状水凝胶冻干后的扫描电镜图；

图4为小鼠间充质干细胞在实施例4的管状水凝胶上粘附生长的激光共聚焦图。

具体实施方式

以下结合具体实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细的描述，但本发明的保护范围及实施方式不限于此。

实施例1

丝素蛋白-明胶双交联水凝胶的制备

（1）将10g明胶在50℃下完全溶于5mm2-吗啉乙磺酸生物缓冲剂中，待溶液冷却至室温后加入5g酪胺盐酸盐，完全溶解后依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.3675g和n-羟基琥珀酰亚胺0.1103g，室温下搅拌反应12h，反应结束后经截留分子量10000透析袋透析4天，-50℃冷冻干燥，获得酪胺改性明胶；

未改性的明胶与酪胺根接枝改性的明胶的核磁氢谱图如图1所示，改性明胶在化学位移6.6~7.1范围出现的吸收峰表示酪胺根上苯酚基团上的氢原子，由此可知改性的明胶成功接枝上了可供酶交联反应的酪胺根基团。

（2）将4g脱胶蚕丝浸泡于20ml浓度为9.3m溴化溶液中，于60℃下溶解4h；溶解完全后经截留分子量3500透析袋透析两天，获得浓度为6w/v%的丝素蛋白溶液，用去离子水稀释至浓度为1w/v%；

（3）将0.5g改性明胶溶解于5ml浓度为1w/v%的丝素蛋白溶液中，充分溶解后加入50μl浓度为6000u/ml过氧化物酶浓溶液，混合均匀，使得最终酶浓度为60u/ml；接着将混合溶液后倒入圆柱形容器中，置于4℃下6h凝胶化，获得热可逆的丝素蛋白/明胶水凝胶；

（4）将步骤（3）中的热可逆丝素蛋白/明胶热可逆水凝胶浸泡在5mm双氧水中6h，酶交联完成后浸泡70%乙醇溶液12h；然后用去离子水浸泡12h脱去乙醇，获得固含量为6%的丝素蛋白/明胶双交联水凝胶。

获得的固含量为6%的丝素蛋白/明胶双交联水凝胶的压缩模量柱状图如图2所示，由图2可知，本实施例的酶交联丝素蛋白/明胶水凝胶经醇溶液浸泡后获得的双交联水凝胶力学强度大幅提升，未经醇溶液浸泡的酶交联水凝胶强度约为60kpa，而双交联的水凝胶压缩强度约为100kpa，约为前者的1.7倍。

实施例2

丝素蛋白-明胶双交联水凝胶的制备

（1）将10g明胶在50℃下完全溶于5mm2-吗啉乙磺酸生物缓冲剂中，待溶液冷却至室温后加入5g酪胺盐酸盐，完全溶解后依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.3675g和n-羟基琥珀酰亚胺0.1103g，室温下搅拌反应12h，反应结束后经截留分子量10000透析袋透析4天，-50℃冷冻干燥获得酪胺改性明胶；

未改性的明胶与酪胺根接枝改性的明胶的核磁氢谱图参见图1所示，改性明胶在化学位移6.6~7.1范围出现的吸收峰表示酪胺根上苯酚基团上的氢原子，由此可知改性的明胶成功接枝上了可供酶交联反应的酪胺根基团。

（2）将4g脱胶蚕丝浸泡于20ml浓度为9.3m溴化溶液中，于60℃下溶解4h；溶解完全后经截留分子量3500透析袋透析两天，获得浓度为6w/v%的丝素蛋白溶液，用去离子水稀释至浓度为3w/v%；

（3）将0.5g改性明胶溶解于5ml浓度为3w/v%的丝素蛋白溶液中，充分溶解后加入50μl浓度为1,2000u/ml过氧化物酶浓溶液，混合均匀，使得最终酶浓度为120u/ml；接着将混合溶液后倒入圆柱形容器中，置于4℃下6h凝胶化，获得热可逆的丝素蛋白/明胶水凝胶；

（4）将步骤（3）中的热可逆丝素蛋白/明胶热可逆水凝胶浸泡在5mm双氧水中6h，酶交联完成后浸泡70%乙醇溶液12h；然后用去离子水浸泡12h脱去乙醇，获得固含量为8%的丝素蛋白/明胶双交联水凝胶。

获得的固含量为8%的丝素蛋白/明胶双交联水凝胶的压缩模量柱状图如图2所示，由图2可知，本实施例的酶交联丝素蛋白/明胶水凝胶经醇溶液浸泡后获得的双交联水凝胶力学强度大幅提升，未经醇溶液浸泡的酶交联水凝胶强度约为95kpa，而双交联的水凝胶压缩强度约为330kpa，约为前者的3.5倍。

实施例3

丝素蛋白-明胶双交联水凝胶的制备

（1）将10g明胶在50℃下完全溶于5mm2-吗啉乙磺酸生物缓冲剂中，待溶液冷却至室温后加入5g酪胺盐酸盐，完全溶解后依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.3675g和n-羟基琥珀酰亚胺0.1103g，室温下搅拌反应12h，反应结束后经截留分子量10000透析袋透析4天，-50℃冷冻干燥获得酪胺改性明胶；

未改性的明胶与酪胺根接枝改性的明胶的核磁氢谱图参见图1所示，改性明胶在化学位移6.6~7.1范围出现的吸收峰表示酪胺根上苯酚基团上的氢原子，由此可知改性的明胶成功接枝上了可供酶交联反应的酪胺根基团。

（2）将4g脱胶蚕丝浸泡于20ml浓度为9.3m溴化溶液中，于60℃下溶解4h；溶解完全后经截留分子量3500透析袋透析两天，获得浓度为6w/v%的丝素蛋白溶液，用去离子水稀释至浓度为5w/v%；

（3）将0.5g改性明胶溶解于5ml浓度为5w/v%的丝素蛋白溶液中，充分溶解后加入50μl浓度为2，4000u/ml过氧化物酶浓溶液，混合均匀，使得最终酶浓度为240u/ml；接着将混合溶液后倒入圆柱形容器中，置于4℃下6h凝胶化，获得热可逆的丝素蛋白/明胶水凝胶；

（4）将步骤（3）中的热可逆丝素蛋白/明胶热可逆水凝胶浸泡在5mm双氧水中6h，酶交联完成后浸泡70%乙醇溶液12h；然后用去离子水浸泡12h脱去乙醇，获得固含量为10%的丝素蛋白/明胶双交联水凝胶。

获得的固含量为10%的丝素蛋白/明胶双交联水凝胶的压缩模量柱状图如图2所示，由图2可知，本实施例的酶交联丝素蛋白/明胶水凝胶经醇溶液浸泡后获得的双交联水凝胶力学强度大幅提升，未经醇溶液浸泡的酶交联水凝胶强度约为135kpa，而双交联的水凝胶压缩强度约为1300kpa，约为前者的10倍。

实施例4

管状丝素蛋白-明胶双交联水凝胶的制备

（1）将10g明胶在50℃下完全溶于5mm2-吗啉乙磺酸生物缓冲剂中，待溶液冷却至室温后加入5g酪胺盐酸盐，完全溶解后依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.3675g和n-羟基琥珀酰亚胺0.1103g，室温下搅拌反应12h，反应结束后经截留分子量10000透析袋透析4天，-50℃冷冻干燥获得酪胺改性明胶；

未改性的明胶与酪胺根接枝改性的明胶的核磁氢谱图参见图1所示，改性明胶在化学位移6.6~7.1范围出现的吸收峰表示酪胺根上苯酚基团上的氢原子，由此可知改性的明胶成功接枝上了可供酶交联反应的酪胺根基团。

（2）将4g脱胶蚕丝浸泡于20ml浓度为9.3m溴化溶液中，于60℃下溶解4h；溶解完全后经截留分子量3500透析袋透析两天，获得浓度约为6w/v%的丝素蛋白溶液，用去离子水水将其稀释至浓度为5w/v%；

（3）将0.5g改性明胶溶解于5ml浓度为5w/v%的丝素蛋白溶液中，充分溶解后加入50μl浓度为6000u/ml辣根过氧化物酶浓溶液，混合均匀，使得最终酶浓度为60u/ml；接着将混合溶液后倒入直径1mm圆柱形容器中，置于4℃下6h凝胶化，获得热可逆的丝素蛋白/明胶水凝胶；

（4）将步骤（3）中热可逆的丝素蛋白浸泡在5mm双氧水中30s，然切除两端，将其放置于37℃热水中热溶出5min后，在70%乙醇溶液中浸泡12h，然后在去离子水浸泡浸泡12h除去乙醇，最终获得直径为1mm，壁厚为0.1mm的管状丝素蛋白-明胶双交联水凝胶。

在此管状丝素蛋白-明胶双交联水凝胶内腔上接种小鼠间充质干细胞，冻干后的扫描电镜和水凝胶状态的激光共聚焦图分别如图3和图4所示，且由图4可知，小鼠间充质干细胞可以在管状支架内腔上平铺生长，证明了材料良好的生物相容性。

实施例5

管状丝素蛋白-明胶双交联水凝胶的制备

（1）将10g明胶在50℃下完全溶于5mm2-吗啉乙磺酸生物缓冲剂中，待溶液冷却至室温后加入5g酪胺盐酸盐，完全溶解后依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.3675g和n-羟基琥珀酰亚胺0.1103g，室温下搅拌反应12h，反应结束后经截留分子量10000透析袋透析4天，-50℃冷冻干燥获得酪胺改性明胶；

未改性的明胶与酪胺根接枝改性的明胶的核磁氢谱图参见图1所示，改性明胶在化学位移6.6~7.1范围出现的吸收峰表示酪胺根上苯酚基团上的氢原子，由此可知改性的明胶成功接枝上了可供酶交联反应的酪胺根基团。

（2）将4g脱胶蚕丝浸泡于20ml浓度为9.3m溴化溶液中，于60℃下溶解4h；溶解完全后经截留分子量3500透析袋透析两天，获得浓度约为6w/v%的丝素蛋白溶液，用去离子水水将其稀释至浓度为5w/v%；

（3）将0.5g改性明胶溶解于5ml浓度为5w/v%的丝素蛋白溶液中，充分溶解后加入50μl浓度为1,2000u/ml辣根过氧化物酶浓溶液，混合均匀，使得最终酶浓度为120u/ml；接着将混合溶液后倒入直径为6mm的圆柱形容器中，置于4℃下6h凝胶化，获得热可逆的丝素蛋白/明胶水凝胶；

（4）将步骤（3）中热可逆的丝素蛋白浸泡在5mm双氧水中5min，然切除两端，将其放置于37℃热水中热溶出30min后，在70%乙醇溶液中浸泡12h，然后在去离子水浸泡浸泡12h除去乙醇，最终获得直径为6mm、壁厚为0.1mm的管状丝素蛋白-明胶双交联水凝胶。

实施例6

管状丝素蛋白-明胶双交联水凝胶的制备

（1）将10g明胶在50℃下完全溶于5mm2-吗啉乙磺酸生物缓冲剂中，待溶液冷却至室温后加入5g酪胺盐酸盐，完全溶解后依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.3675g和n-羟基琥珀酰亚胺0.1103g，室温下搅拌反应12h，反应结束后经截留分子量10000透析袋透析4天，-50℃冷冻干燥获得酪胺改性明胶；

未改性的明胶与酪胺根接枝改性的明胶的核磁氢谱图参见图1所示，改性明胶在化学位移6.6~7.1范围出现的吸收峰表示酪胺根上苯酚基团上的氢原子，由此可知改性的明胶成功接枝上了可供酶交联反应的酪胺根基团。

（2）将4g脱胶蚕丝浸泡于20ml浓度为9.3m溴化溶液中，于60℃下溶解4h；溶解完全后经截留分子量3500透析袋透析两天，获得浓度约为6w/v%的丝素蛋白溶液，用去离子水水将其稀释至浓度为5w/v%；

（3）将0.5g改性明胶溶解于5ml浓度为5w/v%的丝素蛋白溶液中，充分溶解后加入50μl浓度为1,2000u/ml辣根过氧化物酶浓溶液，混合均匀，使得最终酶浓度为120u/ml；接着将混合溶液后倒6mm圆柱形容器中，置于4℃下6h凝胶化，获得热可逆的丝素蛋白/明胶水凝胶；

（4）将步骤（3）中热可逆的丝素蛋白浸泡在5mm双氧水中10min，然切除两端，将其放置于37℃热水中热溶出5min后，在70%乙醇溶液中浸泡12h，然后在去离子水浸泡浸泡12h除去乙醇，最终获得直径为6mm、壁厚1mm的管状丝素蛋白-明胶双交联水凝胶。

实施例7

管状丝素蛋白-明胶双交联水凝胶的制备

（1）将10g明胶在50℃下完全溶于5mm2-吗啉乙磺酸生物缓冲剂中，待溶液冷却至室温后加入5g酪胺盐酸盐，完全溶解后依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.3675g和n-羟基琥珀酰亚胺0.1103g，室温下搅拌反应12h，反应结束后经截留分子量10000透析袋透析4天，-50℃冷冻干燥获得酪胺改性明胶；

未改性的明胶与酪胺根接枝改性的明胶的核磁氢谱图参见图1所示，改性明胶在化学位移6.6~7.1范围出现的吸收峰表示酪胺根上苯酚基团上的氢原子，由此可知改性的明胶成功接枝上了可供酶交联反应的酪胺根基团

（2）将4g脱胶蚕丝浸泡于20ml浓度为9.3m溴化溶液中，于60℃下溶解4h；溶解完全后经截留分子量3500透析袋透析两天，获得浓度约为6w/v%的丝素蛋白溶液，用去离子水水将其稀释至浓度为5w/v%；

（3）将0.5g改性明胶溶解于5ml浓度为5w/v%的丝素蛋白溶液中，充分溶解后加入50μl浓度为1,2000u/ml辣根过氧化物酶浓溶液，混合均匀，使得最终酶浓度为120u/ml；接着将混合溶液后倒6mm圆柱形容器中，置于4℃下6h凝胶化，获得热可逆的丝素蛋白/明胶水凝胶；

（4）将步骤（3）中热可逆的丝素蛋白浸泡在5mm双氧水中30min，然切除两端，将其放置于37℃热水中热溶出10min后，在70%乙醇溶液中浸泡12h，然后在去离子水浸泡浸泡12h除去乙醇，最终获得直径为6mm、壁厚约1.5mm的管杯状丝素蛋白-明胶双交联水凝胶。

实施例8

管状丝素蛋白-明胶双交联水凝胶的制备

（1）将10g明胶在50℃下完全溶于5mm2-吗啉乙磺酸生物缓冲剂中，待溶液冷却至室温后加入5g酪胺盐酸盐，完全溶解后依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.3675g和n-羟基琥珀酰亚胺0.1103g，室温下搅拌反应12h，反应结束后经截留分子量10000透析袋透析4天，-50℃冷冻干燥获得酪胺改性明胶；

未改性的明胶与酪胺根接枝改性的明胶的核磁氢谱图参见图1所示，改性明胶在化学位移6.6~7.1范围出现的吸收峰表示酪胺根上苯酚基团上的氢原子，由此可知改性的明胶成功接枝上了可供酶交联反应的酪胺根基团。

（2）将4g脱胶蚕丝浸泡于20ml浓度为9.3m溴化溶液中，于60℃下溶解4h；溶解完全后经截留分子量3500透析袋透析两天，获得浓度约为6w/v%的丝素蛋白溶液，用去离子水水将其稀释至浓度为5w/v%；

（3）将0.5g改性明胶溶解于5ml浓度为5w/v%的丝素蛋白溶液中，充分溶解后加入50μl浓度为1,2000u/ml辣根过氧化物酶浓溶液，混合均匀，使得最终酶浓度为120u/ml；接着将混合溶液后倒6mm圆柱形容器中，置于4℃下6h凝胶化，获得热可逆的丝素蛋白/明胶水凝胶；

（4）将步骤（3）中热可逆的丝素蛋白浸泡在5mm双氧水中1h，然切除两端，将其放置于37℃热水中热溶出5min后，在70%乙醇溶液中浸泡12h，然后在去离子水浸泡浸泡12h除去乙醇，最终获得直径为6mm、壁厚2mm的管杯状丝素蛋白-明胶双交联水凝胶。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。